Summary
Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren in
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans is een veelzijdige modelorganisme voor biomedisch onderzoek vanwege het behoud van ziektegenen en trajecten alsmede het gemak van de teelt. Verschillende C. elegans ziektemodellen gemeld, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD), die de degeneratie van dopaminerge (DA) neuronen 1 omvat. Zowel transgenen en neurotoxische chemicaliën zijn gebruikt om DA neurodegeneratie en beweging defecten daaruit in wormen induceren, waardoor onderzoek naar de basis van neurodegeneratie en schermen voor genen en neuroprotectieve verbindingen 2,3.
Schermen in lagere eukaryoten, zoals C. elegans een doelmatige en economische manier op verbindingen en genen die neuronale signalering te identificeren. Conventionele schermen worden meestal handmatig uitgevoerd en gescoord door visuele inspectie, dus ze zijn tijd-consuming en gevoelig voor menselijke fouten. Bovendien, de meeste nadruk op celniveau analyse terwijl het negeren locomotievorm is een bijzonder belangrijke parameter voor bewegingsstoornissen.
We hebben een nieuwe microfluïdische screening systeem (figuur 1), dat controleert en kwantificeert C. ontwikkeld locomotion elegans 'met elektrisch veld stimuli binnen microkanalen. We hebben aangetoond dat een gelijkstroom (DC) veld robuust kan induceren on-demand voortbeweging naar de kathode ("electrotaxis") 4. Verwisseling van de polariteit van het veld zorgt ervoor dat de worm snel achteruit zijn richting ook. We hebben ook aangetoond dat defecten in dopaminerge en andere sensorische neuronen weg zwemmen respons 5. Daarom kunnen afwijkingen in neuronale signalering worden bepaald met beweging als read-out. De respons beweging kan nauwkeurig worden gekwantificeerd aan de hand van een reeks parameters zoals zwemmen snelheid, lichaam buigen frequentie en omkering tijd.
4. Deze bevindingen leidden ons naar een nieuwe microfluïdische apparaat om passief te sorteren wormen naar leeftijd en fenotype 6 ontwerpen.
We testten ook de reactie van wormen gepulseerde gelijkstroom en wisselstroom (AC) elektrische velden. Gepulseerde DC velden van verschillende duty cycles effectief gegenereerd electrotaxis in beide C. elegans en zijn neef C. briggsae 7. In een ander experiment, symmetrisch wisselvelden met frequenties van 1 Hz tot 3 kHz geïmmobiliseerde wormen in het kanaal 8.
Uitvoering van het elektrische veld in een microfluïdische omgeving maakt een snelle en geautomatiseerde uitvoering van de electrotaxis assay. Deze benadering belooft high-throughput genetische en chemische schermen voor factoren vergemakkelijkeninvloed neuronale functie en leefbaarheid.
Protocol
1. Fotolithografie voor Master Mold Fabrication
- Baden een 3 inch siliciumwafel in aceton gedurende 30 seconden en vervolgens methanol gedurende 30 sec. Spoelen met dH 2 0 water gedurende 5 minuten.
- Droog het oppervlak van de wafer met een N2 klap pistool. Verwarm de wafer op een hete plaat bij 140 ° C gedurende 2 minuten.
- Plasma oxideren van het oppervlak van de siliciumwafel (1 min, 50 W).
- Spin-coat oppervlak van de wafer met 3 ml SU-8 100 fotolak (40 sec; 1750 rpm).
- Pre-bak de gecoate wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10 min, waarna uitloop de temperatuur tot 95 ° C gedurende 2 minuten. Handhaaf deze instelling voor een extra 1 uur.
- Lijn een fotomasker met het gewenste kanaal ontwerp. Expose de weerstaan om 550-600 mJ / cm 2 van UV-licht (350-400 nm). Fotomaskers kunnen worden ontworpen in AutoCAD en afgedrukt op een transparant met een hoge resolutie afdrukken.
