Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato
Summary
جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو عالية السرعة.
Abstract
الزرد اليرقات تظهر كنموذج لوصف وضع وظيفة الدارات العصبية البسيطة. بسبب التسميد الخارجية، التطور السريع، والشفافية، وبشكل خاص مناسبة الزرد لنهج optogenetic للتحقيق الوظيفة العصبية الدائرة. في هذا النهج، يتم التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء في الخلايا العصبية المحددة، مما يتيح للمجرب لتنشيط أو تثبيط لهم في الإرادة، وبالتالي مساهمتها في تقييم سلوكيات معينة. تطبيق هذه الأساليب في الزرد اليرقات المفهوم بسيط ولكنه يتطلب الاستفادة المثلى من التفاصيل التقنية. نحن هنا يبرهن على وجود إجراءات التعبير عن البديل channelrhodopsin في الخلايا العصبية الحسية الجسدية اليرقات الزرد، الصور تفعيل الخلايا واحدة، وتسجيل السلوكيات الناتجة عن ذلك. من خلال إدخال بعض التعديلات على أساليب المحددة سابقا، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة للحصول الاستجابات السلوكية واحدة من الخلايا العصبية تصل تنشيطعلى الأقل 4 أيام بعد الإخصاب (DPF). على وجه التحديد، أنشأنا التحوير باستخدام الخلايا العصبية الحسية الجسدية محسن، CREST3، لدفع التعبير عن المتغير channelrhodopsin الموسومة، الشيف، tdTomato. حقن هذا التحوير في الخلية 1-مرحلة الأجنة النتائج في التعبير في الخلايا العصبية الحسية الجسدية الفسيفساء، والتي يمكن تصويرها مع المجهري متحد البؤر. تحديد الخلايا في إلقاء الضوء على هذه الحيوانات مع ضوء ليزر من DPSS نانومتر 473، يسترشد من خلال كابل من الألياف البصرية، يثير السلوكيات التي يمكن تسجيلها مع كاميرا فيديو عالية السرعة وتحليلها كميا. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة السلوكيات التي تسببها تفعيل أي الخلايا العصبية الزرد. سوف يجمع هذا النهج مع الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تكون وسيلة قوية للتحقيق في تشكيل الدوائر وظيفة.
Introduction
جعلت تطوير أساليب optogenetic لتعزيز أو تثبيط الخلايا العصبية مع استثارة موجات محددة من الضوء من الممكن دراسة وظيفة للسكان متميزة من الخلايا العصبية في الدارات العصبية السيطرة على السلوك 1، 19، 21. وغالبا ما تستخدم هذه التقنية لتفعيل مجموعات من الخلايا العصبية، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتنشيط الخلايا العصبية الفردية. اليرقات الزرد هي أكثر ملاءمة لهذه الأساليب لأنها شفافة، الجهاز العصبي يتطور بسرعة، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا بسرعة والروتينية. ومع ذلك، لا بد من التغلب على العقبات الفنية الهامة لتحقيق موثوق واحد تفعيل الخلايا العصبية.
لتحسين إجراء لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية الزرد واحد، ركزنا على الخلايا العصبية الحسية الجسدية. اليرقات الزرد كشف مجموعة متنوعة من المحفزات الحسية الجسدية باستخدام اثنين من السكان من الخلايا العصبية: مثلث التوائم الخلايا العصبية، والتي يعصب رأسه، وحية Rohon-(RB) الخلايا العصبية، وهي عصب باقي الجسم. كل الخلايا العصبية والعصب الثلاثي التوائم RB مشاريع محور عصبي الطرفية التي الفروع على نطاق واسع في الجلد للكشف عن المنبهات ومحور عصبي المركزي الذي يتصل الدوائر العصبية المصب. الحيوانات تستجيب للمس في وقت مبكر الى 21 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، مشيرا إلى أن دوائر متماسكة الحسية الجسدية شكلت 5، 18. خلال نمو اليرقات على الأقل بعض الخلايا العصبية المشبك الثلاثي التوائم وعلى RB الخلية ماوتنر لتفعيل استجابات الهروب الكلاسيكي، ولكن تراكم الأدلة تشير إلى أن هناك فئات متعددة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع أنماط مختلفة من الاتصال التي قد تثير اختلافات على سلوك الهروب 2، 4، 10 و 12 و 14 و 15 و 16 و 17. كان لدينا الدافع لتطوير هذه الطريقة لتوصيف وظيفة السلوكية لفئات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية، ولكن من حيث المبدأ يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة وظيفة الخلايا العصبية من أي تقريبا أو السكان من الخلايا العصبية في لارفال الزرد.
