Summary
קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.
Abstract
מודלי השתלת מח עצם Murine לספק כלי חשוב במדידה סלולרית פונקציות hematopoietic גזע (HSC) וגנים הקובעים / מולקולות המווסתות HSCs. במערכות מודל השתלות אלה, הפונקציה של HSCs נקבעת על ידי היכולת של תאים אלה נקלטים ולגבש מחדש עכברי נמען קטלני מוקרנים. בדרך כלל, התרומה / engraftment התא התורם נמדד על ידי נוגדנים לחלבונים בתא שטח תורם ספציפי באמצעות cytometry זרימה. עם זאת, שיטה זו תלויה במידה רבה על הספציפיות ואת יכולתו של סמן תא השטח כדי לבדל תאי תורם המופקים מתאי נמען מקורם-, אשר עשוי שלא להיות זמין עבור כל הזנים של העכברים. בהתחשב ברקע השונה של זני עכבר מהונדס גנטי בשוק, משטח זה תא / זרימת cytometry שיטה מבוססת יש מגבלות משמעותיות במיוחד בזני עכברים שאין סמנים מוגדרים היטב על פני שטח לתורם בתאים נפרדים מcongenic הנמען ceLLS. כאן, אנו מדווחים טכניקת PCR מבוססת כדי לקבוע engraftment / תרומת התא התורם בעכברי השתלה. אנו הושתלנו HSCs מח עצם התורם גברים לנקבות העכברים congenic קטלני מוקרנים. דגימות דם היקפיות נאספו בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. דגימות מח עצם התקבלו בתום הניסויים. הדנ"א הגנומי היה מבודד וגן כרומוזום Y הספציפי, Zfy1, הוגבר שימוש בזמן אמת PCR כמותית. Engraftment של תאים זכריים תורם המופקים בעכברי הנמען הנשים חושב על עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של גברי DNAs לעומת נקבה. Bcl2 שמש גן התייחסות לנרמל את כמות הדנ"א המוחלטת. הנתונים שלנו הציעו כי גישה זו אמינה קובעת engraftment תא התורם ומספקת שיטה יעילה, פשוטה אך במדידת הכינון מחדש של תאי hematopoietic במודלים של השתלת מח עצם Murine. השיטה שלנו יכולה להיות מבוצעת באופן שגרתי ברוב המעבדות כי אףציוד יקר כגון cytometry זרימה נדרש.
Introduction
מודל Murine מח עצם (BM) השתלה פותח לראשונה ב -1960 1. דגם זה כבר נעשה שימוש נרחב לחקר התא תורם גזע hematopoietic (HSC) בביולוגית עכבר נמען מארח. מודל השתלת מח העצם Murine ספק לנו ידע רב ערך על פונקציות HSC והרגולציה שלהם והכרחי במחקר HSC. מודל allogeneic השתלת מח עצם כמו C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d או מודל ההשתלה congenic כמו C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 משמש במעבדות רבות כדי ללמוד את תפקוד הגן על פעילות HSC 2, השפעה של טיפול תרופתי על תפקוד 3 או השתלת HSC מחלות נלוות כגון מחלת שתל נגד מארח (GVHD) 4.
סמנים בתא שטח כגון haplotype MHC או CD45.1 משמשים בדרך כלל לתאים מייחדים תורם הנגזרים מתאי נמען מקורם-. C57Bl/6J H2B, CD45.2 H2d וB6.SJL CD45.1 הם זני העכבר הנפוץ ביותר בהשתלת מח עצם, כי תרומת התא התורם ניתן להעריך בקלות על ידי הזרימה cytometry מדידת CD45.1 לעומת CD45.2 או H2B לעומת H2d. עם זאת, זנים רבים אחרים, כגון FVB / ניו ג'רזי 5 ו C3H הם גם משמשים לעתים קרובות כדי לייצר מהונדסים בהנדסה גנטית או עכברים בנוקאאוט. עכברים אלו ניתן backcrossed לקו לדה ומתוחזק ברקע מעורב גנטי / MHC. במקרים אלה, קביעת engraftment תא תורם ותפקוד HSC יכולה להיות קשה כסמני שטח ספציפיים בתאים תורמים לא יהיו זמינים.
