Summary
Het bepalen van donorcel innesteling vormt een uitdaging in de muis beenmerg transplantatie modellen die goed gedefinieerde fenotypische merkers missen. We beschreven een methode om mannelijke donor cel innesteling te kwantificeren in vrouwelijke transplantatie ontvangende muizen. Deze methode kan worden gebruikt in alle muizenstammen voor de studie van HSC functies.
Abstract
Murine beenmergtransplantatie modellen een belangrijk instrument voor het meten van hematopoietische stamcellen (HSC) functies en het bepalen van genen / moleculen die HSCs reguleren. In deze modelsystemen transplantatie, wordt de functie van HSCs bepaald door het vermogen van deze cellen om enten en reconstitueren lethaal bestraalde ontvanger muizen. Gewoonlijk wordt de donorcel bijdrage / engraftment gemeten door antilichamen tegen donor-specifieke celoppervlakte-eiwitten met behulp van flowcytometrie. Deze werkwijze is sterk afhankelijk van de specificiteit en het vermogen van de celoppervlaktemarker tot donor-afgeleide cellen differentiëren van de ontvanger afkomstige cellen, die niet beschikbaar voor alle muizenstammen. Gezien de verschillende achtergronden van genetisch gemodificeerde muizenstammen in de markt, celoppervlak / flowcytometrie gebaseerde methode heeft vooral belangrijke beperkingen in muizenstammen die goed gedefinieerde oppervlaktemerkers gebrek aan afzonderlijke cellen van donor congenische ontvanger ceLLS. Hier rapporteerden we een PCR-gebaseerde techniek donorcel engraftment / bijdrage te bepalen in transplantatie ontvanger muizen. We getransplanteerd mannelijke donor beenmerg HSC om lethaal bestraalde congene vrouwelijke muizen. Perifere bloedmonsters werden verzameld op verschillende tijdstippen na transplantatie. Beenmerg monsters werden verkregen aan het eind van de experimenten. Genomisch DNA werd geïsoleerd en het Y-chromosoom specifiek gen, Zfy1, werd geamplificeerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR. De innesteling van de mannelijke donor-afgeleide cellen in de vrouwelijke ontvangende muizen werd berekend met een standaard curve met bekende percentage mannelijke versus vrouwelijke DNA's. Bcl2 werd gebruikt als een referentie-gen van de totale hoeveelheid DNA normaliseren. Onze gegevens suggereren dat deze benadering betrouwbaar donorcel engraftment bepaald en een nuttig, maar eenvoudige werkwijze voor het meten van hematopoietische cellen in muizen reconstitutie beenmergtransplantatie modellen. Onze methode kan routinematig worden uitgevoerd in de meeste laboratoria omdat geendure apparatuur zoals flowcytometrie vereist.
Introduction
Murine beenmerg (BM) transplantatie model werd voor het eerst ontwikkeld in 1960 1. Dit model is uitgebreid toegepast voor de studie van donor hematopoietische stamcellen (HSC) biologie in een gastheer ontvanger muis. Murine beenmergtransplantatie model heeft ons voorzien van waardevolle kennis op HSC functies en hun regelgeving en is onmisbaar in HSC onderzoek. Allogene beenmergtransplantatie model zoals C57BL/6J H2b-Balb / C H2D of congene transplantatie model zoals C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 worden gebruikt in vele laboratoria om de genfunctie studeren op HSC activiteit 2, effect van drug behandeling HSC functie 3 of transplantatie gerelateerde ziekten zoals graft-versus-host disease (GvHD) 4.
Celoppervlaktemerkers zoals MHC haplotype of CD45.1 worden vaak gebruikt voor het onderscheiden van donor-afgeleide cellen van de ontvanger afkomstige cellen. C57BL/6J H2b, CD45.2 H2D en B6.SJL CD45.1 zijn de meest gebruikte muizenstammen in beenmergtransplantatie omdat de donorcel bijdrage kan gemakkelijk worden beoordeeld door flowcytometrie meten CD45.1 tegen CD45.2 of H2b vs H2D. Echter, veel andere stammen zoals FVB / NJ 5 en C3H ook vaak gebruikt om genetisch gemanipuleerde transgene of knock-out muizen te genereren. Deze muizen kunnen worden teruggekruist met een zuivere lijn en onderhouden in een gemengde genetische / MHC achtergrond. In deze gevallen kan bepalen donorcel innesteling en HSC functie moeilijk als donor-specifieke celoppervlaktemerkers niet beschikbaar.
