باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم
Summary
تحديد الخلية المانحة engraftment تحديا في نماذج الماوس زرع نخاع العظم التي تفتقر علامات واضحة المعالم phenotypical. صفنا منهجية لتحديد الخلية المانحة engraftment ذكر أنثى الفئران المتلقية في الزرع. ويمكن استخدام هذه الطريقة في جميع سلالات الفئران لدراسة وظائف HSC.
Abstract
الفئران نماذج زرع نخاع العظام توفير أداة هامة في قياس الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وظائف الجينات وتحديد / الجزيئات التي تنظم HSCs. في هذه النظم نموذج زرع، يتم تحديد وظيفة HSCs من قدرة هذه الخلايا على الفئران تدبر وإعادة المتلقي المشع قاتل. عادة، يتم قياس الخلية المانحة المساهمة / engraftment من الأجسام المضادة للبروتينات محددة من المانحين سطح الخلية باستخدام التدفق الخلوي. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعتمد بشكل كبير على نوعية وقدرة الخلية علامة لتمييز سطح المانحة الخلايا المشتقة من الخلايا المتلقية ذات المصدر، والتي قد لا تكون متاحة لجميع سلالات الفئران. النظر في خلفيات مختلفة من سلالات الفئران المعدلة وراثيا في السوق، وهذا سطح الخلية / تدفق الخلوي على أساس الطريقة لها أهمية خاصة في القيود سلالات الفئران التي تفتقر إلى علامات واضحة المعالم السطحية لخلايا منفصلة عن المانحة مسانج مشترك المستفيدة مLLS. هنا، أبلغنا تقنية PCR المستندة لتحديد الخلية المانحة engraftment / مساهمة في الفئران المتلقية الزرع. نحن زرع نخاع الذكور HSCs المانحة العظام للفئران مسانج مشترك المشع قاتل النساء. تم جمع عينات الدم المحيطي في مختلف زرع وقت آخر نقطة. تم الحصول على عينات نخاع العظم في نهاية التجارب. تم عزل الحمض النووي الجيني وتضخيم الجين كروموسوم Y محددة، Zfy1، وذلك باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي. تم حساب engraftment من الخلايا المانحة المستمدة من الذكور في الإناث الفئران المتلقية ضد منحنى القياسية مع نسبة معروفة من السلطات الوطنية المعينة ذكر مقابل أنثى. وقد استخدم Bcl2 باسم الجينات إشارة إلى تطبيع كمية DNA الكلي. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن هذا النهج يحدد بشكل موثوق المانحة engraftment الخلية ويوفر طريقة مفيدة، وإن كان بسيطا في قياس المكونة للدم إعادة خلية في الفئران نماذج زرع نخاع العظام. يمكن إجراء روتيني أسلوبنا في معظم المختبرات لأنه لا يوجدمطلوب معدات مكلفة مثل التدفق الخلوي.
Introduction
كان أول من طور نموذج الفئران العظام زرع نقي (BM) في 1960s 1. وقد تم استخدام هذا النموذج على نطاق واسع لدراسة الخلية الجذعية المكونة للدم المانحة (HSC) علم الأحياء في مجموعة الماوس المتلقي. وقد وفرت الفئران زرع نخاع العظم نموذج لنا معلومات قيمة عن وظائف HSC وتنظيمها وأمر لا غنى عنه في البحث HSC. وتستخدم خيفي زرع نخاع العظام مثل نموذج C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d أو نموذج مسانج مشترك زرع مثل C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 في العديد من المختبرات لدراسة وظيفة الجين على النشاط HSC 2، تأثير العلاج من تعاطي المخدرات على الأمراض وظيفة 3 أو زرع HSC ذات الصلة مثل الطعم ضد المضيف المرض (GVHD) 4.
ويشيع استخدام علامات سطح الخلية مثل النمط الفرداني MHC أو CD45.1 للخلايا المانحة المستمدة من خلايا المتلقي المميزة ذات المصدر. C57Bl/6J H2B، CD45.2 </suف>، BALB / C H2d وCD45.1 B6.SJL هي سلالات الفئران الأكثر شيوعا في زرع نخاع العظم لأنه يمكن المساهمة الخلية المانحة المقررة بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي CD45.1 مقابل CD45.2 أو H2B مقابل H2d. ومع ذلك، يتم أيضا سلالات أخرى كثيرة مثل FVB / 5 و NJ C3H غالبا ما تستخدم لتوليد المعدلة وراثيا وراثيا أو الفئران خروج المغلوب. قد تكون هذه الفئران backcrossed إلى خط الفطرية والمحافظة عليها في خلفية الوراثية / MHC مختلطة. في هذه الحالات، يمكن تحديد الخلية المانحة engraftment وظيفة HSC يكون من الصعب كعلامات المانحة سطح خلايا محددة قد لا تكون متاحة.
باستخدام كروموسوم Y-DNA محددة التحقيق للكشف عن الخلايا المانحة الذكور من لطخة في جنوب الجنس غير متطابقة زرع نخاع العظام كان أول من طور من قبل مجموعة الدكتور ميوا 6. ثم، تم العثور على PCR الوقت الحقيقي للY المنطقة المحدد للجنس ليكون وسيلة دقيقة ومحددة للغاية لquantitate أماهخلايا الجنين جنيه في النظام دم الأم 7. وقد تم تكييف هذا المفهوم من قبل مجموعة الدكتور Schwarzenberger لتطوير تقنية PCR في الوقت الحقيقي في نموذج الفئران زرع نخاع العظام لتحديد الخلية المانحة engraftment 8. ونحن كذلك تعديل هذه الطريقة لقياس engraftment الخلية المانحة في FVB / NJ نموذج الفأر العظام زرع نقي. حاليا تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع في مجموعتنا لدراسة دور Pim1 كيناز في علم الأحياء HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من دراستنا الحالية هو توفير تقنية PCR الجماهير القائم على تحديد الجهات المانحة engraftment خلية في نموذج تنافسية العظام زرع نخاع الفئران. تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات باستخدام RT-PCR للكشف عن الخلايا المانحة في نماذج زرع 9-10. مجموعة الدكتور Schwarzenberger في تطوير أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور تشارلز غرينبرغ لاستخدام PCR الوقت الحقيقي له الجهاز. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق سرطان MUSC هولينغ بدء التشغيل مركز هولينغ مركز السرطان ACS IRG، ASCO قهر السرطان التطوير الوظيفي مؤسسة جائزة، NIH-01A1 1K08HL 103780، والمعاهد الوطنية للصحة 3P30CA138313-01S3. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة أو وكلاء التمويل الأخرى.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