دوغلاس وآخرون. سبق وصفها وسيلة لتفعيل Channelrhodopsin-2-معربا عن الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع الضوء الأزرق، انتزاع السلوك هروب 3. تستخدم نهجها عنصر محسن من الجين isl1 لدفع التعبير عن ChR2-EYFP في الخلايا العصبية الحسية الجسدية. هذا التحوير، ومع ذلك، أفادت التقارير لعرض مضان ضعيفة نسبيا، وتتطلب المشاركة في حقن مراسل الثاني، UAS GFP ::، للسماح التصور من الخلايا معربا عن ChR2-EYFP. وقد استخدم هذا النهج الحصول على ردود السلوك بين 24-48 HPF، ولكن لا يمكن أبدا أن استثارة رد فعل الماضي 72 HPF. وهكذا، في حين أن هذا الأسلوب يعمل لدراسة الدوائر العصبية في مراحل اليرقات في وقت مبكر جدا (24-48 HPF)، فإنه غير كاف لوصف الدوائر العصبية واستجابات سلوكية لدى كبار السن اليرقات، عند أكثر الاستجابات السلوكية المتنوعة واضحة والدوائر العصبية هي أكثر نضجا.
سعينا إلىتحسين حساسية هذه التقنية من أجل تميز وظيفة الخلايا العصبية مجموعات سكانية فرعية RB اليرقات. لتحسين التعبير استخدمنا محسن الحسية الجسدية الخاصة (CREST3) 20 لطرد التعبير عن وبه lexa-VP16 امتداد تسلسل المشغل به lexa (4xLexAop) 11 لتضخيم التعبير عن قناة ضوء تنشيط الموسومة fluorescently. هذا التكوين تضخيم التعبير عن القناة، مما يلغي الحاجة لمشاركتها في التعبير عن مراسل الثاني والسماح لنا مباشرة لتحديد الوفرة النسبية للقناة في كل الخلايا العصبية. باستخدام تسلسل به lexa / LexAop كان ميزة إضافية تتمثل في السماح لنا لتقديم التحوير إلى خطوط مراسل الزرد التي تستخدم نظام Gal4/UAS. أدى هذا التعبير عابرة التحوير في مستويات مختلفة من التعبير، ولكن عادة ما كان قويا بما يكفي لتصور كل من جسم الخلية والتوقعات من الخلايا العصبية محواري الفردية على مدى عدة أيام. لتحسين sensitivإيتي إلى النور استخدمنا ضوء تنشيط قناة الشيف، وهو البديل channelrhodopsin يتألف من الوهم من channelopsin-1 (Chop1) وchannelopsin-2 (Chop2) مع موقع كروس في حلقة الحلزون EF 13. يتم تنشيط هذه القناة في نفس الطول الموجي ChR2، ولكنها تتطلب كثافة أقل للتنشيط ضوء، مما يجعلها أكثر حساسية من غيرها من القنوات شائعة الاستخدام، بما في ذلك ChR2. وتنصهر البروتين الشيف لبروتين فلوري الأحمر، tdTomato، مما يمكننا من فحص للتعبير البروتين دون تنشيط القناة. كمصدر الضوء، كنا الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة (DPSS) الليزر بالإضافة إلى كابل من الألياف البصرية لتقديم دقة، عالية القدرة نبض أزرق خفيف إلى منطقة محددة من اليرقات. هذا سمح لنا للتركيز ضوء الليزر على الخلايا العصبية الفردية، مما يلغي الحاجة لإيجاد الحيوانات المعدلة وراثيا نادرة معربا عن الخلايا العصبيه في قناة واحدة. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على تنشيط الخلايا العصبية RB واحدة، دون الإجابة السلوكيةق مع كاميرا الفيديو عالية السرعة، والصورة الخلايا العصبية المنشط بدقة عالية مع المجهري متحد البؤر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت لنا نهجا لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية RB واحد في الزرد الحية. لدينا أسلوب يستخدم للتعبير عن transgenesis عابرة البديل channelrhodopsin الموسومة fluorescently، الشيف، tdTomato 13، في الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحددة. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا النهج لاستخدامها في غيرها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فومي كوبو، وتود تييلي HerwigBaier (UCSF / معهد ماكس بلانك) للحصول على المشورة بشأن التجارب السلوك وDPSS الليزر إنشاؤها؛ Heesoo كيم وCERRI كيارا من ملعب البيولوجيا العصبية للمساعدة في MBL الشيف-tdTomato التجارب؛ PetronellaKettunen (جامعة غوتنبرغ ) للتعاون الأولي على التجارب optogenetic؛ BaljitKhakh، اريك هدسون، وجون مايك باكا ميليغان (UCLA) للحصول على المشورة التقنية، وروجر تسين (جامعة كاليفورنيا سان دييغو) لبناء الشيف-tdTomato. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة (5F31NS064817) NRSA لAMSP ومنحة من NSF (RIG: 0819010) لAS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
