Summary
Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione in
Abstract
Le nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello versatile per la ricerca biomedica causa della sua conservazione dei geni correlati alla malattia e percorsi così come la sua facilità di coltivazione. Diversi C. modelli di malattia elegans sono state riportate, comprese malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD), che comporta la degenerazione dopaminergica (DA) neuroni 1. Entrambi i transgeni e prodotti chimici neurotossici sono stati utilizzati per indurre DA neurodegenerazione e conseguenti difetti di movimento a Worms, consentendo indagini sulla base della neurodegenerazione e schermi per i geni neuroprotettivi e composti 2,3.
Schermi in eucarioti inferiori come C. elegans forniscono un mezzo efficace ed economico per identificare i composti ed i geni che influenzano la segnalazione neuronali. Schermi tradizionali sono in genere eseguita manualmente e ha ottenuto mediante ispezione visiva, di conseguenza, essi sono ora-consUming e soggetto a errori umani. Inoltre, la maggior attenzione per l'analisi livello cellulare, ignorando locomozione, che è un parametro particolarmente importante per i disturbi del movimento.
Abbiamo sviluppato un sistema di screening microfluidica romanzo (Figura 1) che controlla e quantifica C. locomozione elegans 'utilizzando stimoli di campo elettrico all'interno di microcanali. Abbiamo dimostrato che un campo di corrente continua (DC) può indurre robustamente on-demand locomozione verso il catodo ("electrotaxis") 4. Inversione di polarità del campo fa sì che il verme di invertire rapidamente la sua direzione. Abbiamo anche dimostrato che i difetti nei neuroni sensoriali dopaminergici e altri alterano la risposta nuoto 5. Pertanto, anomalie nella segnalazione neuronali possono essere determinate utilizzando locomozione come read-out. La risposta movimento può essere quantificato con precisione utilizzando una serie di parametri quali la velocità di nuoto, corpo frequenza flessione e tempo di inversione.
4. Questi risultati ci hanno portato a progettare un nuovo dispositivo microfluidica per ordinare passivamente vermi per età e fenotipo 6.
Abbiamo anche testato la risposta dei vermi a impulsi DC e alternata (AC), campi elettrici di corrente. Campi DC pulsate di vari cicli di lavoro effettivamente electrotaxis generati sia in C. elegans e il suo cugino C. briggsae 7. In un altro esperimento, simmetriche campi AC con frequenze che vanno da 1 Hz a 3 KHz immobilizzate vermi all'interno del canale 8.
Realizzazione del campo elettrico in un ambiente microfluidica consente l'esecuzione rapida e automatizzata del test electrotaxis. Questo approccio promette di facilitare schermi genetiche e chimiche ad alto throughput per i fattoriche interessano la funzione neuronale e vitalità.
Protocol
1. Fotolitografia per Mold Fabrication Maestro
- Fare il bagno a 3 pollici wafer di silicio in acetone per 30 secondi e poi metanolo per 30 sec. Risciacquare con dH 2 0 acqua per 5 min.
- Asciugare la superficie del wafer con una pistola ad aria compressa N2. Riscaldare il wafer su una piastra calda a 140 ° C per 2 min.
- Plasma ossidare la superficie del wafer di silicio (1 min, 50 W).
- Spin-coat superficie del wafer con 3 ml SU-8 100 fotoresist (40 sec; 1,750 rpm).
- Pre-cuocere il wafer rivestito su una piastra riscaldante a 65 ° C per 10 min, quindi accelerazione la temperatura fino a 95 ° C in 2 min. Mantenere questa impostazione per un ulteriore 1 hr.
- Allineare una photomask con il motivo canale desiderato. Esporre il resistere a 550-600 mJ / cm 2 di luce UV (350-400 nm). Fotomaschere possono essere progettati in AutoCAD e stampati su un acetato con stampa ad alta risoluzione.
