Summary
ドナー細胞の生着を決定することは、明確に定義された表現型マーカーを欠くマウス骨髄移植モデルにおける課題を提示する。私たちは、女性の移植レシピエントマウスに男性ドナー細胞の生着を定量化するための方法論を説明した。このメソッドは、HSCの機能の研究のためにすべてのマウス系統で使用することができます。
Abstract
マウス骨髄移植モデルは、造血幹細胞（HSC）の機能および決定遺伝子/ HSCを調節する分子を測定する際の重要なツールを提供します。これらの移植モデルシステムでは、造血幹細胞の機能が生着し、再構成する致死量の放射線を照射したレシピエントマウスにこれらの細胞の能力によって決定されます。一般的には、ドナー細胞の寄与/生着は、フローサイトメトリーを用いたドナー特異的な細胞表面タンパク質に対する抗体によって測定されます。しかし、この方法は、大きく特異性とすべてのマウス系統では使用できない場合があり、受信者から発信された細胞からドナー由来細胞を区別するために、細胞表面マーカーの能力に依存します。市場では遺伝的に改変されたマウス系統の様々な背景を考えると、この細胞表面/フローサイトメトリーベースの方法は、特にジェニック受け手CEから独立したドナー細胞に明確に定義された表面マーカーを欠いているマウス系統に重大な制限がありますLLS。ここでは、移植レシピエントマウスにおけるドナー細胞の生着/寄与を決定するために、PCRベースの手法を報告した。私たちは、致死量の放射線を照射ジェニック雌マウスに男性ドナー骨髄の造血幹細胞を移植した。末梢血試料を異なる時点の移植後に採取した。骨髄サンプルは、実験の終了時に得られた。ゲノムDNAを単離し、Y染色体特異的遺伝子、Zfy1は、定量的リアルタイムPCRを用いて増幅した。女性レシピエントマウスにおける男性ドナー由来細胞の生着は、男性対女性のDNAの既知の割合で標準曲線に対して算出した。 BCL2は、総DNA量を正規化するために参照遺伝子として用いた。我々のデータは、このアプローチは確実にドナー細胞の生着を決定し、マウス骨髄移植モデルにおける造血細胞再構成を測定するのに有用な、まだ簡単な方法を提供することが示唆された。本手法は、日常的にほとんどの研究室で行うことができるため、ノーこのようなフローサイトメトリーなどの高価な機器が必要です。
Introduction
マウス骨髄（BM）移植モデルは、1960年代に最初1で開発されました。このモデルは広範囲にホストレシピエントマウスにおけるドナーの造血幹細胞（HSC）の生物学の研究に用いられてきた。マウス骨髄移植モデルは、HSCの機能とその調節に関する貴重な知識を提供してくれましたし、HSCの研究に不可欠である。 C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1様C57BL/6J H2B-のBalb / C H2Dまたはジェニック移植モデルのような同種骨髄移植モデルでは、効果の、HSCの活性が2日に遺伝子機能を研究するために多くの研究室で使用されているそのような移植片対宿主病（GVHD）4などのHSC機能3または移植関連疾患に対する薬物治療。
そのようなMHCハプロタイプまたはCD45.1として細胞表面マーカーは、一般的に受信者から発信された細胞から区別するドナー由来細胞に使用されます。 C57BL/6J H2B、CD45.2 対 CD45.2またはH2B対を測定するフローサイトメトリーにより評価することができるので、p>は、BALB / C H2DとB6.SJL CD45.1は、骨髄移植で最も一般的に使用されるマウス株であるH2D。しかし、このようなFVB / NJ 5とC3Hのような他の多くの菌株もしばしば遺伝子組み換えトランスジェニックやノックアウトマウスを生成するために使用されます。これらのマウスは近交系に戻し交配および混合MHC /遺伝的背景で維持することができる。ドナー特異的細胞表面マーカーが使用できない場合があり、これらの例では、ドナー細胞の生着とHSC機能を決定することは難しいかもしれません。
性別不適合骨髄移植におけるサザンブロットによってドナー雄性細胞を検出するために、Y染色体特異的DNAプローブを用いて、前記第三輪博士のグループ6によって開発されました。その後、性決定領域YのためのリアルタイムPCRはmaを定量するため、正確かつ特異性の高い方法であることが判明した母体血システム7のLe胎児細胞。この概念は、ドナー細胞の生着8を決定するために、マウス骨髄移植モデルにおけるリアルタイムPCR法の開発のための博士シュワルツェンバーガーのグループが適応されました。我々はさらにFVB / NJマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を測定するためのこの方法を変更しました。このメソッドは、現在広くHSCの生物学におけるPIM1キナーゼの役割を研究するために我々のグループで利用されている。
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Protocol
1。骨髄細胞の単離
- 男性ドナーFVB / NJマウスや頸椎脱臼続いたCO 2の方法を使用して女性のFVB / NJマウスを安楽死させる。女性FVB / NJ骨髄細胞は、競争力のある細胞として使用されます。
