Summary
Определение приживления донорских клеток представляет собой проблему в мышь трансплантации костного мозга модели, которые не имеют четко определенные фенотипические маркеры. Мы описали методологию количественного мужчины приживления донорских клеток у самок мышей получателей пересадки. Этот метод может быть использован во всех линий мышей для изучения HSC функций.
Abstract
Мышиной модели трансплантации костного мозга являются важным инструментом в измерении гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и определения функций генов / молекул, которые регулируют ГСК. В этих системах пересадки модели, функции ГСК определяется способность этих клеток к прижился и восстановить летально облученных мышей получателя. Как правило, клетки-донора вклада / приживления измеряется с помощью антител к донорам конкретные белки клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Однако этот метод сильно зависит от специфики и возможностей маркера поверхности клеток дифференцироваться донора клеток, полученных из получателей возник клеток, которые могут быть доступны не для всех мышей штаммами. С учетом различных особенностей, генетически модифицированные мыши штамма на рынке, это на поверхности клеток / проточной цитометрии на основе метода имеет существенные ограничения, особенно в мышь штаммы, которые не имеют четко определенных поверхностных маркеров для отдельных клеток донора из конгенных получателя сеLLS. Здесь мы сообщали, ПЦР-метод для определения донора приживления клеток / мышь вклад в пересадке реципиенту. Мы пересаживали мужчины ГСК донора костного мозга для летально облученных конгенных самок мышей. Периферической крови были собраны в разное время пересадки сообщению пунктов. Образцов костного мозга были получены в конце эксперимента. Геномной ДНК выделяли и хромосома Y конкретного гена, Zfy1, был усилен с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Приживления мужчины-донора клеток, полученных в самок мышей получатель был рассчитан на стандартную кривую с известными процент мужчин против женщин ДНК. Bcl2 был использован в качестве справочного гена для нормализации общего количества ДНК. Наши данные показывают, что такой подход надежно определяет приживления донорских клеток и предоставляет полезную, но простой метод измерения гемопоэтические клетки восстановления в мышиных моделях трансплантации костного мозга. Наш метод может быть регулярно проводится в большинстве лабораторий, потому что нетдорогостоящим оборудованием, таким как проточной цитометрии не требуется.
Introduction
Мышиного костного мозга (КМ) трансплантации модель была впервые разработана в 1960-х годах 1. Эта модель широко используется для изучения доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в биологии мыши получателя хозяина. Мышиные трансплантации костного мозга модель дала нам ценные знания о HSC функций и их регуляции и незаменим в HSC исследований. Аллогенной трансплантации костного мозга модели, как C57BL/6J H2b-Balb / C H2d или конгенных модель пересадки, как C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 используются во многих лабораториях для изучения функций генов на деятельность HSC 2, эффект медикаментозного лечения на HSC функция 3 или трансплантации заболеваний, таких как трансплантат против хозяина (РТПХ) 4.
Маркеров клеточной поверхности, такие как MHC гаплотип или CD45.1 обычно используется для различения донора клеток, полученных из получателей возник клеток. C57BL/6J H2b, CD45.2 H2d и B6.SJL CD45.1 являются наиболее часто используемых линий мышей в трансплантации костного мозга, поскольку вклад донорских клеток можно легко оценить с помощью проточной цитометрии измерения CD45.1 против CD45.2 или H2b против H2D. Однако, многие другие штаммы, такие как FVB / NJ 5 и C3H также часто используются для создания генетически модифицированных трансгенных мышей или нокаутом. Эти мыши может быть backcrossed к инбредной линии и поддерживается в смешанной генетической / MHC фоне. В этих случаях для определения донора приживления клеток и HSC функция может быть сложно, как донор конкретным-клеточных маркеров поверхности не могут быть недоступны.
Использование Y-хромосоме конкретного зонда ДНК для выявления доноров мужчин клеток южной пятном в секс-несоответствие трансплантация костного мозга была впервые разработана группой д-р Miwa 6. Тогда, ПЦР в реальном времени для секс-области, определяющей Y оказался точным и весьма специфический метод для количественного мале клетки плода в материнской системе крови 7. Эта концепция была адаптирована группа доктора Шварценбергер для развития ПЦР в реальном времени техника в мышиной модели трансплантации костного мозга костей, чтобы определить приживления донорских клеток 8. Мы также изменение этого метода для измерения приживления донорских клеток в FVB / NJ мыши кости модели трансплантации костного мозга. Этот метод в настоящее время широко используется в нашу группу для изучения роли PIM1 киназы в HSC биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеток костного мозга изоляции
- Усыпить мужчины-донора FVB / NJ мышей и самок FVB / NJ мышей с использованием CO 2 метода следует смещения шейных позвонков. Женский FVB / NJ клеток костного мозга будет использоваться в качестве конкурентного клеток.