באמצעות בדיקת כרומוזום Y-DNA ספציפית כדי לזהות את תאי תורם גברים על ידי כתם דרומי בהשתלת מח עצם מין חוסר התאמה שפותח לראשונה על ידי הקבוצה של ד"ר Miwa 6. ואז, PCR בזמן אמת לקביעת מין האזור Y-נמצא שיטה מדויקת וספציפית מאוד לכמת maתאים עובריים le במערכת הדם האם 7. רעיון זה אומץ על ידי קבוצתו של ד"ר Schwarzenberger לפיתוח של טכניקה בזמן אמת PCR במודל עכברי השתלת מח עצם כדי לקבוע engraftment התא התורם 8. אנחנו שונים בשיטה זו נוספת למדידת engraftment תא התורם במודל FVB / ניו ג'רזי עכבר השתלת מח עצם. שיטה זו כיום שימוש נרחב בקבוצה שלנו ללימוד התפקיד של Pim1 קינאז בביולוגית HSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד תאי מח עצם
- להרדים תורמים עכברי FVB / ניו ג'רזי ועכברים ממין נקבת FVB / ניו ג'רזי באמצעות שיטת 2 CO ואחרי עקירת צוואר רחם זכרים. התאים הנקביים FVB / ניו ג'רזי מח העצם ישמשו כתאים תחרותיים.
- השתמש במספריים ומלקחיים קטנים, לנתח את עצמות ירך וtibiaes מעכברים ולמקם אותם בצלחת תרבית רקמה 60 מ"מימ המכילה 6 מ"ל קר כקרח RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. השתמש רקמת kimwipe להסיר שרירים ורקמות אחרות. חותך את שני הקצוות של כל פיר עצם בצלחת.
- חבר את הקצה של העצם עם מחט 23 ז במזרק סמ"ק 3, לשטוף את מח עצם עם RPMI1640 עם FBS המומת חום 5% למנה. Disaggregate רקמות מוח עצם על ידי שאיפות חוזרות ונשנות תוך שימוש באותה המחט. להעביר את השעית התא לצינור צנטריפוגה מ"ל 15.
- ספין למטה התאים למשך 5 דקות ב 400 XG, להסיר את supernatant, resuspend התאים ב1 מ"ל של חיץ טמפרטורת חדר תאי דם אדום תמוגה (155 mM pיקרבונט otassium, כלוריד אמוניום 10 מ"מימ, 0.1 מ"מ של EDTA, pH = 7.4) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ואז להוסיף 5-10 מ"ל של RPMI 1640 עם FBS המומת חום 5%.
- להעביר את התאים דרך מסננת תא. לאסוף את הזרימה דרך לצינור חדש. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 x גרם. הסר את supernatant; תא הגלולה לא תכיל כל צבע אדום. היעדר הצבע אדום מציין הסרה מלאה של תאי דם אדומים. Resuspend התא גלול ב 10 מ"ל של RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. מערבולת בעדינות כדי לוודא השעית התא היא אחידה לחלוטין. קח aliquot וספירת התאים בhemacytometer. לחשב כמה נפח של תאים הנחוצים להשתלת מח עצם ומספיק תאי aliquot ולערבב תאי תורם גברים עם תאים נקביים מתחרים ביחס 05:02. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 XG, לשטוף עם PBS, resuspend ב PBS עם הריכוז הסופי של תאי תורם ב5 × 10 תאים 6 / מ"ל ומתחרה ב2 × 10 6
2. השתלת מח עצם תחרותית
- עכברים ממין נקבה להקרין נמען (8-12 wks גיל) עם רדיאטור קרני גמא 137Cs במנה אחת של 4-6 שעות 11Gy לפני השתלת מח עצם.
- הנח את נקבות עכברים המוקרנים בעוצרים עכבר. הזרק תורם המעורב ותאים מתחרים דרך וריד זנב ב0.1 מ"ל של נפח באופן שכל עכבר מקבל 5 × 10 5 תאים תורמים ו2 × 10 5 תאי מח עצם מתחרה מוחלט.
3. אוסף מדגם
שבועות זוגות לאחר השתלת מח עצם, לאסוף דגימות דם היקפיות (~ 50 μl) מעכבר נמען נשי על ידי דימום רטרו מסלולית בתנאי הרדמה. דגימות נאספות לתוך צינורות מצופים EDTA. דגימות BM יכולות גם להיות שנאספו בסוף הניסוי, לפחות 4 חודשי השתלת הודעה בדרך כלל, עם את הנוהל כמו שתואר קודם (שלב 1);% בדרך כלל 20-40 של1 תאי BM שוקה הם מספיק לעשות מספיק כמות של ה-DNA. דגימות דם או BM מגיל עכברים נורמלים נקביים וזכריים מתאימים גם נאסף להכין עקומת סטנדרט.
