Summary
Bestimmung Donorzelle Transplantation stellt eine Herausforderung in der Maus Knochenmarktransplantation Modelle, die gut definierte phänotypische Marker fehlen. Wir beschrieben eine Methode zur männlichen Spenders Engraftment bei weiblichen Transplantatempfängers Mäusen zu quantifizieren. Dieses Verfahren kann in allen Mausstämmen zur Untersuchung von HSC-Funktionen verwendet werden.
Abstract
Murine Knochenmark-Transplantation Modelle bieten ein wichtiges Instrument bei der Messung hämatopoetischen Stammzellen (HSC)-Funktionen und die Bestimmung Gene / Moleküle, die HSCs regulieren. In diesen Transplantationsmodell Systemen wird die Funktion des HSK durch die Fähigkeit dieser Zellen, einprägen und rekonstituieren letal bestrahlten Mäusen Empfängers bestimmt. Üblicherweise wird die Donorzelle Beitrag / Verpflanzung durch Antikörper gegen Donor-spezifische Zelloberflächenproteine mittels Durchflusszytometrie gemessen. Allerdings ist diese Methode hängt stark von der Spezifität und die Fähigkeit des Zelloberflächenmarkers zu Donor-abgeleiteten Zellen von Empfänger-Zellen stammt, die möglicherweise nicht für alle Maus-Stämmen zu unterscheiden. Betrachtet man die verschiedenen Hintergründen von gentechnisch veränderten Mauslinien auf dem Markt, hat diese Zelle Oberfläche / Durchflusszytometrie basierende Methode erheblichen Einschränkungen vor allem in Maus-Stämme, die gut definierte Oberfläche Marker fehlen, um getrennte Spenderzellen aus kongene Empfänger cells. Hier haben wir über einen PCR-basierten Technik Donorzelle Engraftment / Beitrag Transplantatempfänger Mäusen zu bestimmen. Wir transplantiert männlichen Spender-Knochenmark HSCs zu letal bestrahlten kongene weiblichen Mäusen. Periphere Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation gesammelt. Knochenmark-Proben wurden am Ende der Experimente erhalten. Genomische DNA wurde isoliert und das Y-Chromosom spezifischen Gens, Zfy1, wurde amplifiziert mittels quantitativer Echtzeit-PCR. Die Verpflanzung von männlichen Spenders-abgeleiteter Zellen in den weiblichen Empfängermäuse wurde gegen Standardkurve mit bekannten Anteil männlicher vs weiblichen DNAs berechnet. Bcl2 wurde als Referenz-Gen um das Gesamt-DNA Menge normalisieren verwendet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Ansatz zuverlässig bestimmt Donorzelle Verpflanzung und bietet eine nützliche, aber einfache Methode zur Messung hämatopoetischen Zellen Rekonstitution in murine Knochenmark-Transplantation Modelle. Unsere Methode kann routinemäßig in den meisten Labors durchgeführt werden, da keinekostspielige Ausrüstung wie Durchflusszytometrie erforderlich.
Introduction
Murine Knochenmark (BM) Transplantation Modell wurde erstmals in den 1960er Jahren 1 entwickelt. Dieses Modell wurde ausgiebig für das Studium der Donor hämopoetischen Stammzelle (HSC) Biologie in einem Wirt Empfängermaus verwendet. Murine Knochenmarktransplantation Modell hat uns mit wertvollen Wissen über HSC-Funktionen und deren Regulierung vorgesehen und in HSC Forschung unverzichtbar. Allogene Knochenmarktransplantation Modell wie C57Bl/6J H2b-Balb / C H2d oder kongene Transplantation Modell wie C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 werden in vielen Laboren verwendet, um die Genfunktion auf HSC Aktivität 2 studieren, Wirkung Arzneimittelbehandlung auf HSC Funktion 3 oder Transplantation Krankheiten wie Graft-versus-host disease (GvHD) 4.