- Используйте небольшие ножницы и пинцет, рассекают из бедра и tibiaes от мышей и разместить их в 60 мм блюдо культуры ткани содержащий 6 мл ледяного RPMI1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS. Используйте Kimwipe ткань для удаления мышц и других тканей. Отрежьте оба конца каждой кости вала в блюдо.
- Подключите конец кости с 23G иглу на шприц 3 мл, избавиться от костного мозга с RPMI1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS в блюдо. Разбивку тканей костного мозга повторяется устремлений, используя тот же иглу. Передача клеточной суспензии до 15 мл центрифужные пробирки.
- Спином вниз клетки в течение 5 мин при 400 мкг, удалить супернатант, ресуспендируют клеток в 1 мл комнатной температуре красного буфера для лизиса клеток крови (155 мм рotassium бикарбонат натрия, 10 мМ хлорид аммония, 0,1 мМ ЭДТА, рН = 7,4) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин, затем добавить 5-10 мл RPMI 1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS.
- Передайте клетки через ячейки сетчатого фильтра. Сбор потока через в новую пробирку. Спином вниз в течение 5 мин при 400 х г. Удалить супернатант, осадок клеток не должны содержать никаких красного цвета. Отсутствие красного цвета указывает на полное удаление красных кровяных клеток. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл RPMI 1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS. Аккуратно вихрь, чтобы убедиться суспензию клеток является полностью однородным. Возьмите и посчитайте аликвоты клеток в гемацитометре. Посчитайте, сколько объема клеток, необходимых для пересадки костного мозга и аликвоту достаточно клеток и смешать мужских клеток донора с конкурентом женских клеток в соотношении 5:2. Спином вниз в течение 5 мин при 400 х г, промывают PBS, ресуспендируют в PBS с конечной концентрации донорских клеток в 5 × 10 6 / мл и конкурентов клеток на 2 × 10 6
2. Конкурентные трансплантации костного мозга
- Облучения самок мышей получателя (8-12 недель возраста) с 137Cs гамма-лучи, радиатор на одной дозы 11Gy 4-6 часа до пересадки костного мозга.
- Поместите облученных самок мышей в мышей фиксатор. Inject смешанных доноров и конкурентов клетки через хвостовую вену в 0,1 мл общего объема таких, что каждая мышь получает 5 × 10 5 клеток донора и 2 × 10 5 конкурентом клеток костного мозга.
3. Сбора проб
Пары недель после трансплантации костного мозга, сбор образцов периферической крови (~ 50 мкл) из женских мыши получателя, ретроорбитального кровотечение под наркозом состоянии. Образцы собираются в EDTA покрытием труб. BM образцы могут быть собраны в конце эксперимента, как правило, не менее 4 месяцев после трансплантации, с таким же процедурам, описанным предыдущим (шаг 1), обычно 20-40%1 голени BM клеток достаточно, чтобы сделать достаточное количество ДНК. Кровь или BM образцов из соответствующей возрастной нормального женского и мужского мышей также собираются подготовить стандартной кривой.
4. Геномной ДНК изоляции
- Добавить 4 × объем комнатной температуре РБК буфера для лизиса (~ 200 мкл) каждого образца крови. Все хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мл PBS, а затем спином вниз, чтобы удалить большую часть лизированных РБК.
- Изолировать ДНК с помощью ДНК крови добычи комплект (QIAmp ДНК крови добычи комплект). Предварительно теплой элюции буфером (AE) при 37 ° С для повышения доходности Элюированную ДНК. Мужской и женский ДНК для стандартной кривой выделяют аналогично.
- (Необязательно) геномной ДНК может быть дополнительно очищенной или концентрируют с использованием этанола методом осаждения в присутствии 3 М ацетата натрия (рН = 5,5). ДНК гранулы затем суспендируют в 40-50 мкл дистиллированной воды для анализа немедленно или хранят при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.
- Измерьте ДНК концентрничество с NanoDrop ND-1000 спектров фотометр. Образцы с ОП 260/280 между 1.8-2.0 используются для дальнейшего анализа.
- Развести ДНК с ДНК-азы бесплатно H 2 O в 4ng/μl в общем объеме 50 мкл.
5. Стандартная подготовка кривой
Разбавить мужской и женской ДНК ДНК в концентрации 4 нг / мкл, и сделать смесь ДНК в соответствии с Table1
| % От мужского ДНК в Женский фон | Объем (мкл) 4ng/μl мужской ДНК | Объем (мкл) 4ng/μl ДНК женщины | Общий объем (мкл) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Таблица 1. Пробоподготовка к стандартным кривой. Нормальный мужчина и женщина FVB / NJ мышей в возрасте 8-12wks были принесены в жертву. Кровь и BM клетки были собраны. ДНК из клеток мужской и женской клетки были выделены и ресуспендировали в концентрации 4ng/μl. Мужской и женский ДНК смешивают в различных соотношениях для создания стандартных смесей ДНК образца.