4. בידוד הדנ"א הגנומי
- הוסף 4 × נפח של טמפרטורת חדר RBC תמוגה חיץ (~ 200 μl) לכל דגימת דם. מערבב היטב ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של PBS, אז ספין למטה כדי להסיר את רוב RBC lysed.
- בודד דנ"א באמצעות ערכת חילוץ דנ"א דם (ערכת חילוץ דם DNA QIAmp). החיץ טרום החם elution (ע"א) על 37 מעלות צלזיוס כדי לשפר את התשואה של דנ"א eluted. DNAs זכר ונקבה לעקומת סטנדרט מבודד באופן דומה.
- (אופציונלי) הדנ"א הגנומי יכול להיות מטוהר נוסף או מרוכז בשיטת משקעי EtOH בנוכחות נתרן יצטט M 3 (pH = 5.5). את כדורי DNA מכן resuspended במים מזוקקים 40-50 μl לניתוח באופן מיידי או מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש עתידי.
- מדוד את ה-DNA concentration עם פוטומטר הספקטרום Nanodrop ND-1000. דגימות עם OD 260/280 בין 1.8-2.0 משמשות לניתוח נוסף.
- דלל DNA עם DNAase החופשי H 2 O ל4ng/μl בהיקף כולל של 50 μl.
5. הכנת עקומת סטנדרט
דלל DNA הגברי והנשי DNA לריכוז של 4 ng / μl, ולהפוך את תערובת ה-DNA על פי הטבלה 1
| % של ה-DNA הגברי ברקע נקבה | נפח (μl) של ה-DNA הגברי 4ng/μl | נפח (μl) של ה-DNA הנשי 4ng/μl | נפח כולל (μl) |
| 0.2 | 1 | 499 | 500 |
| 0.5 | 1 | 199 | 200 |
| 2.5 | 5 | 195 | 200 |
| 12.5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87.5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
טבלת 1. הכנת דוגמאות לעקומת סטנדרט. עכברי זכרים ונקבה רגילים FVB / ניו ג'רזי בגיל 8-12wks הוקרבו. תאי דם וBM נאספו. DNAs מתאים זכריים ותאים נקביים היינו מבודד ומחדש הושעה-בריכוז של 4ng/μl. את DNAs הזכר והנקבה היה מעורב ביחסים שונים על מנת ליצור את התערובות הסטנדרטיות מדגם DNA.
6. בזמן האמת PCR
- הגדר את צלחת תגובת PCR על ידי ערבוב ירוק מגיב SYBR supermix עם פריימרים וDNA גנומי. נפח הריאקציה (20 μl) מכיל 400 ננומטר של כל מאיץ ו5 μl של הדנ"א הגנומי תאי דם (μl X5 4ng/μl = 20 ng) בכל תגובה. דנ"א sampהלס וסטנדרטים הוקמו בשלושה עותקים. הרצפים של primers מוצגים בטבלה 2.
| שם גן | קדימה | הפוך |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
טבלת 2. רצף פריימר RT-PCR לBcl2 העכברי וZfy1.
- מבצע תגובת PCR שימוש במכשיר ה-PCR Biorad iQ5 בתנאים הבאים: 95 ° C 3 דקות, 42 מחזורי ההגברה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואחרי התכה עקומה צעד.
- השג סף ערכי מחזור (CT) על ידי מערכת Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition אופטית. החישוב δCt (CT Zfy1 </ Sup>-CT Bcl2) ערך, ורמת הביטוי Zfy1 מחושבת כערך של Ct 2-δ.
- להקים עקומות סטנדרטיות עבור כל סדרת תגובה באמצעות קריאה 2-δCt מתערובות ידועות גברים / נשים רגילות. העקומות הרגילות נוצרות על ידי קשירת קשר ערך הממוצע של 2-δCt של triplicates ל% DNA הגברי הידוע בתערובת עם הולם רגרסיה לינארית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 ו 2 הראו דוגמאות לעקומות סטנדרטיות זממו עם ערכים ממוצעים של 2-δCt נגד אחוזי DNA הגברי. האיור 1A הראה טמפרטורת התכה ספציפית לBcl2 וZfy1 amplicons מותאם ב78.5 המעלות צלזיוס ו88.5 ° C, בהתאמה. Bcl2 משמש כגן התייחסות לנרמל את הסכום הכולל של ה-DNA הטעון בכל תגובת PCR. Bcl2 עקומות הגברה (התחבר תצוגה) לכל דגימה סטנדרטית להתמזג עם כל עצמאי שני של ריכוז ה-DNA גברי, המציין כמות שווה של דנ"א טעון (1B איור). עם זאת, עקומת ההגברה Zfy1 הגרה לשמאל עם כמות הולך וגדלה של ה-DNA הגברי במדגם (התרשים 1C). כדי לאמת את השיטה שלנו, בדק engraftment תא התורם גברי בעכברים מושתלים שקבלו מתאי BM WT לעומת PIM נוקאאוט המשולש עכברים (TKO) בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. שניהם דם היקפי (6wks) ודגימות בע"מ (16wks) w פה מנותח. HSCs מעכברי PIM TKO יש פגמים בבנייה מחדש של עכברים מוקרנים (קטלני, N et al., כתב יד תחת עדכון). כצפוי, עכברי נמען מושתלים עם תאי PIM TKO היה אחוז נמוך בהרבה של תאים זכריים בהשוואה לעכברים שהושתלו בתאי WT (איור 3).