Zelloberflächenmarker wie MHC Haplotyp oder CD45.1 werden häufig zur Unterscheidung von Donor-abgeleiteten Zellen vom Empfänger-Ursprung Zellen verwendet. C57Bl/6J H2b, CD45.2 H2d und B6.SJL CD45.1 die am häufigsten verwendeten Mausstämmen in Knochenmarkstransplantation, weil die Donorzelle Beitrag kann leicht durch Durchflußzytometrie gemessen CD45.1 vs CD45.2 oder H2b vs beurteilen H2D. Allerdings sind viele andere Stämme, wie FVB / NJ 5 und C3H auch häufig verwendet, um gentechnisch transgenen oder Knockout-Mäuse zu erzeugen. Diese Mäuse können zu einer Inzuchtlinie rückgekreuzt und gewartet werden in einer gemischten genetischen / MHC Hintergrund. In diesen Fällen könnte Bestimmen Donorzelle Engraftment und HSC Funktion schwierig sein als Donor-spezifische Zelloberflächenmarker nicht zugänglich.
Mit Y-Chromosom-spezifischen DNA-Sonde, um die Donor männlichen Zellen durch Southern-Blot in sex-mismatched Knochenmarktransplantation erkennen wurde zuerst von Dr. Miwa der Gruppe 6 entwickelt. Dann wurde ein Echtzeit-PCR zur geschlechtsbestimmenden Bereich Y festgestellt eine genaue und hochspezifische Methode ma quantifizieren seinle fetalen Zellen im mütterlichen Blut System 7. Dieses Konzept wurde von Dr. Schwarzenbergers Gruppe für die Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Technik in einem murinen Knochenmark-Transplantation Modell Donorzelle Engraftment 8 bestimmen angepasst. Wir weiter diese Methode für die Messung der Donorzelle Transplantation in FVB / NJ Maus Knochenmarktransplantation Modell modifiziert. Dieses Verfahren wird derzeit intensiv in unserer Gruppe für die Untersuchung der Rolle von Pim1 Kinase in HSC Biologie genutzt.
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Protocol
Ein. Bone Marrow Zellisolation
- Einschläfern männlichen Spenders FVB / NJ Mäusen und weibliche FVB / NJ Mäusen mit CO 2-Methode durch Genickbruch folgte. Die weiblichen FVB / NJ Knochenmarkzellen als wettbewerbsfähigen Zellen verwendet werden.
- Verwenden Sie kleine Schere und Pinzette, sezieren Sie Oberschenkel und tibiaes von Mäusen und legen Sie sie in einem 60 mm Gewebekulturschale mit 6 ml eiskaltem RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS. Verwenden Kimwipe Gewebe Muskeln und anderen Geweben zu entfernen. Schneiden Sie die beiden Enden jedes Knochens Welle in die Schüssel.
- Verbinden Sie das Ende des Knochens mit 23G Nadel auf 3 cc Spritze spülen Knochenmark mit RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS in die Schüssel. Disaggregieren Knochenmark Gewebe durch wiederholte Bestrebungen mit der gleichen Nadel. Übertragen der Zellsuspension zu 15 ml-Zentrifugenröhrchen.
- Abzentrifugieren der Zellen für 5 min bei 400 × g, Entfernen des Überstandes werden die Zellen in 1 ml Raumtemperatur Erythrozyten-Lyse-Puffer (155 mM potassium Bicarbonat, 10 mM Ammoniumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH = 7,4) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min fügen 5-10 ml RPMI 1640 mit 5% Hitze-inaktiviertem FBS.