Met behulp van Y-chromosoom-specifieke DNA-probe aan de donor mannelijke cellen te detecteren door Southern blot in seks-mismatched beenmergtransplantatie werd voor het eerst ontwikkeld door de groep Dr Miwa's 6. Vervolgens werd een real-time PCR voor het geslacht bepalend gebied Y gevonden dat nauwkeurige en zeer specifieke methode ma kwantificeren zijnle foetale cellen in het bloed van de moeder-systeem 7. Dit concept werd aangepast door Dr groep Schwarzenberger voor de ontwikkeling van een real-time PCR techniek in een murine beenmergtransplantatie model donorcel engraftment 8 bepalen. We verder gemodificeerd deze methode voor het meten van donorcel engraftment in FVB / NJ muis beenmergtransplantatie model. Deze methode wordt momenteel veelvuldig toegepast in onze groep voor het bestuderen van de rol van Pim1 kinase in HSC biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bone Marrow Cell Isolation
- Euthanaseren mannelijke donor FVB / NJ muizen en vrouwelijke FVB / NJ muizen met CO 2 methode gevolgd door cervicale dislocatie. De vrouwelijke FVB / NJ beenmergcellen worden gebruikt als competitieve cellen.
- Gebruik kleine schaar en pincet, ontleden van dijbenen en tibiaes van muizen en ze in een 60 mm weefselkweek schotel met 6 ml ijskoud RPMI1640 met 5% door warmte geïnactiveerd FBS plaatsen. Gebruik Kimwipe weefsel spier-en andere weefsels te verwijderen. Snijd beide uiteinden van elk botschacht in de schotel.
- Sluit het uiteinde van het bot met 23G naald op 3 cc spuit, spoelen beenmerg met RPMI1640 met 5% door warmte geïnactiveerd FBS in de schaal. Disaggregeren beenmerg weefsel door herhaalde aspiraties met dezelfde naald. Breng de celsuspensie 15 ml centrifugebuis.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 400 xg, verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 1 ml van kamertemperatuur rode bloedcellen lysis buffer (155 mM potassium bicarbonaat, 10 mM ammoniumchloride, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min en voeg 5-10 ml RPMI 1640 met 5% warmte geïnactiveerd FBS.
- Steek de cellen door een cel zeef. Verzamel de stroom door naar een nieuwe buis. Spin down gedurende 5 min bij 400 x g. Verwijder het supernatant; de celpellet mogen geen rode kleur. Aangezien rode kleur geeft een volledige verwijdering van rode bloedcellen. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml RPMI1640 met 5% door warmte geïnactiveerd FBS. Voorzichtig vortexen te zorgen dat de celsuspensie is volledig uniform. Pipetteer een en tel de cellen in een hemacytometer. Berekenen hoeveel volume van cellen die nodig zijn voor beenmergtransplantatie en aliquot genoeg cellen en meng mannelijke donorcellen met concurrerende vrouwelijke cellen in een verhouding van 5:2. Draai gedurende 5 min bij 400 xg, wassen met PBS, resuspendeer in PBS met eindconcentratie van donor cellen bij 5 x 10 6 / ml en concurrent cellen in 2 × 10 6
2. Concurrerende beenmergtransplantatie
- Bestralen vrouwelijke ontvangende muizen (8-12 weken oud) met 137Cs gammastralen straler met een enkele dosis 11Gy 4-6 uur voor beenmergtransplantatie.
- Plaats de bestraalde vrouwelijke muizen in een muis restrainer. Injecteer de gemengde donor en concurrent cellen via staartader in 0,1 ml totaal volume, zodat elke muis 5 x 10 5 donor cellen en 2 x 10 5 concurrent beenmergcellen ontvangt.