- Post-cuocere il wafer su una piastra riscaldante a 65 ° C per 1 min e 95 ° C per 10 min, rampa tegli temperatura come prima.
- Immergere il wafer in SU-8 soluzione di sviluppo per 10-15 min. Verificare il completamento dello sviluppo mediante risciacquo con isopropanolo. Se compare un precipitato bianco, continuare a sviluppare. Lo stampo master è mostrato in Figura 2A.
2. Litografia soft per Fabrication Microchannel
- Miscelare 35 ml di polidimetilsilossano (PDMS) base di elastomero con 3,5 ml di PDMS agente indurente.
- Mettere lo stampo maestro fabbricato (modello rivolto verso l'alto) e di un wafer di silicio vuoto in piastre di Petri rivestite con un foglio di alluminio.
- Versare 20 ml PDMS prepolimero nel piatto stampo master e 15 ml nel secondo piatto. Eliminare le sacche d'aria sotto i wafer premendo delicatamente su di loro con un applicatore di legno monouso.
- Coprire entrambi i piatti e mettere da parte per un giorno per curare. In alternativa, per la polimerizzazione veloce, rimuovere le bolle d'aria dal PDMS utilizzando degassificante vuoto e poi lasciare i piatti su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2hr.
- Togliere la pellicola e la buccia del PDMS dai wafer.
- Utilizzare la Harris Uni-Core (2,5 mm) a pugni le porte di accesso fluido a entrambe le estremità del canale. Tagliare il canale e vuoto PDMS in strisce di dimensioni simili.
- Caricare il canale, il PDMS striscia in bianco e un vetrino (75 × 25 mm 2) in un ossidante plasma, probabilmente situato in una camera sterile. Esporre a plasma di ossigeno per 40 sec a 40 W di potenza.
- Attaccare il pezzo canale e vetrino a lati opposti della striscia in bianco. Mettere da parte per 2 ore per completare il legame.
- Posizionare il gruppo su un piatto caldo a 120 ° C. Collegare il tubo di plastica (diametro interno 1/32 ", diametro esterno 3/32"), ciascuna di almeno 6 pollici di lunghezza, ai serbatoi punzonati con PDMS pre-polimero. Apporre un connettore di plastica fluidico ad una o entrambe le tube di consentire attaccamento siringa o usare accessori disponibili in commercio.
- Lasciare che il PDMS fissaggio del tubo di curare. Inserire 3 "lunghezze di 22 gauge filo di rame isolato in each serbatoio, tra il tubo di ingresso e il canale, e fissare con PDMS prepolimero. Il prodotto finito è mostrato nella figura 2B.
3. Electrotaxis Experiment
- Collocare il microcanali sulla fase (preferibilmente XY-mobile) di un microscopio con una telecamera montata collegata ad un monitor (Figura 1).
- Collegare l'alimentazione o cavi di uscita dell'amplificatore di elettrodi del microcanali di. Un semplice alimentatore DC è sufficiente se si desidera solo un segnale DC, ma un amplificatore collegato ad un generatore di funzioni permette l'applicazione di impulsi DC e segnali CA pure.
- Collegare il tubo di uscita del microcanali di una siringa monouso. Immergere la bocca del tubo di ingresso nella M9 tampone fisiologico e delicatamente aspirano liquido nel canale applicando una pressione negativa all'interno della siringa (manualmente o utilizzando una pompa a siringa). Quando i tubi di ingresso e di uscita sono entrambe piene di M9, staccare la siringa from del tubo. Livellare entrambi i tubi alla stessa altezza per impedire il flusso idrostatica comandata.
- Applicare una tensione continua al canale e garantire che la resistenza (R = V / I) è di circa 0,6 MW (per una lunga 50 mm, 0.3 mm di larghezza e 0,1 millimetri ~ microcanali profondità).
- Se si è soddisfatti con l'integrità del canale, seguire la procedura per caricare i vermi da una sospensione diluita nel canale.