- マウスからの大腿骨およびtibiaesをばらばらにすると5％の熱不活性化FBSを6 mlの氷冷した1640を含む60mmの組織培養皿に置き、小さなはさみや鉗子を使用しています。筋肉や他の組織を除去するためにキムワイプティッシュを使用しています。皿の中でそれぞれの骨軸の両端を切り落とした。
- 3 ccシリンジに23G針を用いて骨の端を接続し、皿に5％熱不活化FBSを含むRPMI1640で骨髄を洗い流す。同じ針を使用して繰り返し願望によって骨髄組織を分解。 15 ml遠心チューブに細胞懸濁液を移す。
- 400 xgで5分間細胞をスピンダウンし、上清を除去し、（155 mMの電話室温赤血球溶解バッファー1mlに細胞を再懸濁otassium重炭酸塩、10mMの塩化アンモニウム、EDTA = 7.4 PHの0.1 mM）および室温で5分間インキュベートし、次に5％熱不活性化FBSを含むRPMI 1640の5-10 mlを加える。
- セルストレーナーを通してセルを渡す。新しいチューブに通る流れを収集します。 400 x gで5分間スピンダウンします。上清を除去し、細胞ペレットは、任意の赤色を含むべきではありません。赤い色の不在は、赤血球を完全に除去することを示します。 5％熱不活化FBSを含むRPMI1640 10mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液は完全に均一であることを確認するために静かに渦。アリコートを取り、血球計算盤で細胞数をカウント。骨髄移植と5:2の割合で女性のライバル細胞と分量に十分な細胞やミックス男性ドナー細胞に必要な細胞のどのくらいの体積を計算します。 2×10 6個で5におけるドナー細胞の最終濃度が1×10 6個 / mlと競合他社の細胞と400 XG、PBSで洗浄し、PBSに再懸濁し、5分間スピンダウン
2。競争力のある骨髄移植
- 骨髄移植前に11Gy 4から6時間の単回投与における137Csのガンマ線放射体でメスのレシピエントマウス（生後8〜12週齢）を照射します。
- マウスの制止で照射雌マウスを置きます。それぞれのマウスは5×10 5ドナー細胞と2×10 5ライバル骨髄細胞を受信できるように総量0.1mlに尾静脈を介して混合ドナーと競合他社の細胞を注入します。
3。試料捕集
カップル·週間骨髄移植後に、麻酔条件下で眼窩出血によって女性レシピエントマウスから末梢血サンプル（〜50μl）を収集しています。サンプルは、EDTA被覆管に集められます。 BMのサンプルも記載前回と同じ手順（ステップ1）で、通常は少なくとも4ヶ月移植後、実験終了時に収集することができ、通常の20から40パーセント1脛骨骨髄細胞はDNAの十分な量を作るのに十分です。血液または骨髄サンプル年齢からマッチさせた正常雌と雄マウスも標準曲線を準備するために収集されます。
4。ゲノムDNAの単離
- 各血液サンプルを室温赤血球溶解バッファー（〜200μL）の4×ボリュームを追加します。よく混ぜ、室温で5分間静置します。 1mlのPBSを追加し、溶解したRBCの大部分を除去するスピンダウンします。
- 血液のDNA抽出キット（QIAmp DNAの血液抽出キット）を使用してDNAを単離する。 37℃でプレ暖かい溶出バッファー（AE）℃溶出したDNAの収量を向上させます。標準曲線のために男性と女性のDNAを同様に分離されています。
- （オプション）ゲノムDNAをさらに精製または3 M酢酸ナトリウム（pH = 5.5）の存在下でエタノール沈殿法を用いて濃縮することができる。 DNAペレットを直ちに分析のために40から50μlの蒸留水に再懸濁し、または将来の使用のために-20℃で保存されています。
- DNAのconcentrを測定ナノドロップND-1000スペクトル光度計とation。 OD 260/280 1.8から2.0の間の検体は、さらなる分析のために使用されています。
- 全量50μlで4ng/μlするDNAアーゼフリーH 2 Oを用いてDNAを希釈します。
5。標準曲線の準備
4 ng /μlにの濃度に男性DNAと女性のDNAを希釈し、Table1を記載のDNA混合物を作る
| 女性のバックグラウンドでの男性のDNAの％ | 4ng/μl男性DNAの容量（μL） | 4ng/μl女性のDNAの容量（μL） | 総容量（μL） |
| 0.2 | 1 | 499 | 500 |
| 0.5 | 1 | 199 | 200 |
| 2.5 | 5 | 195 | 200 |
| 12.5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87.5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
標準曲線については、 表1。サンプル調製。 8 12wks歳の時に通常のオスとメスFVB / NJマウスを屠殺した。血液や骨髄細胞を採取した。オスとメスの細胞の細胞からDNAを単離し、そして4ng/μlの濃度で再懸濁した。雄と雌のDNAがDNA標準試料混合物を生成するために種々の割合で混合した。
6。リアルタイムPCR