3. Monsterneming
Paren weken na beenmergtransplantatie, verzamelen perifere bloedmonsters (~ 50 pi) van vrouwelijke ontvangende muizen door retro-orbitale bloeding onder verdoving voorwaarde. Monsters worden verzameld in EDTA beklede buisjes. BM monsters kunnen ook worden verzameld aan het einde van het experiment, gewoonlijk ten minste 4 maanden na transplantatie, met zelfde procedures als boven beschreven (stap 1), meestal 20-40%1 tibia BM cellen genoeg om voldoende hoeveelheid DNA. Bloed of BM monsters vanaf de leeftijd afgestemd normale vrouwelijke en mannelijke muizen worden ook verzameld op standaard curve te bereiden.
4. Genomisch DNA Isolation
- Voeg 4 × volume van kamertemperatuur RBC lysis buffer (~ 200 ui) aan elk bloedmonster. Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml van PBS, dan draaien tot de meeste van de gelyseerde RBC te verwijderen.
- Isoleer DNA met behulp van een bloed-DNA-extractie kit (QIAmp DNA Blood extractie kit). Voorverwarmen van de elutiebuffer (AE) bij 37 ° C om de opbrengst van geëlueerde DNA verbeteren. Mannelijke en vrouwelijke DNA's voor standaard curve worden op dezelfde wijze geïsoleerd.
- (Optioneel) genomisch DNA kan verder worden gezuiverd of geconcentreerd met EtOH precipitatie in aanwezigheid van 3 M natriumacetaat (pH = 5,5). De DNA pellets worden vervolgens geresuspendeerd in 40-50 pi gedestilleerd water voor analyse direct of bewaard bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
- Meet de DNA concentratie met NanoDrop ND-1000 spectra fotometer. Monsters met een OD 260/280 tussen 1,8-2,0 gebruikt voor verdere analyse.
- Verdun DNA met DNAase vrije H 2 O tot 4ng/μl in een totaal volume van 50 ul.
5. Standard Curve Bereiding
Verdun mannelijke en vrouwelijke DNA DNA tot een concentratie van 4 ng / pl en maken het DNA mengsel volgens de Tabel1
| % Van de mannelijke DNA van Vrouwen Achtergrond | Volume (pi) van 4ng/μl mannelijk DNA | Volume (pi) van 4ng/μl vrouwelijk DNA | Totaal volume (pl) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabel 1. Monstervoorbereiding voor standaardcurve. Normaal mannelijke en vrouwelijke FVB / NJ muizen op de leeftijd van 8-12wks werden geofferd. Bloed en BM cellen werden verzameld. DNAs van mannelijke en vrouwelijke cellen werden geïsoleerd en geresuspendeerd in een concentratie van 4ng/μl. De mannelijke en vrouwelijke DNAs werden gemengd in verschillende verhoudingen aan de DNA standaardmonster mengsels genereren.
6. Real-time PCR
- Stel de PCR-reactie plaat door het mengen van SYBR Green supermix reagens met primers en genomisch DNA. De reactie volume (20 ul) bevat 400 nM van elke primer en 5 pl bloedcellen genomisch DNA (4ng/μl x5 pi = 20 ng) in elke reactie. DNA-samples en normen werden opgericht in drievoud. De sequenties van primers worden getoond in Tabel 2.
| Gene naam | Vooruit | Omkeren |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabel 2. RT-PCR primer sequentie voor murine Bcl2 en Zfy1.
- Voer PCR reactie met Biorad iQ5 PCR-machine met de volgende voorwaarden: 95 ° C 3 min, 42 amplificatie cycli van 95 ° C gedurende 10 sec, 58 ° C gedurende 25 sec en 72 ° C gedurende 15 sec, gevolgd door een smelt-curve stap.
- Zorg voor Cycle threshold (Ct)-waarden door Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition optisch systeem. Bereken δCt (Ct Zfy1 </ Sup> Ct-Bcl2) waarde en Zfy1 expressie wordt berekend als de waarde 2-δ Ct.
- Bepaal standaard curves voor elke reactie serie met behulp van 2-δCt lezen van bekende man / vrouw standaard mengsels. De standaard curves worden gegenereerd door het uitzetten van de gemiddelde van 2-δCt waarde van triplo de bekende% mannelijke DNA in het mengsel met lineaire regressie fitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 en 2 zien voorbeelden van standaard curves uitgezet met het gemiddelde van 2-δCt tegen percentages van mannelijke DNA. Figuur 1A vertoonden specifieke smelttemperatuur voor Bcl2 en Zfy1 amplicons gelokaliseerd van 78,5 ° C en 88,5 ° C respectievelijk. Bcl2 wordt gebruikt als een referentie-gen aan de totale hoeveelheid DNA geladen in elke PCR reactie normaliseren. Bcl2 amplificatiecurves (Log view) voor elk standaardmonster fuseren met elkaar onafhankelijke mannelijke DNA concentratie, waarin gelijke hoeveelheid geladen DNA (Figuur 1B). Echter Zfy1 amplificatiecurve gemigreerd naar links met toenemende hoeveelheid mannelijke DNA in het monster (figuur 1C). Onze methode valideren onderzochten we mannelijke donorcel engraftment in getransplanteerde muizen die BM cellen WT versus Pim triple knockout (TKO) muizen op verschillende tijdstippen na transplantatie. Zowel perifere bloed (6wks) en BM monsters (16wks) w ere geanalyseerd. HSC's van Pim TKO muizen hebben gebreken in het reconstitueren lethaal bestraalde muizen (An, N et al.., Manuscript wordt herzien). Zoals verwacht ontvangende muizen getransplanteerd met Pim TKO cellen hadden een veel lager percentage van mannelijke cellen vergeleken met muizen getransplanteerd met WT cellen (Figuur 3).
Figuur 1. (A) Representative smeltcurve van meerdere monsters met verschillende percentages mannelijke DNA. De piek van 78,5 geeft amplificatie van Bcl2, terwijl de piek bij 88,5 ° C geeft amplificatie van Zfy-1. Representatieve amplificatiecurve van meerdere monsters met verschillende mannelijke DNA percentage Bcl2 (B) en Zfy1 (C), Ct: cycle drempel.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. RT-PCR standaardcurve voor mannelijke DNA percentage. Monsters (20 ng DNA in 20 ui totaal volume) van mannelijke en vrouwelijke DNA mengsels verkregen uit beenmergcellen werden bewerkt voor RT-PCR zoals beschreven in protocol. De gemiddelde waarden van δCt (Ct-Ct Zfy1 Bcl2) voor afzonderlijke monsters werden berekend en 2-δ Ct (Y-as) werd uitgezet tegen percentage mannelijke DNA (X-as) (bereik van 0,2% tot 100%) met lineaire regressie fitting. R2 de determinatiecoëfficiënt.
Figuur 3. Concurrerende beenmergtransplantatie ervariments. 5 x 10 5 totale BM cellen van mannelijke WT of overeenstemmende leeftijd mannelijke Pim triple KO (TKO) muizen met 2 x 10 5 vrouwelijke concurrent beenmergcellen werden getransplanteerd in bestraalde gastvrouwen. Perifeer bloed (PB) chimerisme 6 weken en BM chimerisme op 16 weken na transplantatie werden geschat door percentage mannelijke DNA door RT-PCR zoals in de afkeurde protocol (* p <0,05, ** P <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van onze huidige studie is om het publiek een PCR-gebaseerde techniek om donorcel innesteling te kwantificeren in een concurrerende muis beenmergtransplantatie model. Verschillende studies gerapporteerd met RT-PCR met donor cellen te detecteren in transplantatiemodellen 9-10. Dr Schwarzenberger groep voor het eerst ontwikkeld een muizen beenmergtransplantatie model met behulp van real-time PCR voor het amplificeren van y-chromosoom-specifieke 8. Deze methode werd gebruikt om Gli-1 functie HSC activiteit 11 bestuderen. Vervolgens hebben we verder aangepast het protocol en voorzien van een gedetailleerde, stap-voor-stap experimentele protocol in gevisualiseerd formaat. De gevisualiseerde presentatie van ons protocol kan het publiek naar ons protocol gemakkelijk volgen. We vergeleken ook onze PCR resultaten met genomisch DNA van BM monsters vs DNA uit perifeer bloed. De donor engraftment gegevens van BM en bloedmonsters zijn in principe overeen werd echter gewoonlijk minder variatie in BM monsters. Dit iswaarschijnlijk als gevolg van achterblijvende hemoglobine na RBC lysis in het perifere bloed met de zuiverheid / kwaliteit van genomisch DNA kunnen brengen in de bloedmonsters.
Er zijn verschillende voordelen van onze PCR-gebaseerde techniek donorcel engraftment kwantificeren. Eerst, onze techniek kan worden uitgevoerd in de meeste laboratoria. Er is geen noodzaak voor gespecialiseerde en dure apparatuur dan real time PCR-machine. We verder gemodificeerd PCR reactiecomponent en gebruikt SYBR Green supermix plaats van Taqman. Deze verandering reduceert de kosten en onkosten we de fluorescent gelabelde probe elimineren. Tweede onze techniek betrouwbaar en zeer reproduceerbaar. We gebruikten het Bcl2 referentiegen de totale hoeveelheid DNA in tegenstelling tot DNA Kwantificeringskit normaliseren. Bcl2-gen werd gebruikt omdat: 1) dit gen zich niet op Y-chromosoom. Daarom wordt de expressie niet beïnvloed door mannelijke donor cel aanslaan. 2). Bcl2 wordt niet geregeld in de huidige transplantatie voorwaarden. Als sheigen in figuur 1, Bcl2 gen produceert een betrouwbare en consistente controle voor volledige DNA loading onafhankelijk loaded mannelijke DNA hoeveelheid. Zfy1 een zinkvinger gen in testis bepalend gebied 12 en ligt op het Y chromosoom. Het is gerapporteerd dat het gen expressieniveau van Zfy1 goed overeenkomt met de hoeveelheid mannelijke cel DNA in een muis transplantatiemodel 8. Derde onze PCR-techniek is zeer gevoelig en kan donorcel engraftment detecteren bij <1%. Bovendien kunnen monsters worden gedurende lange tijd voor latere analyse. In tegenstelling tot de conventionele flow cytometrie-gebaseerde methode vereist onmiddellijke monster verwerking. Tenslotte onze techniek muizenstam onafhankelijk en kunnen worden gebruikt voor genetische achtergrond die goed gedefinieerde oppervlaktemerkers mist te scheiden donor cellen van recipiëntcellen. Dit is het belangrijkste voordeel van deze methode.
Onder onze huidige experimentele conditie (donor / competitof verhouding 5/2), we waargenomen rond 80-90% donor engraftment na 16 weken met de PCR-methode. Onze gegevens zijn goed vergelijkbaar met conventionele, flowcytometrie based-methode die ~ 95% donorcel innesteling toonde bij 16 weken na transplantatie met donor (CD45.2) / concurrent (CD45.1) ratio op 4:1 2. Vergeleken met de conventionele methode die celoppervlaktemarker gebruikt om donor cellen te detecteren in ontvangende muizen, het grote nadeel van onze methode is het onvermogen om de engraftment analyseren verschillende subpopulaties van bloedcellen zoals B-cellen, T-cellen of granulocyten. Echter, indien nodig, het mogelijk is om elke populatie van cellen te verzamelen met celsortering techniek en onder de monsters voor RT-PCR om donorcel bijdrage in elke cel populatie te bepalen. Omdat de donor cel innesteling werd berekend op basis van standaard curve, het monster uitlezing is volledig afhankelijk van de helling en y-afsnijpunt van standaardcurve. Het is mogelijk dat we uitstappen-range readout (dat wil zeggen meer dan 100% van de implantatie). Echter, deze "valse positieve of valse negatieve" resultaten worden vermeden indien: 1) de DNA isolatie procedures voor de geteste monsters en standaard curve monsters identiek, en 2) de gekozen reeks standaard curve dicht bij de verwachte monster uitlezing. Bovendien, omdat er verschillen in elke PCR reactie en in de kalibratiestatus van PCR machine moet standaardcurve monsters Bij elk PCR plaat verschillen tussen elke PCR reactie te vermijden.
Tenslotte gevalideerd we onze techniek met onze Pim triple KO muizen. In overeenstemming met vorige verslag 13, vonden we dat donor HSC van Pim triple KO muizen zijn defect in het reconstitueren lethaal bestraalde ontvangende muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Wij danken dr. Charles Greenberg voor het gebruik van zijn real-time PCR-machine. Dit werk wordt ondersteund door MUSC Hollings Cancer Center opstarten Fonds, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1, en NIH 3P30CA138313-01S3. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health of andere financiering agenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