איור 1. () עקום היתוך נציג מדגימות מרובות עם אחוזי DNA גברים שונים. השיא ב78.5 מציין הגברה של Bcl2, בעוד השיא ב88.5 ° C מציין הגברה של Zfy-1. עקומת נציג הגברה מדגימות מרובות עם אחוז שונה של DNA לזכר Bcl2 (B) וZfy1 (C), CT: סף מחזור.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. עקומת RT-PCR הסטנדרטי עבור אחוז DNA גברי. דגימות דנ"א (20 ננוגרם בנפח כולל 20 μl) של תערובות הדנ"א זכר ונקבה המתקבלות מתאי מוח עצם עובדו לRT-PCR כמתואר בפרוטוקול. הערכים הממוצעים של δCt (CT Zfy1-CT Bcl2) לדגימות בודדות חושבו וCt 2-δ (ציר ה-Y) שזממו נגד אחוז DNA הגברי (ציר ה-X) (בטווח שבין 0.2% עד 100%) עם רגרסיה לינארית הולם. R2 מייצג את המקדם של נחישות.
איור 3. התחרותי מח עצם ההשתלה experiments. 5 10 5 תאי BM כלל x מWT או גיל הזכר המתאים פים המשולשים KO הגברי (TKO) עכברים יחד עם 2 x 10 5 תאים נקביים מתחרת מח עצם הושתלו מארחים נשיים מוקרנים. דם chimerism ההיקפי (PB) בגיל 6 שבועות וchimerism BM ב 16 wks הודעת ההשתלה נאמדה על ידי אחוז של ה-DNA הגברי על ידי RT-PCR כגינה בפרוטוקול (* p <0.05, ** p <0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי שלנו היא לספק לקהל טכניקה מבוססת PCR לכמת engraftment תא התורם במודל תחרותי עכברי מח עצם השתלה. מספר מחקרים שדיווחו על השימוש בRT-PCR לזיהוי תאי תורם במודלי השתלה 9-10. קבוצתו של ד"ר Schwarzenberger פותחה לראשונה מודל עכברי השתלת מח עצם באמצעות PCR בזמן אמת כדי להגביר כרומוזום Y ספציפי 8. שיטה זו משמשת ללמוד פונקצית Gli-1 בפעילות HSC 11. אז אנחנו שונים נוספים הפרוטוקול וספקנו פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד ניסיוני בתבנית חזותית. המצגת החזותית של הפרוטוקול שלנו מאפשרת לצופים לעקוב אחר פרוטוקולנו בקלות. כמו כן, השוו תוצאות PCR שלנו באמצעות הדנ"א הגנומי מדגימות DNA לעומת BM מדם היקפי. נתוני engraftment התורמים מבע"מ ודגימות דם הם בעצם עולים בקנה אחד, עם זאת, בדרך כלל פחות וריאציה נמצאה בדגימות BM. זהוסביר להניח שסיבה למוגלובין הנותרת לאחר תמוגה RBC בדם ההיקפי שעלולה לפגוע בטוהר / איכות של הדנ"א הגנומי בדגימות הדם.