- プライマー及びゲノムDNAをSYBR Green Supermixを試薬を混合することにより、PCR反応プレートを設定します。反応液量（20μL）は、各プライマーの400 nMおよび各反応における血液細胞のゲノムDNA（4ng/μlx5のμL= 20 ng）を5μlを含んでいます。 DNA SAMPレや基準は三重に設置された。プライマーの配列を表2に示す。
| 遺伝子名 | フォワード | 逆転 |
| BCL2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5 TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
ネズミBCL2とZfy1については、 表2のRT-PCRプライマー配列。
- 95℃で3分間、融解曲線が続く10秒間、95℃、58℃25秒、72℃15秒→42増幅サイクル：以下の条件をバイオラッドiQ5 PCR装置を用いてPCR反応を行うステップ。
- Bio-RadのiQ5 2.1 Standard Editionの光学系によってサイクル閾値（Ct）値を取得します。計算ΔCT（CT Zfy1 </ sup>の-CT BCL2）値、Zfy1発現レベルは2-δCtの値として計算されます。
- 既知のオス/メスの標準混合物から2-ΔCT読書を使用して、それぞれの反応シリーズの標準曲線を確立します。標準曲線は、線形回帰フィッティングとの混合物で知ら％男性DNAに三重の2ΔCT値の平均値をプロットすることによって生成されます。
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Representative Results
図1及び図2は、標準曲線の例は男性DNAの割合に対して2-ΔCTの平均値でプロットを示した。 図1Aは 、それぞれ78.5℃、88.5℃でローカライズBCL2とZfy1リコンのための特異的な融解温度を示した。 BCL2は、各PCR反応にロードされたDNAの総量を正規化するために参照遺伝子として使用されます。各標準サンプルのためBCL2増幅曲線は、（ログビュー）ロードされたDNA（ 図1B）の等しい量を示す、男性DNA濃度とは無関係お互いにマージします。しかし、Zfy1増幅曲線は、試料中の男性DNAの量が増加する（ 図1C）を左に移行しました。我々の手法を検証するために、我々は、異なる時点の移植後にWT 対ピムトリプルノックアウト（TKO）マウスから骨髄細胞移植を受けたマウスで男性ドナー細胞の生着をテストした。末梢血（6wks）とBMサンプル（16wks）wの両方 EREは分析した。ピム·TKOのマウスからのHSCは、致死量の放射線を照射したマウス（、N ら 、改正の下原稿を）再構成の欠陥を持っている。予想されるように、ピムTKOの細胞を移植したレシピエントマウスはWT細胞（ 図3）を移植したマウスに比べ、男性の細胞のはるかに低い割合を持っていた。
図1異なる男性DNAの割合で複数のサンプルから、（A）代表融解曲線。 88.5ピーク℃をZFY-1の増幅を示しながら78.5のピークは、BCL2の増幅を示しています。サイクル閾値：BCL2（B）とZfy1（C）は 、CT用の別の男性のDNAの割合で複数のサンプルからの代表的な増幅曲線。= "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg"ターゲット= "_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
男性DNAの割合については、 図2を参照し、RT-PCR標準曲線。骨髄細胞から得られた雄と雌のDNA混合物の試料（20μlの総体積で20 ngのDNA）などのプロトコルに記載されたRT-PCRのために処理した。個々のサンプルのためのΔCTの平均値（CT Zfy1-CT BCL2）を算出し、2-δCT（Y軸）は線形回帰で（0.2％〜100％の範囲）（X軸）男性DNAの割合に対してプロットしたフィッティング。 R2は決定係数を表します。
図3：競争骨髄移植EXPEriments。 2×10 5女性ライバルの骨髄細胞と一緒に男性のピムトリプルKO（TKO）マウスにマッチした男性WTまたは年齢から5×10 5総BM細胞を照射雌の宿主に移植した。プロトコル（* P <0.05、** P <0.01）に非難し、16週後の移植の6週間とBMキメリズムにおける末梢血（PB）キメリズムは、RT-PCRにより男性DNAの割合を推定した。
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Discussion
我々の現在の研究の目的は、観客に競争力のあるマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を定量化するためのPCRベースの技術を提供することにある。いくつかの研究は移植モデル9-10にドナー細胞を検出するためにRT-PCRを用いて報告されている。博士シュワルツェンバーガーのグループは、最初のY染色体に特異的な8を増幅するリアルタイムPCRを用いてマウス骨髄移植モデルを開発しました。この方法は、GLI-1のHSC活性が11の機能を研究するために使用された。我々は、さらにプロトコルを変更し、視覚化した形式で詳細なステップバイステップの実験プロトコルを提供しました。我々のプロトコルの可視化、プレゼンテーションは、観客が、簡単に我々のプロトコルに従うことができます。また、末梢血から骨髄サンプル対のDNAからゲノムDNAを用いて、我々のPCRの結果を比較した。 BMと血液サンプルからドナーの生着データは基本的に一貫している、しかし、通常、あまり変動は、BMのサンプルで発見された。これはおそらく血液サンプル中のゲノムDNAの純度/品質を損なう可能性があり、末梢血中のRBC溶解後の残留ヘモグロビンに起因する。