- Staccare la siringa e idrostatico manipolare il flusso regolando altezza relativa dei neon. Utilizzare questo metodo per posizionare un verme al centro del canale e poi stendere entrambi i tubi piatta alla stessa altezza.
- Impostare la tensione di alimentazione alla tensione appropriata: 4-12 V / cm per gli animali fase L3, 4-10 V / cm per L4S e 2-4 V / cm per i giovani adulti. Attivare il segnale elettrico e permette 1 min di pre-esposizione per il worm per acclimatarsi al campo. Il verme dovrebbe iniziare a muoversi verso il catodo. Quando il minuto è passato, utilizzare la fotocamera per avviare la registrazione.
- Per AC e polsoesperimenti d DC, il campo elettrico reattivo massimo può essere adottato dal ciclo del segnale sopra e frequenza e di servizio può essere modulata come desiderato 7, 8.
- Quando esperimento è finito, rimuovere tutto il liquido (e vermi) dal canale, sciacquarlo con dH 2 0, e lasciare il dispositivo su una piastra riscaldante a 125 ° C per asciugare.
- Estrarre dati locomotore da video registrati manualmente utilizzando NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o software di monitoraggio verme MATLAB-based personalizzato.
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Representative Results
Un video rappresentativo di electrotaxis una wild-type adulto giovane di nematodi e la sua posizione e le uscite di velocità del software di monitoraggio verme sono mostrati in video supplementare 1 e Figura 3. Il software di analisi del movimento stesso non riconosce la direzione di polarità di campo e il tempo di inversione di polarità, anzi, queste informazioni devono essere ottenute dal video di origine. Questo può essere fatto utilizzando una stecca audio o visivo in video o scrivere condizioni sperimentali e manipolazioni.
Dati di velocità Electrotaxis da un set di animali di tipo selvatico (N2) e transgenici (NL5901) sono visualizzati in figura 4. Le NL5901 animali portano geni α-sinucleina umana sotto il controllo di unc-54 (gene miosina catena pesante) promotore. L'espresso α-sinucleina nel corpo muscoli della parete aggregati 9 ed i nostri risultati mostrano che provoca anomalie nel eletrisposta trotactic. La velocità di NL5901 vermi è significativamente più lento di tipo selvaggio. Per tracciare il grafico, abbiamo calcolato la velocità dei singoli worm e tracciati i risultati in un diagramma a riquadri utilizzando il software statistico Minitab ( http://www.minitab.com ). Oltre alla velocità, altri parametri di movimento, come la risposta di giro (tempo necessario per completare l'inversione in risposta al cambiamento di polarità del campo elettrico) e corpo frequenza piegatura (numero medio di onde sinusoidali al secondo), può anche essere analizzato come descritto altrove 5.
Il protocollo electrotaxis funziona meglio con una popolazione sincronizzato, che può essere ottenuta mediante trattamento con una soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio e 4 N di idrossido di sodio in un rapporto in volume 2,3) 10. Tutti i dati presentati qui sono stati ottenuti da popolazioni sincronizzate per escludere età e stadio-dipendente variazione. Anche se abbiamo usato i giovani adulti (69 ore post-L1 a200C), le altre fasi (L2 poi) può anche essere testato.
Figura 1. Schema di screening piattaforma microfluidica per nematode saggio electrotaxis. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Stampo pilota (A) e completamente assemblato dispositivo microcanali PDMS (B).
Figura 3. Posizione in funzione del tempo (A) e velocità istantanea (B) la produzione di programmi di monitoraggio dei worm personalizzato. Souril video ce è video supplementare 1 sotto. Il programma calcola la curva di velocità dalla curva tempo-posizione ma non tiene conto dei picchi nel calcolo velocità media.
Figura 4. Velocità Electrotaxis di N2 controllo wild-type e transgenici worm NL5901. NL5901 vermi sono significativamente più lento di controllo con p> 0.0001. Significatività è determinato con il test di Mann-Whitney non parametrico. n = 10 per N2 e n = 23 per NL5901.