ישנם מספר יתרונות עם טכניקת PCR המבוסס לכמת engraftment תא התורם. ראשית, הטכניקה שלנו יכולה להתבצע ברוב המעבדות. אין צורך בציוד מיוחד ויקר אחרים ממכונה בזמן אמת PCR. אנחנו שונים נוספים מרכיב תגובת PCR ושימוש SYBR הירוק supermix במקום TaqMan. שינוי זה מפחית עוד יותר את העלויות והוצאות כפי שאנו מבטלים את חללית ניאון שהכותרת. שנית, השיטה שלנו היא אמינה ולשעתקו מאוד. אנחנו השתמשנו בגן התייחסות Bcl2 לנרמל את כמות הדנ"א בניגוד המוחלטת לערכת quantitation-DNA. גן Bcl2 שמש כי: 1) גן זה אינו נמצא על כרומוזום ה-Y. לכן, הביטוי שלו אינו מושפע מengraftment התא התורם הגברי. 2). Bcl2 אינו מוסדר בתנאי ההשתלה הנוכחיים. כshלבד באיור 1, Bcl2 גן מייצר שליטה אמינה ועקבית ביותר לטעינת DNA כוללת עצמאית של כמות הדנ"א גברית טעונה. Zfy1 הוא גן אצבע אבץ בתוך אשך קביעת האזור 12, והוא ממוקם על כרומוזום Y. זה כבר דווח כי רמת ביטוי הגן של Zfy1 תואם היטב את כמות DNAs תא הזכרי במודל עכבר השתלת 8. שלישית, הטכניקה המבוססת PCR שלנו היא רגישה מאוד, ויכולה לזהות engraftment תא התורם ב< 1%. יתר על כן, דגימות ניתן לאחסן לזמן רב לניתוח מאוחר יותר. לעומת זאת, בשיטה הקונבנציונלית זרימת cytometry המבוססת דורשת עיבוד מדגם מיידי. לבסוף, הטכניקה שלנו היא עכבר זן עצמאי ויכולה לשמש לרקע גנטי שחסרי סמני שטח מוגדר היטב לתורם בתאים נפרדים מתאי נמענים. זהו היתרון החשוב ביותר של שיטה זו.
תחת תנאי הניסוי הנוכחיים שלנו (תורם / competitאו יחס הוא 5/2), שנצפינו סביב 80-90% engraftment תורם ב16 שבועות בשיטה ה-PCR המבוססת. הנתונים שלנו הם די דומים עם שיטה מבוססת קונבנציונלית, זרימת cytometry שהראה ~ 95% engraftment תא תורם בהשתלת 16 שבועות הודעה עם תורם (CD45.2) / מתחרה (CD45.1) יחס ב04:01 2. בהשוואה לשיטה הקונבנציונלית שמשתמשת בסמן תא שטח כדי לאתר תורם בתאים בעכברי נמענים, החסרון העיקרי של השיטה שלנו הוא חוסר היכולת לנתח engraftment באוכלוסיות שונות של תאי דם כגון בתאי B, תאי T או גרנולוציטים. עם זאת, במידת צורך, ניתן לאסוף כל אוכלוסייה של תאים באמצעות טכניקת תא מיון ולאחר מכן נושא את הדגימות לRT-PCR כדי לקבוע תרומת תא תורם בכל אוכלוסייה בתא. מאז engraftment התא התורם חושב על בסיס עקום סטנדרטית, readout המדגם תלוי לחלוטין בשיפוע וחותך y של עקומת סטנדרט. יתכן שאנו עשויים לקבל את ריאת הטווחdout (מעל 100% כלומר engraftment). עם זאת, תוצאות "שליליות חיוביות או שקר השקר" אלה יכולים להימנע אם: 1) נהלי בידוד DNA לדגימות שנבדקו ודגימות עקומת סטנדרט זהים, ו2) הטווח הנבחר של עקומה הסטנדרטית הוא קרוב לreadout המדגם הצפוי. בנוסף, מאחר שייתכן שיש הבדלים בכל תגובת PCR ובמצב הכיול של מכשיר ה-PCR, דגימות עקומת סטנדרט צריכות להיות כלולות בכל צלחת PCR להימנע וריאציות בין כל תגובת PCR.
לבסוף, אנו תוקפים הטכניקה שלנו באמצעות עכברי KO PIM המשולש שלנו. עולה בקנה אחד עם דו"ח קודם 13, מצא כי HSCs התורם מעכברי PIM המשולשים ק.א. פגום בבנייה מחדש של עכברי נמען קטלני מוקרנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מתחרים אינטרסים כספיים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר צ'רלס גרינברג לשימוש במכשיר ה-PCR בזמן האמת שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מרכז לחקר סרטן MUSC הולינגס הפעלת קרן, הולינגס מרכז הסרטן ACS IRG, ASCO Conquer פרס פיתוח קריירת קרן הסרטן, NIH 1K08HL 103780-01A1, וNIH 3P30CA138313-01S3. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות או סוכני מימון אחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