ドナー細胞の生着を定量化するための私たちのPCRベースの手法にはいくつかの利点があります。最初に、我々の技術が研究室のほとんどに行うことができます。リアルタイム - PCRマシン以外の専門的かつ高価な機器は必要ありません。我々は、さらにPCR反応コンポーネントを変更し、代わりにタックマンのSYBR Green Supermixをを使用していました。この変更は、さらに我々は、蛍光標識プローブを取り除くようにコストや経費を削減します。第二に、我々の技術は、信頼性と再現性が高い。我々は、DNA定量キットとは対照的に、総DNA量を正規化するBCL2リファレンス遺伝子を使用していました。 1）この遺伝子はY染色体上に配置されていない理由は次のとおりBCL2遺伝子を用いた。したがって、その発現は男性ドナー細胞の生着に影響されません。 2）。 BCL2は、現在の移植条件の下で規制されていません。 shとして図1の独自の、BCL2遺伝子は、ロードされた男性のDNA量とは独立した全DNAをロードするための高い信頼性と一貫性のあるコントロールを生成します。 Zfy1は領域12を決定する精巣内ジンクフィンガー遺伝子であり、Y染色体上に位置しています。それはZfy1の遺伝子発現レベルは、マウス移植モデル8の雄性細胞のDNAの量によく対応していることが報告されている。第三に、私たちのPCRベースのテクニックは、非常に敏感であり、<1％のドナー細胞の生着を検出することができます。さらに、サンプルは後で分析するために、長期間保存することができます。対照的に、従来のフローサイトメトリーベースの方法は、即時のサンプル処理を必要とします。最後に、我々の技術は、独立したマウス系統であると受容細胞とは別のドナー細胞に明確に定義された表面マーカーを欠いている遺伝的背景に使用することができます。これは、このメソッドの中で最も重要な利点である。
我々の現在の実験条件の下で（ドナー/ competitまたは比）は5月2日であり、我々は、PCRベースの方法を使用して、16週の時点で周りに80〜90％のドナーの生着を観測しました。我々のデータは、16週間後のドナーと移植（CD45.2）/ライバル（CD45.1）4:1 2の比率で約95％のドナー細胞の生着が認められ、従来のフローサイトメトリー法をベースにかなり匹敵しています。レシピエントマウスにおけるドナー細胞を検出するために、細胞表面マーカーを用いた従来の方法に比べて、提案手法の主な欠点は、そのようなB細胞、T細胞や顆粒球などの血液細胞の様々な部分集団における生着を分析することができないことである。ただし、必要に応じて、各細胞集団におけるドナー細胞の寄与を決定するために、細胞選別技術とその後予告RT-PCR用のサンプルを用いて、細胞の各集団を回収することができる。ドナー細胞の生着を標準曲線に基づいて計算したので、サンプルの読み出しは、標準曲線の傾きとy切片に完全に依存しています。それは我々がオフレンジREAを取得している可能性がありDOUT（生着、 すなわち 100％以上）。しかし、これらの "偽陽性または偽陰性"の結果があれば回避することができます：1）試験サンプルと標準曲線サンプルのDNA単離手順は同一であり、2）標準曲線の選択された範囲が予想サンプル読み出しに近接しています。各PCR反応とPCR装置の校正状態に違いがあるかもしれないので、さらに、標準曲線サンプルを各PCR反応の間の変動を回避するために、各PCRプレートに含まれるべきである。
最後に、私たちは私たちのピムトリプルKOマウスを用いた我々の手法を検証しました。前回の報告書13に一致して、我々は、PIMトリプルKOマウスからドナーHSCは致死量の放射線を照射したレシピエントマウスを再構成することで欠陥があることがわかった。
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Disclosures
我々は、開示することなく競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
我々は彼のリアルタイムPCR装置の使用のために博士チャールズグリーンバーグに感謝します。この作品は、MUSCホリングズがんセンタースタートアップファンド、ホリングズがんセンターACS IRG、ASCOのがん財団のキャリア開発賞を征服し、NIH 1K08HL 103780-01A1、およびNIH 3P30CA138313-01S3でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所（NIH）やその他の資金調達エージェントの公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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