Video supplementare 1. Comportamento Electrotactic di giovani nematode adulto in un canale microfluidica. Video inizia con catodo a destra. Aspetto della pipetta di vetro indica imminente inversione di polarità; successiva rimozione della pipetta segnali momento di rovesciamento. Clicca qui per vederefilm.
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Discussion
Sfruttando il fenomeno comportamentale prima descritto da Gabel e colleghi e di costruzione sul dielettroforetica lavoro manipolazione di Chuang e colleghi 11,12, il nostro saggio electrotaxis microfluidica basata fornisce un metodo semplice, robusto e sensibile per sondare l'attività neuronale in vermi che utilizzano il movimento come un'uscita. L'analisi dei parametri di movimento permette confronto quantitativo tra diversi genotipi. La precisione di fabbricazione e di applicazione microcanale campo elettrico insieme forniscono sia un ambiente controllabile e un mezzo per comunicare con la vite senza fine per il controllo locomozione. Diverse forme d'onda dei segnali elettrici hanno differenti riflessi comportamentali nel verme e sono stati utilizzati sia per stimolare ed inibire la locomozione.
Il disegno monocanale del presente dispositivo microfluidico richiede che solo un singolo verme essere segnata alla volta. Per questo, soluzione verme deve essere sufficientemente diluito con M9buffer prima di tentare di caricare i vermi nel canale. È importante sottolineare che le operazioni di canale possono essere complicate dalla presenza di bolle d'aria e altre irregolarità della pressione idrostatica. Questo potrebbe essere eliminato mediante lavaggio il canale con M9 e manipolando l'elevazione della aspirazione e tubi di scarico.
Il test qui descritto può essere ulteriormente migliorata. Un chip microfluidica multicanale potrebbe accelerare lo screening verme, anche se richiederà l'integrazione di altri meccanismi di controllo quali il caricamento senza fine, di posizionamento e di monitoraggio. Ulteriore automazione del protocollo electrotaxis, in particolare la gestione del flusso controllato da computer, aumenterà l'efficienza. Questi miglioramenti sono attualmente in fase di sviluppo nel nostro laboratorio.
Estrazione di dati da locomozione electrotaxis video è stato originariamente eseguita manualmente usando ImageJ, che è un processo lento e noioso. Per aumentare l'efficienza ed eliminare human errore, abbiamo cominciato a usare un programma di monitoraggio verme adattato da un pacchetto di MATLAB a base originale sviluppata presso il California Institute of Technology 13. Il software elabora attualmente video single-vite senza fine. L'ultima versione è adatta per una vasta gamma di analisi tra cui vermi trattati chimicamente e neuronali e mutanti muscolari. Uno dei suoi limiti è che inversioni spontanee, osservati in alcuni mutanti neuronali (per esempio, OSM-5) 5, non sono interpretati correttamente. Questi vermi devono essere analizzati manualmente.
Limitazioni nonostante, microfluidica electrotaxis possono essere applicate in contesti miriade, tra droga test di scoperta con i modelli a vite senza fine dei disturbi del movimento legati. Considerando la sua riconducibilità alla parallelizzazione, electrotaxis è particolarmente adatto per applicazioni di screening high-throughput. Analisi genetica e età-dipendente del comportamento electrotactic e degenerazione neuronale può anche essere studiato con questosistema. Inoltre, i worm possono essere ordinati per età o fenotipo di formare campioni sincronizzati o per identificare nuovi mutanti per schermi genetici forward 6,14.
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Disclosures
La tecnologia di analisi electrotaxis microfluidica è stato depositato il brevetto negli Stati Uniti d'America e Canada.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, Canada Research Chairs Program Canadian Institutes of Health Research, e Ontario Ministero della ricerca e dell'innovazione attraverso i loro primi ricercatori Programma Award per il sostegno finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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