6. ПЦР в реальном времени
- Установите пластину ПЦР путем смешивания SYBR Green СУПЕРМИКС реагента с грунтовки и геномной ДНК. Реакционного объема (20 мкл) содержится 400 нМ каждого праймера, 5 мкл клеток крови геномной ДНК (4ng/μl x5 мкл = 20 нг) в каждой реакции. ДНК SAMPле и стандарты были установлены в трех экземплярах. Последовательности праймеров приведены в таблице 2.
| Гена имя | Вперед | Обратный |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Таблица 2. RT-PCR праймера для мышиных Bcl2 и Zfy1.
- Выполните ПЦР-реакции с использованием Biorad iQ5 ПЦР машины при следующих условиях: 95 ° C 3 мин, 42 циклов амплификации 95 ° С в течение 10 сек, 58 ° C в течение 25 сек и 72 ° C в течение 15 секунд, после таяния кривой шагу.
- Получить порогового цикла (Ct) значения, Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition оптической системы. Расчет δCt (Ct Zfy1 </ SUP>-Ct Bcl2) значение, и Zfy1 уровень экспрессии рассчитывается как стоимость 2-δ Ct.
- Создание стандартных кривых для каждой реакции серий с использованием 2-δCt чтение из известных мужчин / женщин стандартных смесей. Стандартные кривые создаются путем построения среднего 2-δCt значение трех повторах с известными% мужчин ДНК в смеси с линейной регрессии установки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 и 2 показали примеры стандартных кривые со средними значениями 2-δCt против проценты мужской ДНК. Рис. 1А показали определенную температуру плавления Bcl2 и Zfy1 ампликонов локализован на 78,5 ° C и 88,5 ° С соответственно. Bcl2 используется в качестве справочного гена для нормализации общего количества загруженных ДНК в каждой реакции ПЦР. Bcl2 кривых усиления (Вход зрения) для каждого стандартного образца сливаются друг с другом независимо от мужчин концентрация ДНК, что свидетельствует равное количество загруженных ДНК (рис. 1б). Тем не менее, Zfy1 кривой усиления мигрировали в левый с увеличением количества мужского ДНК в образце (рис. 1С). Чтобы проверить наш метод, мы протестировали мужской приживления донорских клеток в пересаженной мышей, получавших BM клетки от WT против Pim тройной нокаутом (ТКО) мышей при различных трансплантации времени после точки. Оба периферической крови (6wks) и BM образцов (16wks) W прежде чем проанализировать. ГСК из Pim мышей TKO имеют дефекты в воссоздании летально облученных мышей (, N и соавт., Рукопись под ред.) Как и ожидалось, получатель мышей трансплантировали клетки Pim техническим нокаутом была намного ниже процент мужчин клеток по сравнению с мышами пересаживается с WT клеток (рис. 3).
Рисунок 1. (A) представитель кривой плавления из нескольких образцов с различной мужской процентов ДНК. Пик на 78,5 указывает усиление Bcl2, в то время как пик при 88,5 ° C указывает усиление Zfy-1. Представитель кривой усиления из нескольких образцов с различной мужской процент ДНК для Bcl2 (B) и Zfy1 (C), Ct: порогового цикла.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 2. RT-PCR стандартной кривой для мужчин процент ДНК. Образцы (20 нг ДНК в 20 мкл общего объема) мужской и женской ДНК смесей, полученных из клеток костного мозга были обработаны для RT-PCR, как описано в протоколе. Средние значения δCt (Ct Zfy1-Ct Bcl2) для отдельных образцов были рассчитаны и 2-δ Ct (Y-ось) был заговор против мужчин процент ДНК (оси Х) (диапазон от 0,2% до 100%) с линейной регрессии фитинга. R2 представляет собой коэффициент детерминации.
Рисунок 3. Конкурентная трансплантации костного мозга Experiments. 5 х 10 5 общего BM клетки от мужского WT или соответствующей возрастной мужской Pim тройной нокаутом (ТКО) мышам вместе с 2 х 10 5 женских клеток костного мозга конкурента были пересажены в облученных женщин хозяев. Периферической крови (PB) химеризма в 6 недель и BM химеризма в 16 недель после трансплантации оценивали процент мужчин ДНК с помощью RT-PCR, как осудили в протоколе (* р <0,05, ** P <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель нашего текущего исследования заключается в предоставлении аудитории ПЦР технику количественного приживления донорских клеток в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей. Несколько исследований сообщили, используя RT-PCR для обнаружения донорских клеток в модели трансплантации 9-10. Группа доктора Шварценбергер первый разработал мышиный трансплантации костного мозга модели с помощью ПЦР в реальном времени для усиления Y-хромосоме конкретного 8. Этот метод был использован для изучения Gli-1 функции в деятельности HSC 11. Мы тогда дальнейшее изменение протокола и представила подробный, шаг за шагом экспериментальных протоколов в визуализированы формате. Визуализируются презентация нашего протокол позволяет зрителям следовать нашему протоколу легко. Мы также сравнили наши результаты ПЦР с использованием геномной ДНК из образцов BM против ДНК из периферической крови. Донор приживления данных BM и образцы крови в основном совместимы, однако, как правило, меньше изменение было найдено в BM образцов. Этовероятно, из-за остаточного гемоглобина после лизиса в периферической крови, что может привести к нарушению чистоты / качества геномной ДНК в образцах крови.
