Optogenetic tekniker har gjort det möjligt att studera bidrag specifika nervceller till beteende. Vi beskriver en metod i larver zebrafisk för att aktivera enskilda somatosensoriska neuroner som uttrycker en channelrhodopsin variant (Chef) med en diod-pumpad solid state (DPSS) laser och registrering av framkallade beteenden med en snabb videokamera.
Larv zebrafisk framträder som en modell för att beskriva utvecklingen och funktionen av enkla neurala kretsar. På grund av deras yttre befruktning, snabb utveckling, och genomskinlighet är zebrafisk särskilt väl lämpade för optogenetic metoder för att undersöka neurala kretsen funktion. I detta tillvägagångssätt, är ljuskänsliga jonkanaler uttryckt i specifika neuroner, gör det möjligt för försöksledaren att aktivera eller inhibera dem efter behag och på så sätt bedöma deras bidrag till specifika beteenden. Tillämpa dessa metoder larver zebrafisk är konceptuellt enkel men kräver optimering av tekniska detaljer. Här visar vi ett förfarande för att uttrycka en channelrhodopsin variant i larver zebrafisk somatosensoriska nervceller, foto-aktiverande enstaka celler och spela de resulterande beteenden. Genom att införa några ändringar i tidigare etablerade metoder, skulle detta tillvägagångssätt kunna användas för att framkalla beteendemässiga svar från enskilda nervceller aktiveras upptill minst 4 dagar efter befruktning (DPF). Specifikt skapade vi en transgen med en somatosensoriska neuron förstärkare, CREST3 att driva uttrycket av den märkta channelrhodopsin varianten, kock-tdTomato. Injicerar detta transgen i 1-cellstadiet embryon resulterar i mosaik expression i somatosensoriska neuroner, som kan avbildas med konfokalmikroskopi. Lysande identifierade celler i dessa djur med ljus från en 473 nm DPSS laser, styrs via en fiberoptisk kabel, framkallar beteenden som kan spelas in med en snabb videokamera och analyseras kvantitativt. Denna teknik skulle kunna anpassas för att studera beteenden som framkallas genom att aktivera någon zebrafisk neuron. Kombinera detta tillvägagångssätt med genetiska eller farmakologiska störningar kommer att bli ett effektivt sätt att undersöka kretsen bildning och funktion.
Utvecklingen av optogenetic metoder för att främja eller hämma neuronal retbarhet med definierade våglängder av ljus har gjort det möjligt att studera funktionen av olika populationer av nervceller i nervbanor kontrollerande beteende 1, 19, 21. Denna teknik används ofta för att aktivera grupper av neuroner, men den kan också användas för att aktivera enskilda neuroner. Zebrafisk larver är särskilt mottagliga för dessa metoder eftersom de är genomskinliga, utvecklar deras nervsystem snabbt och skapa transgena djur är snabb och rutin. Måste emellertid stora tekniska hinder övervinnas för att tillförlitligt uppnå enda neuron aktivering.
För att optimera ett förfarande för optogenetic aktivering av enstaka zebrafisk nervceller har vi fokuserat på somatosensoriska nervceller. Zebrafisk larver upptäcka en mängd somatosensoriska stimuli med två populationer av nervceller: trigeminala neuroner, som innerverar huvudet och Rohon-Beard (RB) neuroner, som innerverar resten av kroppen. Varje trigeminus och RB neuron projicerar en perifer axonet som filialer mycket i huden för att upptäcka stimuli och en central axon som ansluter till nedströms nervbanor. Djur reagerar röra så tidigt som 21 timmar efter befruktning (HPF), vilket tyder på att sammanhängande somatosensoriska kretsar har bildat 5, 18. Under larvutveckling åtminstone några trigeminus och RB nervceller synaps på Mauthner cellen att aktivera klassiska fly svar, men ackumulera tyder på att det finns flera klasser av somatosensoriska nervceller med olika mönster av anslutning som kan framkalla variationer på flykt beteende 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vår motivation för att utveckla denna metod var att karakterisera beteende funktionen hos olika klasser av somatosensoriska nervceller, men detta tillvägagångssätt kan i princip användas för att studera funktionen av nästan alla neuron eller population av nervceller i larval zebrafisk.