- Führen Sie die Zellen durch eine Zelle Sieb. Sammeln des Durchflusses durch ein neues Röhrchen. Spindown für 5 min bei 400 x g beträgt. Entfernen Sie den Überstand; das Zellpellet sollten keine rote Farbe. Das Fehlen von roten Farbe eine vollständige Entfernung von roten Blutkörperchen. Zellpellet in 10 ml RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS. Vorsichtig vortexen, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension ist völlig einheitlich. Einen aliquoten und zählen Sie die Zellen in einem Hämazytometer. Berechnen Sie, wie viel Volumen der Zellen für Knochenmarktransplantation und aliquoten genug Zellen benötigt und mischen männlichen Spenderzellen mit Konkurrenten weiblichen Zellen bei einem Verhältnis von 5:2. Spindown für 5 min bei 400 × g, mit PBS gewaschen, in PBS resuspendieren mit der Endkonzentration von Donorzellen mit 5 × 10 6 / ml und Kompetitor Zellen bei 2 × 10 6
2. Competitive Bone Marrow Transplantation
- Bestrahlen weiblichen Empfängermäuse (8-12 wks alt) mit 137Cs Gammastrahlung Strahlers bei einer Einzeldosis von 11Gy 4-6 Std. vor Knochenmarktransplantation.
- Legen Sie die bestrahlten weiblichen Mäusen in einem Maus-Verzögerer. Injizieren des gemischten Donor und Kompetitor-Zellen über die Schwanzvene in 0,1 ml Gesamtvolumen, so dass jede Maus 5 x 10 5 Spenderzellen und 2 × 10 5 Kompetitor Knochenmarkszellen empfängt.
3. Probenentnahme
Paare Wochen nach Knochenmarktransplantation, sammeln peripheren Blutproben (~ 50 ul) von weiblichen Empfängermaus durch retro-orbitale Blutung unter Narkose Zustand. Die Proben werden in EDTA beschichtete Röhrchen gesammelt. BM Proben kann auch am Ende des Experiments gesammelt werden, in der Regel von mindestens 4 Monaten nach der Transplantation, mit denselben Verfahren wie vorangegangenen beschrieben (Schritt 1), in der Regel 20-40%1 Tibia BM-Zellen sind genug, um genügend DNA-Menge machen. Blut oder BM Proben aus gleichaltrigen normalen weiblichen und männlichen Mäusen werden auch gesammelt, um Standardkurve vorbereiten.
4. Isolierung genomischer DNA
- Add 4 × Volumen von Raumtemperatur RBC Lysispuffer (~ 200 ul) in jede Blutprobe. Gut mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. 1 ml PBS, dann drehen bis die meisten der lysierten RBC entfernen.
- Isolieren Sie DNA mit einem Blut-DNA Extraktions-Kits (QIAmp DNA Blood Extraction Kit). Vorwärmen der Elutionspuffer (AE) bei 37 ° C, um die Ausbeute des eluierten DNA verstärken. Männliche und weibliche DNAs für Standard-Kurve ähnlich isoliert.
- (Optional) Genomische DNA kann weiter gereinigt werden oder konzentriert mit EtOH Präzipitationsverfahren in Gegenwart von 3 M Natriumacetat (pH = 5,5). Die DNA-Pellets werden dann in 40-50 ul destilliertem Wasser zur Analyse resuspendiert sofort oder bei -20 ° C für zukünftige Verwendung.
- Messen Sie die DNA konzentration mit Nanodrop ND-1000-Spektren Photometer. Proben mit OD 260/280 zwischen 1,8-2,0 für die weitere Analyse verwendet.
- Verdünnen DNA mit DNase freie H 2 O in einem Gesamtvolumen von 50 ul 4ng/μl.
5. Standardkurve Vorbereitung
Verdünnte männlichen und weiblichen DNA DNA mit einer Konzentration von 4 ng / pl, und stellen die DNA-Mischung gemäß den Tabelle1
| % Der männlichen DNA in Female Hintergrund | Volumen (ul) 4ng/μl männliche DNA | Volumen (ul) 4ng/μl weibliche DNA | Gesamtvolumen (ul) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabelle 1. Probenvorbereitung für die Standardkurve. Normale männliche und weibliche FVB / NJ Mäuse im Alter von 8-12wks geopfert wurden. Blood and BM-Zellen wurden gesammelt. DNAs aus männlichen und weiblichen Zellen Zellen wurden isoliert und erneut suspendiert in einer Konzentration von 4ng/μl. Die männlichen und weiblichen DNAs wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt, um die DNA-Standardprobe Mischungen erzeugen.
6. Echtzeit-PCR
- Richten Sie die PCR-Reaktion Platte durch Mischen SYBR Green supermix Reagenz mit Primer und genomische DNA. Das Reaktionsvolumen (20 ul) enthält 400 nM von jedem Primer und 5 ul Blutkörperchen genomische DNA (4ng/μl x5 ul = 20 ng) in jeder Reaktion. DNA samples und Standards wurden in dreifacher Ausführung gesetzt. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 2 gezeigt.
| Gene Namen | Vorwärts | Umkehren |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabelle 2. RT-PCR-Primersequenz für murines und Bcl2 Zfy1.
- Führen PCR-Reaktion mit Biorad iQ5 PCR-Maschine mit den folgenden Bedingungen: 95 ° C, 3 Min., 42 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 10 sec, 58 ° C für 25 sec und 72 ° C für 15 s, durch ein Schmelz-Kurve folgt fort.
- Erhalten Zyklus Schwelle (Ct)-Werte von Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition Optical System. Calculate ACt (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct Bcl2) Wert und Zfy1 Expressionsniveau wird als der Wert von 2-δ Ct berechnet.
- Stellen Standardkurven für jede Reaktion Serie mit 2-ACt Lesung aus bekannten männlichen / weiblichen Standard-Mischungen. Die Standardkurven werden durch Auftragen der mittleren von 2-ACt Wert Triplikaten dem bekannten% männlich-DNA im Gemisch mit linearen Regression Beschlag erzeugt.
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Representative Results
Abbildung 1 und 2 zeigten Beispiele von Standard-Kurven mit Mittelwerten von 2-ACt gegen Prozentangaben männlicher DNA. 1A zeigten spezifische Schmelztemperatur für Bcl2 und Zfy1 Amplikons bei 78,5 ° C und 88,5 ° C lokalisiert sind. Bcl2 wird als Referenz-Gen, um die Gesamtmenge der geladenen DNA in jeder PCR-Reaktion eingesetzt zu normalisieren. Bcl2 Amplifikationskurven (Log Ansicht) für jede Standardprobe miteinander unabhängig von männlichen DNA-Konzentration verschmelzen, was anzeigt gleichen Menge von geladenen DNA (1B). Jedoch Zfy1 Amplifikation Linkskurve mit zunehmender Menge an männlichen DNA in der Probe (1C) migriert. Um unsere Methode zu validieren, testeten wir männlichen Donorzelle Verpflanzung in transplantierten Mäusen, die BM-Zellen von WT vs Pim Dreifach-Knockout (TKO) Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation. Beide peripheren Blut (6wks) und BM Proben (16wks) w ere analysiert. HSCs aus Pim TKO Mäuse haben Mängel bei der Wiederherstellung der letal bestrahlten Mäusen (An, N et al., Manuskript in Überarbeitung). Wie erwartet, hatten Empfängermäuse mit Pim TKO Zellen transplantiert einen viel niedrigeren Prozentsatz der männlichen Zellen im Vergleich zu Mäusen, die mit WT-Zellen (Abb. 3) transplantiert.
Abbildung 1. (A) Repräsentative Schmelzkurve von mehreren Proben mit unterschiedlichen männliche DNA Prozentsätze. Der Peak bei 78,5 zeigt Verstärkung Bcl2, während der Peak bei 88,5 ° C zeigt Verstärkung ZFY-1. Repräsentative Verstärkungskurve von mehreren Proben mit unterschiedlichen männliche DNA Prozentsatz für Bcl2 (B) und Zfy1 (C), Ct: Zyklus Schwelle.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. RT-PCR Standardkurve für männliche DNA Prozentsatz. Proben (20 ng DNA in 20 ul Gesamtvolumen) der männlichen und weiblichen DNA-Mischungen aus Knochenmark-Zellen erhalten wurden, wurden für die RT-PCR-Protokoll, wie in beschrieben, verarbeitet. Die Mittelwerte der ACt (Ct-Ct Zfy1 Bcl2) für einzelne Proben berechnet und 2-δ Ct (Y-Achse) gegen männliche DNA aufgetragen Prozentsatz (X-Achse) (Bereich von 0,2% bis 100%) mit linearer Regression Armatur. R2 stellt die Bestimmtheitsmaß.
Abbildung 3. Competitive Knochenmarktransplantation Erfahrungriments. 5 x 10 5 insgesamt BM-Zellen von männlichen WT oder Alter abgestimmt männlichen Pim dreifachen KO (TKO) Mäusen zusammen mit 2 x 10 5 weiblichen Konkurrenten Knochenmarkszellen wurden in bestrahlte weiblichen Gastgeber transplantiert. Peripheren Blut (PB) Chimärismus nach 6 Wochen und BM Chimärismus bei 16 wks nach der Transplantation wurden nach dem Prozentsatz der männlichen DNA mittels RT-PCR geschätzt wie im Protokoll verschrien (* p <0,05, ** P <0,01).
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Discussion
Das Ziel unserer aktuellen Studie ist es, dem Publikum einen PCR-basierten Technik Donorzelle Transplantation in einem kompetitiven murine Knochenmark-Transplantation Modell zu quantifizieren. Mehrere Studien haben berichtet mittels RT-PCR, um Spenderzellen in der Transplantationsmedizin Modelle 9-10 zu erkennen. Dr. Schwarzenberger Die Gruppe entwickelte zunächst eine murine Knochenmark-Transplantation Modell mit real-time PCR zu amplifizieren y-Chromosom-spezifischen 8. Diese Methode wurde verwendet, um Gli-1-Funktion in HSC-Aktivität 11 studierst. Wir haben dann außerdem das Protokoll modifiziert und eine detaillierte Schritt-für-Schritt Versuchsprotokoll in visualisierten Format. Die visualisierte Darstellung unseres Protokoll ermöglicht Publikum unser Protokoll leicht folgen. Wir haben auch unsere PCR-Ergebnisse unter Verwendung genomischer DNA aus BM Proben vs DNA aus dem peripheren Blut verglichen. Die Spender Transplantation Daten von BM und Blutproben sind grundsätzlich konsistent, wurde jedoch in der Regel weniger Variation in BM Proben gefunden. Dies istwahrscheinlich aufgrund zurückgebliebener Hämoglobin nach RBC-Lyse in dem peripheren Blut, die die Reinheit / Qualität der genomischen DNA in den Blutproben kann kompromittieren.
Es gibt mehrere Vorteile im PCR-basierten Technik Donorzelle Engraftment quantifizieren. Erste, unsere Technik kann in den meisten Laboratorien durchgeführt werden. Es besteht keine Notwendigkeit für spezielle und teure Geräte außer Echtzeit-PCR-Maschine. Wir weiteren PCR-Reaktion Komponente modifiziert und SYBR Green supermix statt Taqman. Diese Änderung weiter reduziert die Kosten und Aufwendungen, wie wir die Fluoreszenz-markierten Sonde zu beseitigen. Zweitens ist unsere Technik zuverlässig und hoch reproduzierbar. Wir nutzten die Bcl2 Referenz-Gen, um die gesamte DNA-Menge zu DNA-Quantifizierung Kit Gegensatz zu normalisieren. Bcl2-Gen wurde verwendet, weil: 1) das Gen nicht auf Y-Chromosom lokalisiert. Daher wird seinen Ausdruck nicht von männlichen Spenders Engraftment betroffen. 2). Bcl2 nicht unter den aktuellen Bedingungen der Transplantation geregelt. Als shEigene in 1, erzeugt Bcl2-Gen eine zuverlässige und hochkonsistente Steuerung für Gesamt-DNA Belastung unabhängig von geladenen männlichen DNA-Menge. Zfy1 ist ein Zinkfinger-Gen innerhalb Testis bestimmenden Region 12 und ist auf dem Y-Chromosom lokalisiert. Es wurde berichtet, dass das Niveau der Genexpression Zfy1 gut entspricht der Menge an männlichen Zelle DNAs in einem Maus-Modell 8 Transplantation. Drittens ist unsere PCR basierende Technik sehr empfindlich und kann Donorzelle Transplantation bei <1% zu erkennen. Weiterhin können für lange Zeit Proben für eine spätere Analyse gespeichert werden. Im Gegensatz dazu erfordert die herkömmliche Durchflusszytometrie-basiertes Verfahren unmittelbaren Probenprozessierungsvorrichtung. Schließlich ist unsere Technik Mausstamm unabhängig und kann für genetische Hintergrund, dass gut definierte Oberfläche Marker fehlt zu trennen Spenderzellen aus Empfänger-Zellen verwendet werden. Dies ist der wichtigste Vorteil dieser Methode.
Im Rahmen unserer aktuellen experimentellen Bedingung (Donor / competitoder Verhältnis 5/2 ist), beobachteten wir etwa 80-90% Spender Transplantation nach 16 Wochen mit der PCR-Methode. Unsere Daten sind durchaus vergleichbar mit herkömmlichen, Durchflusszytometrie based-Methode, die ~ 95% Donorzelle Transplantation bei 16 Wochen nach der Transplantation mit Spender (CD45.2) / Teilnehmer (CD45.1) Verhältnis bei 4:1 2 zeigte. Im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren, die Zelloberflächenmarker nutzt, um Spenderzellen in Empfängermäuse detektieren, ist der Hauptnachteil unser Verfahren die Unfähigkeit, die Verpflanzung in verschiedenen Subpopulationen von Blutzellen, wie in B-Zellen, T-Zellen oder Granulozyten analysieren. Jedoch, falls erforderlich, ist es möglich, jede Population von Zellen zu sammeln unter Verwendung Zellsortierung Technik und dann unterliegt die Proben für RT-PCR, um Donorzelle Beitrag in jeder Zelle Population zu bestimmen. Da die Donorzelle bezogen auf Engraftment Standardkurve berechnet wurde, ist die Probe Auslesen völlig abhängig von der Steigung und y-Achsenabschnitt der Standardkurve. Es ist möglich, dass wir off-Bereich rea bekommendout (dh über 100% der Transplantation). Allerdings können diese "falsch-positive oder falsch-negative" Ergebnisse vermieden werden, wenn: 1) die DNA-Isolierungsverfahren für getesteten Proben und Standardkurve Proben identisch sind, und 2) die gewählte Reihe von Standard-Kurve ist in der Nähe der erwarteten Probe Auslesung. Zusätzlich, da Unterschiede in jeder PCR-Reaktion und bei der Kalibrierung Status PCR-Maschine sein kann, sollte Standardkurve Proben in jedem PCR-Platte aufgenommen werden, um Variationen zwischen jedem PCR-Reaktion zu vermeiden.
Schließlich haben wir unsere Technik mit unseren Pim dreifachen KO Mäusen validiert. In Übereinstimmung mit früheren Bericht 13, fanden wir, dass Spender HSCs aus Pim Triple KO Mäusen defekt Wiederherstellung letal bestrahlten Empfängermäuse sind.
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Disclosures
Wir haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Charles Greenberg für die Nutzung seiner Real-time PCR-Maschine. Diese Arbeit wird durch MUSC Hollings Cancer Center Gründerfonds, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103.780-01A1 und NIH 3P30CA138313-01S3 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder andere Mittel Agenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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