Есть несколько преимуществ с нашей ПЦР-метод количественного приживления донорских клеток. Первое, наша техника может быть выполнена в большинстве лабораторий. Существует нет необходимости в специализированной и дорогостоящей аппаратуры, кроме реального времени-PCR машины. Мы также изменение реакции ПЦР компонентов и используются SYBR Green СУПЕРМИКС вместо Taqman. Это изменение еще больше снижает расходы и издержки, как мы устраняем флуоресцентного-меченых зондов. Во-вторых, наша техника является надежным и воспроизводимым. Мы использовали Bcl2 ссылкой гена для нормализации общего количества ДНК, в отличие от ДНК комплект количественного определения. Bcl2 гена был использован, потому что: 1) этот ген расположен не на Y-хромосоме. Таким образом, свое выражение не зависит от мужчины приживления донорских клеток. 2). Bcl2 не регулируется в нынешних условиях трансплантации. Как Ш.собственные на рисунке 1, Bcl2 ген производит надежные и весьма последовательный контроль за общей нагрузки ДНК независимо от количества загруженных мужской ДНК. Zfy1 является цинк ген пальцем в яичках определении области 12 и находится на хромосоме Y. Было сообщено, что уровень экспрессии гена Zfy1 хорошо соответствует сумме мужской ДНК клетки в модели мыши трансплантации 8. В-третьих, наш метод ПЦР обладает высокой чувствительностью и может обнаружить приживления донорских клеток в <1%. Кроме того, образцы могут храниться в течение длительного времени для последующего анализа. В отличие от обычной проточной цитометрии на основе метода требует немедленной обработки образца. Наконец, наша техника мыши штамма независимыми и могут быть использованы для генетического фона, что не хватает четко определенных поверхностных маркеров для отдельных клеток донора из клеток реципиента. Это самое главное преимущество этого метода.
В наших современных экспериментальных условиях (донор / competitили соотношение 5/2), мы наблюдали около 80-90% доноров приживления в 16 недель с использованием ПЦР-методом. Наши данные вполне сопоставимы с обычной, проточной цитометрии на основе метода, который показал ~ 95% приживления донорских клеток через 16 недель после трансплантации с донором (CD45.2) / конкурента (CD45.1) в соотношении 4:1 2. По сравнению с традиционным методом, который использует маркер клеточной поверхности для обнаружения донорских клеток в получатель мышей, основным недостатком метода является невозможность анализа приживления в различные субпопуляции клеток крови, таких как В-клетки, Т-клетки и гранулоциты. Тем не менее, в случае необходимости, можно собирать каждую популяцию клеток с помощью мобильного сортировки технику, а затем подвергают образцы для RT-PCR для определения клетки-донора вклад в каждую ячейку населения. После приживления донорских клеток была рассчитана на основе стандартной кривой, образец считывания полностью зависит от склона и у перехвата стандартной кривой. Вполне возможно, что мы можем получить от дальности причинамДаут (т.е. более 100% приживления). Однако, эти «ложные положительные или ложно отрицательные" результаты можно избежать, если: 1) выделение ДНК процедур испытания образцов и стандартных образцов кривой идентичны, и 2) Выбранный диапазон стандартных кривой близко к ожидаемому образца считывания. Кроме того, так как там могут быть различия в каждой реакции ПЦР и в статусе калибровки машины ПЦР, стандартные образцы кривой должны быть включены в каждую тарелку ПЦР, чтобы избежать различий между каждой реакции ПЦР.
Наконец, мы проверили нашу технику с помощью нашего Pim тройной KO мышей. В соответствии с предыдущего доклада 13, мы обнаружили, что доноров ГСК из Pim тройной мышей KO являются дефектными в воссоздании летально облученных мышей получателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конкурирующих финансовых интересов раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Чарльз Гринберг для использования его реальная машина времени PCR. Эта работа поддерживается MUSC Hollings Cancer Center Запуск фонда, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO властвуй Cancer Foundation развития карьеры премии, NIH 1K08HL 103780-01A1, и NIH 3P30CA138313-01S3. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здоровья или других агентов финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