Douglass et al. Tidigare beskrivits ett förfarande för aktivering Channelrhodopsin-2-uttryckande somatosensoriska neuroner med blått ljus, framkalla flykt beteende 3. Deras metod använde ett förstärkarelement från isl1 genen för att driva expression av ChR2-EYFP i somatosensoriska neuroner. Denna transgen dock rapporterades att visa relativt svag fluorescens, vilket kräver samtidig injektion av en andra reporter, till UAS :: GFP, tillåta visualisering av celler som uttrycker ChR2-EYFP. Detta tillvägagångssätt användes för att framkalla beteende svar mellan 24-48 HPF, men kunde aldrig framkalla en reaktion förbi 72 HPF. Medan denna metod fungerar för att studera neurala kretsar i mycket tidiga larvstadier (24-48 HPF) är det otillräckligt för att karakterisera nervbanor och beteende hos i äldre larver, när olika beteendemässiga svar är uppenbara och nervbanor är mer mogen.
Vi försökteförbättra känsligheten av denna teknik för att karakterisera funktionen hos subpopulationer av larver RB neuroner. För att förbättra uttryck vi använde en somatosensoriska-specifik förstärkare (CREST3) 20 för att driva expression av LexA-VP16 och en sträcka av LexA operatorsekvenser (4xLexAop) 11 för att amplifiera expression av en fluorescent märkt ljusaktiverat kanal. Denna konfiguration förstärkt uttryck av kanalen, vilket eliminerar behovet av att samuttrycka en andra reporter och tillåter oss att direkt bestämma den relativa abundansen av kanalen i varje neuron. Använda LexA / LexAop sekvens hade den extra fördelen av att tillåta oss att införa transgenen i zebrafisk reporter linjer som använder Gal4/UAS systemet. Transient uttryck av denna transgen resulterade i varierande nivåer av expression, men var vanligtvis tillräckligt robust för att visualisera både cellkroppen och axonala projektioner av enskilda neuroner under flera dagar. För att optimera känslighet att tända vi använde ljuset aktiverade kanalen Chef, en channelrhodopsin variant bestående av en chimär av channelopsin-1 (Chop1) och channelopsin-2 (Chop2) med en crossover webbplats på helix loop EF 13. Denna kanal aktiveras vid samma våglängd som ChR2, men kräver lägre ljusintensitet för aktivering, vilket gör den mer känslig än andra vanligen använda kanaler, inklusive ChR2. Kocken proteinet sammansmält med röda fluorescerande proteinet, tdTomato, vilket gör att vi för att screena för proteinuttryck utan att aktivera kanalen. Som en ljuskälla, använde vi en diodpumpade solid-state (DPSS) laser kopplad till en fiberoptisk kabel för att leverera en exakt, kraftfull puls av blått ljus till en specifik region av larverna. Detta tillät oss att fokusera laserljus på enskilda neuroner, vilket eliminerar behovet av att finna sällsynta transgena djur som uttrycker kanalen i en enda neuron. Med hjälp av denna metod, kunde vi aktivera enskilda RB nervceller, spela beteende svars med en snabb videokamera och bild de aktiverade neuroner med hög upplösning med konfokalmikroskopi.
Vi har beskrivit ett tillvägagångssätt för optogenetic aktivering av enstaka RB nervceller i levande zebrafisk. Vår metod använder övergående transgenes att uttrycka en fluorescerande taggade channelrhodopsin variant, kock-tdTomato 13 i särskilda somatosensoriska nervceller. Denna strategi skulle lätt kunna anpassas för användning i andra larver populationer zebrafisk cell.
Med hjälp av denna metod vi framkallade konsekvent beteende hos 34 till 48 HPF larver uttrycker…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Fumi Kubo, Tod Thiele och HerwigBaier (UCSF / Max Planck-institutet) för råd om beteende experiment och DPSS laser inrättats, Heesoo Kim och Chiara Cerri från MBL neurobiologi kurs för att hjälpa till Chef-tdTomato experiment, PetronellaKettunen (Göteborgs universitet ) för första samarbete kring optogenetic experiment, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca och John Milligan (UCLA) för teknisk rådgivning, och Roger Tsien (UCSD) för kock-tdTomato konstruktion. Detta arbete stöddes av en NRSA (5F31NS064817) utmärkelse till AMSP och ett bidrag från NSF (RIG: 0.819.010) till AS.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
28.5 °C incubator | any | any | |
42 °C heat block | Any | Any | |
Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
Reagent | |||
Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
Methylene blue | Fisher | S71325 | |
Phenol red | Sigma | P4758 | |
Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
PTU | Sigma | P7629 | |
Tricaine | Sigma | A5040 | |
blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |