Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей
Summary
Определение приживления донорских клеток представляет собой проблему в мышь трансплантации костного мозга модели, которые не имеют четко определенные фенотипические маркеры. Мы описали методологию количественного мужчины приживления донорских клеток у самок мышей получателей пересадки. Этот метод может быть использован во всех линий мышей для изучения HSC функций.
Abstract
Мышиной модели трансплантации костного мозга являются важным инструментом в измерении гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и определения функций генов / молекул, которые регулируют ГСК. В этих системах пересадки модели, функции ГСК определяется способность этих клеток к прижился и восстановить летально облученных мышей получателя. Как правило, клетки-донора вклада / приживления измеряется с помощью антител к донорам конкретные белки клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Однако этот метод сильно зависит от специфики и возможностей маркера поверхности клеток дифференцироваться донора клеток, полученных из получателей возник клеток, которые могут быть доступны не для всех мышей штаммами. С учетом различных особенностей, генетически модифицированные мыши штамма на рынке, это на поверхности клеток / проточной цитометрии на основе метода имеет существенные ограничения, особенно в мышь штаммы, которые не имеют четко определенных поверхностных маркеров для отдельных клеток донора из конгенных получателя сеLLS. Здесь мы сообщали, ПЦР-метод для определения донора приживления клеток / мышь вклад в пересадке реципиенту. Мы пересаживали мужчины ГСК донора костного мозга для летально облученных конгенных самок мышей. Периферической крови были собраны в разное время пересадки сообщению пунктов. Образцов костного мозга были получены в конце эксперимента. Геномной ДНК выделяли и хромосома Y конкретного гена, Zfy1, был усилен с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Приживления мужчины-донора клеток, полученных в самок мышей получатель был рассчитан на стандартную кривую с известными процент мужчин против женщин ДНК. Bcl2 был использован в качестве справочного гена для нормализации общего количества ДНК. Наши данные показывают, что такой подход надежно определяет приживления донорских клеток и предоставляет полезную, но простой метод измерения гемопоэтические клетки восстановления в мышиных моделях трансплантации костного мозга. Наш метод может быть регулярно проводится в большинстве лабораторий, потому что нетдорогостоящим оборудованием, таким как проточной цитометрии не требуется.
Introduction
Мышиного костного мозга (КМ) трансплантации модель была впервые разработана в 1960-х годах 1. Эта модель широко используется для изучения доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в биологии мыши получателя хозяина. Мышиные трансплантации костного мозга модель дала нам ценные знания о HSC функций и их регуляции и незаменим в HSC исследований. Аллогенной трансплантации костного мозга модели, как C57BL/6J H2b-Balb / C H2d или конгенных модель пересадки, как C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 используются во многих лабораториях для изучения функций генов на деятельность HSC 2, эффект медикаментозного лечения на HSC функция 3 или трансплантации заболеваний, таких как трансплантат против хозяина (РТПХ) 4.
Маркеров клеточной поверхности, такие как MHC гаплотип или CD45.1 обычно используется для различения донора клеток, полученных из получателей возник клеток. C57BL/6J H2b, CD45.2 </suр>, Balb / C H2d и B6.SJL CD45.1 являются наиболее часто используемых линий мышей в трансплантации костного мозга, поскольку вклад донорских клеток можно легко оценить с помощью проточной цитометрии измерения CD45.1 против CD45.2 или H2b против H2D. Однако, многие другие штаммы, такие как FVB / NJ 5 и C3H также часто используются для создания генетически модифицированных трансгенных мышей или нокаутом. Эти мыши может быть backcrossed к инбредной линии и поддерживается в смешанной генетической / MHC фоне. В этих случаях для определения донора приживления клеток и HSC функция может быть сложно, как донор конкретным-клеточных маркеров поверхности не могут быть недоступны.
Использование Y-хромосоме конкретного зонда ДНК для выявления доноров мужчин клеток южной пятном в секс-несоответствие трансплантация костного мозга была впервые разработана группой д-р Miwa 6. Тогда, ПЦР в реальном времени для секс-области, определяющей Y оказался точным и весьма специфический метод для количественного мале клетки плода в материнской системе крови 7. Эта концепция была адаптирована группа доктора Шварценбергер для развития ПЦР в реальном времени техника в мышиной модели трансплантации костного мозга костей, чтобы определить приживления донорских клеток 8. Мы также изменение этого метода для измерения приживления донорских клеток в FVB / NJ мыши кости модели трансплантации костного мозга. Этот метод в настоящее время широко используется в нашу группу для изучения роли PIM1 киназы в HSC биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель нашего текущего исследования заключается в предоставлении аудитории ПЦР технику количественного приживления донорских клеток в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей. Несколько исследований сообщили, используя RT-PCR для обнаружения донорских клеток в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Чарльз Гринберг для использования его реальная машина времени PCR. Эта работа поддерживается MUSC Hollings Cancer Center Запуск фонда, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO властвуй Cancer Foundation развития карьеры премии, NIH 1K08HL 103780-01A1, и NIH 3P30CA138313-01S3. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здоровья или других агентов финансирования.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
