Séparation de souris embryonnaires ectoderme visage et Mesenchyme
Summary
Un protocole pour la séparation de l'ectoderme embryonnaire visage et le mésenchyme est décrite. Nous utilisons dispase II pour traiter les embryons entiers d'abord, disséquer l'ensemble du visage protubérances sur, puis séparer l'ectoderme facial et le mésenchyme.
Abstract
Fentes orofaciales sont les défauts les plus fréquents cranio-faciales, qui touchent 1,5 en 1000 1,2 nouveau-nés dans le monde entier. Clefting orofaciale est causée par 3 un développement anormal du visage. Chez l'homme et la souris, la croissance initiale et structuration de la face repose sur plusieurs petits bourgeons de tissu pour le visage, les proéminences 4,5. Le visage est dérivée à partir de six protubérances frontales principales paires: les processus nasaux (FNP), les protubérances maxillaires (MXP) et des proéminences mandibulaires (MdP). Ces protubérances sont constitués de gonflements de mésenchyme qui sont enfermés dans un épithélium sus-jacent. Etudes de multiples espèces ont montré que la signalisation diaphonie entre ectoderme et le mésenchyme facial est essentiel pour façonner la face 6. Pourtant, les détails mécanistiques concernant les gènes impliqués dans ces relais de signalisation font défaut. Une façon d'acquérir une compréhension globale de l'expression des gènes, facteur de transcription liant, et les marques associées à la chromatine le déveectoderme ping visage et le mésenchyme est d'isoler et de caractériser les différents types de tissus séparés.
Nous présentons ici une méthode pour séparer l'ectoderme facial et mésenchyme au jour embryonnaire (E) 10,5, une étape critique du développement de la formation de la souris pour le visage qui précède la fusion des protubérances. Notre méthode est une adaptation de l'approche que nous avons utilisée précédemment pour disséquer les protubérances du visage 7. Dans cette étude, plus tôt nous avions utilisé C57BL consanguine / 6 souris que cette souche est devenu un standard pour la génétique, la morphologie du visage et de la génomique 8. Ici, cependant, en raison des quantités plus limitées de tissus disponibles, nous avons utilisé le consanguine souche CD-1 qui est moins cher à l'achat, plus robuste pour l'élevage, et qui tend à produire plus d'embryons (12-18) par portée que n'importe quel consanguine souche de souris 8. Suite à l'isolation embryon, neutre protéase dispase II a été utilisé pour traiter l'embryon entier. Ensuite, les protubérances faciales ont été disséquered dehors, et l'ectoderme facial a été séparé du mésenchyme. Cette méthode permet de conserver à la fois l'ectoderme facial et le mésenchyme intacte. Les échantillons obtenus selon cette méthode ne peut être utilisé pour des techniques telles que la détection de protéines, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) analyse, études de puces à ADN et l'ARN-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit une méthode simple pour séparer l'ectoderme embryonnaire de la souris pour le visage et le mésenchyme basée sur une première étape de traitement dispase II. Dans des études antérieures, nous avons procédé à la dissection des protubérances du visage avant dispase II du traitement, mais nous avons toujours trouvé que le mésenchyme devient "collante" et plus difficile à manipuler. Notre nouveau protocole permet d'éviter ce problème. Combinaison dispase II le traitemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Irene Choi pour illustrer les chefs d'embryons dans la figure 1 et les autres membres du laboratoire de l'aide et de discussion. Ce travail est soutenu par le NIH subvention DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
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