- Post-bak de wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 1 min en 95 ° C gedurende 10 min, t rampingHij temperatuur als voorheen.
- Dompel de wafer in SU-8 developer oplossing voor 10-15 minuten. Controleer de voltooiing van de ontwikkeling door spoelen met isopropanol. Als een witte neerslag ontstaat, blijven ontwikkelen. De master vorm wordt getoond in figuur 2A.
2. Zachte lithografie voor Microchannel Fabrication
- Meng 35 ml polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer basis met 3,5 ml PDMS verharder.
- Plaats de gefabriceerde meester mal (patroon naar boven) en een lege silicium wafer in petrischalen bekleed met aluminiumfolie.
- Giet 20 ml PDMS pre-polymeer in de master-mal schotel en 15 ml in de tweede schaal. Elimineer luchtzakken onder de wafers door zachtjes te drukken op hen met een wegwerp houten applicator.
- Bedek beide gerechten en gereserveerd voor een dag om te genezen. Als alternatief voor een snellere uitharding, verwijder luchtbellen uit de PDMS gebruik van een vacuüm ontgasser en dan laat de gerechten op een hete plaat bij 80 ° C gedurende 2hr.
- Verwijder de folie en schil de PDMS van de wafers.
- Gebruik Harris Uni-Core (2,5 mm) om vloeistof toegangspoorten slaan aan beide einden van het kanaal. Snijd het kanaal en blanco PDMS in vergelijkbare grootte reepjes.
- Laad het kanaal, de lege PDMS strip en een glasplaatje (75 × 25 mm 2) in een plasma oxidator, waarschijnlijk gelegen in een cleanroom. Blootstellen aan zuurstof plasma gedurende 40 sec bij 40 W vermogen.
- Plak het kanaal stuk en glasplaatje aan weerszijden van het lege strip. Gereserveerd voor 2 uur om de hechting te voltooien.
- Plaats het geheel op een hete plaat bij 120 ° C. Bevestig kunststof buis (binnendiameter 1/32 "diameter 3/32"), elk ten minste 6 inch lang, aan de geperforeerde reservoirs met PDMS prepolymeer. Aanbrengen van een vloeibare plastic connector aan een of beide buizen te spuiten beslag laten, of in de handel verkrijgbare hulpstukken.
- Sta het PDMS veiligstellen van de slang te genezen. Plaats 3 "lengtes van 22 gauge geïsoleerde koperdraad in each reservoir, tussen de inlaat buis en het kanaal, en veilig met PDMS pre-polymeer. Het eindproduct is weergegeven in figuur 2B.
3. Electrotaxis Experiment
- Plaats de microkanaal op het podium (bij voorkeur XY-verplaatsbare) van een microscoop met een gemonteerde camera is aangesloten op een monitor (figuur 1).
- Sluit de voeding of uitgangsdraden versterker naar de elektroden van de microchannel's. Een eenvoudige DC voeding voldoende is als alleen een DC-signaal wordt gewenst, maar een versterker aangesloten op een functie generator maakt gebruik van gepulste DC-en AC-signalen ook.
- Bevestig eindbuis de microchannel om een wegwerpspuit. Dompel de monding van de inlaatbuis in M9 fysiologische buffer en voorzichtig streven vloeistof in het kanaal door een onderdruk in de spuit (manueel of met behulp van een injectiepomp). Wanneer de inlaat en uitlaat pijpen zijn beide gevuld met M9, koppel de spuit from de buis. Niveau beide buizen dezelfde hoogte hydrostatisch aangedreven stromen voorkomen.
- Breng een gelijkspanning aan het kanaal en ervoor zorgen dat de weerstand (R = V / I) is ongeveer 0,6 MQ (voor een 50 mm lang, 0,3 mm breed en ~ 0,1 mm diep microchannel).
- Als u tevreden bent met de integriteit van het kanaal, volgt u de bovenstaande stappen om wormen te laden van een verdunde suspensie in het kanaal.
- Koppel de spuit en hydrostatisch manipuleren de stroming door het aanpassen van de buizen 'relatieve hoogte. Gebruik deze methode om een worm te plaatsen in het midden van het kanaal en dan leg beide buizen plat op dezelfde hoogte.
- Zet de voeding aan op de juiste spanning: 4-12 V / cm voor L3 stadium dieren, 4-10 V / cm voor L4S en 2-4 V / cm voor jonge volwassenen. Activeert het elektrische signaal en laat 1 min van de pre-exposure voor de worm te acclimatiseren aan het veld. De worm moet beginnen richting de kathode. Wanneer de minuut voorbij is, gebruikt u de camera om de opname te starten.
- Voor AC en polsslagd DC experimenten, kan de maximale responsieve elektrisch veld van boven en de frequentie en de duty cycle van het signaal worden aangenomen kan worden gemoduleerd zoals gewenst 7, 8.
- Als experiment is voltooid, verwijdert alle vloeibare (en wormen) uit het kanaal, spoelen met dH 2 0, en laat het apparaat op een hete plaat bij 125 ° C om te drogen.
- Uittreksel motorische gegevens van opgenomen video's handmatig met NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) of aangepaste MATLAB-gebaseerde worm tracking software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vertegenwoordiger van video electrotaxis een wildtype jonge volwassen nematode en zijn positie en snelheid uitgangen van de worm tracking software wordt in aanvullende Video 1 en figuur 3. De bewegingsanalyse software zelf is de richting van het veld polariteit en het tijdstip van ompoling niet herkennen, maar eerder, moet deze informatie worden verkregen van de bron video. Dit kan worden gedaan met behulp van een audio-of visuele cue in de video of het opschrijven van experimentele condities en manipulaties.
Electrotaxis snelheidsgegevens van een set van wild-type (N2) en transgene dieren (NL5901) weergegeven in figuur 4. De NL5901 dieren dragen menselijke α-synucleine gen onder controle van unc-54 (myosine zware keten gen) promoter. De expressie α-synucleïne in lichaamswand spieren aggregaten 9 en onze resultaten blijkt dat het veroorzaakt abnormaliteiten in de electrotactic reactie. De snelheid van NL5901 wormen is aanzienlijk langzamer dan wild-type. Om de grafiek te plotten, berekenden we de snelheid van individuele wormen en uitgezet resulteert in een boxplot met Minitab statistische software ( http://www.minitab.com ). Naast snelheid andere parameters verkeer, zoals draaireactie (tijd genomen om de omkering te voltooien in reactie op elektrisch veld polariteitsverandering) en body buigen frequentie (gemiddeld aantal sinusgolven per seconde), kan worden geanalyseerd zoals elders beschreven 5.
De electrotaxis protocol werkt het beste als een gesynchroniseerde bevolking, dat verkrijgbaar door behandeling met een bleekmiddel oplossing (natriumhypochloriet en 4 N natriumhydroxide in een 2:3 volumeverhouding) 10. Alle hier gepresenteerde gegevens werd verkregen van gesynchroniseerde bevolkingsgroepen uit te sluiten leeftijd-en fase-afhankelijke variatie. Terwijl we hebben gebruikt jongvolwassenen (69 uur na L1 bij200C), kunnen andere stadia (L2 verder) ook getest worden.
Figuur 1. Schematische voorstelling van microfluïdische screening platform voor nematode electrotaxis assay. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Meester mal (A) en een volledig geassembleerde PDMS microchannel apparaat (B).
Figuur 3. Positie tegen de tijd (A) en ogenblikkelijke snelheid (B) uitgangen van aangepaste worm volgen programma. Source video is aanvullend Video 1 hieronder. Het programma berekent de velocity curve van de positie-tijd curve, maar voorbijgaat aan de spikes bij het berekenen van de gemiddelde snelheid.
Figuur 4. Electrotaxis snelheid van wild-type controle N2 en transgene NL5901 wormen. NL5901 wormen zijn beduidend langzamer dan de controle met p> 0,0001. Significantie wordt bepaald met de niet-parametrische Mann-Whitney-test. n = 10 voor N2 en n = 23 voor NL5901.
Aanvullende Video 1. Electrotactic gedrag van jonge volwassen nematode in een microfluïdische kanaal. Video begint met kathode naar rechts. Uiterlijk van glazen pipet geeft dreigende ompoling; daaropvolgende verwijdering van de pipet signalen moment van omkering. Klik hier om te bekijkenfilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Profiterend van de gedrags-fenomeen voor het eerst beschreven door Gabel en collega's en voortbouwend op de dielectrophoretic manipulatie werk van Chuang en collega's 11,12, onze microfluïdische gebaseerde electrotaxis test biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige methode om neuronale activiteit sonde in wormen met beweging als een uitgang. De analyse van de parameters verplaatsing mogelijk kwantitatieve vergelijking tussen de verschillende genotypen. De nauwkeurigheid van microkanaal fabricage en elektrische toepassingsgebied samen leveren een controleerbare omgeving en een middel om te communiceren met de worm voor vervoer control. Verschillende elektrische signaal golfvormen hebben verschillende gedrags reflecties in de worm en zijn gebruikt om zowel te stimuleren en remmen motoriek.
De single-channel ontwerp van de huidige microfluïdische apparaat vereist dat slechts een enkele worm gescoord worden op een moment. Hiervoor moet worm oplossing voldoende verdund worden met M9bufferen voordat u probeert om wormen te laden in het kanaal. Het is belangrijk erop te wijzen dat kanaal handelingen kan worden gecompliceerd door de aanwezigheid van luchtbellen en andere onregelmatigheden in de hydrostatische druk. Dit kan worden voorkomen door de spoelen kanaal M9 en manipuleren van de hoogte van de inlaat-en uitlaatbuizen.
De hier beschreven assay kan verder worden verbeterd. Een multi-channel microfluïdische chip kon worm screening te versnellen, maar het zal de integratie van andere controlemechanismen, zoals worm laden, positionering en het bijhouden vereisen. Verdere automatisering van de electrotaxis protocol, met name computer-gestuurde flow management, zal de efficiëntie verhogen. Deze verbeteringen worden momenteel ontwikkeld in ons laboratorium.
Extractie van beweging gegevens electrotaxis's werd oorspronkelijk handmatig uitgevoerd met ImageJ, een langzaam en moeizaam proces. De efficiëntie te verhogen en te elimineren human fout, zijn we begonnen met een worm-tracking programma aangepast van een origineel MATLAB-based pakket, ontwikkeld aan de California Institute of Technology 13 gebruiken. De software verwerkt momenteel single-worm video's. De nieuwste versie is geschikt voor een breed scala van assays chemisch behandelde wormen en neuronale en spieren mutanten. Een van de beperkingen is dat spontane omkeringen, waargenomen in bepaalde neuronale mutanten (bijv. osm-5) 5, niet correct worden geïnterpreteerd. Zoals wormen moet handmatig worden geanalyseerd.
Beperkingen niettegenstaande, kan microfluidische electrotaxis worden toegepast in talloze contexten, waaronder drug discovery assays met worm modellen van beweging-gerelateerde aandoeningen. Gezien zijn ontvankelijkheid voor parallellisatie, wordt electrotaxis bijzonder geschikt voor high-throughput screening toepassingen. Genetische en leeftijdsafhankelijke analyse van electrotactic gedrag en neuronale degeneratie kunnen ook worden bestudeerd met dezesysteem. Daarnaast kunnen wormen worden naargelang hun leeftijd of fenotype tot gesynchroniseerde monsters te vormen of om nieuwe mutanten voor voorwaartse genetische screens 6,14 identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De microfluïdische electrotaxis assay technologie is octrooi aangevraagd in de Verenigde Staten van Amerika en Canada.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Onderzoek Stoelen Program, Canadese Institutes of Health Research, en Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie bedanken door middel van hun Early Onderzoekers Award Programma voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
