माउस भ्रूणीय चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme के पृथक्करण
Summary
भ्रूण चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme की जुदाई के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. हम Dispase द्वितीय का उपयोग करने के लिए पूरे भ्रूण पहले इलाज, पूरे चेहरे prominences बाहर टुकड़े करना, और फिर चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme अलग.
Abstract
Orofacial clefts सबसे अक्सर craniofacial दोष है, जो हज़ार newborns दुनिया भर में 1,2 में 1.5 को प्रभावित कर रहे हैं. Orofacial clefting असामान्य चेहरे का विकास 3 के कारण होता है. मानव और माउस, प्रारंभिक और चेहरे के विकास patterning में ऊतक के कई छोटे कलियों, चेहरे 4,5 prominences पर निर्भर करता है. बनती ललाट नाक प्रक्रियाओं (FNP), दाढ़ की हड्डी prominences (MXP) और जबड़े prominences (एमडी): चेहरा छह मुख्य prominences से ली गई है. ये prominences mesenchyme की सूजन है कि एक overlying उपकला में encased हैं से मिलकर. कई प्रजातियों में अध्ययनों से पता चला है कि चेहरे की बाहरी झिल्ली और mesenchyme बीच crosstalk संकेत 6 चेहरे को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण है. फिर भी, इन संकेत रिले में शामिल जीन से संबंधित यंत्रवत विवरण की कमी कर रहे हैं. जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक व्यापक समझ हासिल करने के लिए एक तरीका है, प्रतिलेखन बाध्यकारी कारक, और chromatin के निशान develo के साथ जुड़ेपिंग चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme करने के लिए अलग और अलग ऊतक डिब्बों विशेषताएँ है.
यहाँ हम भ्रूण (ई) दिन 10.5, माउस चेहरे गठन कि prominences के विलय से पहले में एक महत्वपूर्ण विकास मंच में चेहरे की बाहरी झिल्ली और mesenchyme को अलग करने के लिए एक विधि उपस्थित थे. हमारे विधि दृष्टिकोण से अनुकूलित है हम पहले विदारक चेहरे 7 prominences के लिए इस्तेमाल किया है. इस पहले के अध्ययन में हम सहज C57BL कार्यरत था / इस तनाव के रूप में 6 चूहों आनुवांशिकी, जीनोमिक्स और चेहरे आकारिकी 8 के लिए एक मानक बन गया है. यहाँ, हालांकि, उपलब्ध ऊतक के अधिक सीमित मात्रा के कारण, हम outbred तनाव सीडी-1 है कि खरीद करने के लिए सस्ता है, खेती – किसानी के लिए और अधिक मजबूत का उपयोग किया है, और कूड़े के प्रति अधिक (12-18) किसी भी जन्मजात से भ्रूण का उत्पादन प्रवृत्त माउस तनाव 8. भ्रूण अलगाव के बाद, तटस्थ protease Dispase द्वितीय पूरे भ्रूण का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिर, चेहरे prominences टुकड़े करनाएड बाहर, और चेहरे की बाहरी झिल्ली mesenchyme से अलग हो गया था. इस विधि दोनों चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme बरकरार रहता है. इस पद्धति का उपयोग के नमूने प्राप्त प्रोटीन का पता लगाने, chromatin immunoprecipitation (चिप) परख, माइक्रोएरे अध्ययन, और शाही सेना seq सहित तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीधा करने के लिए भ्रूण माउस चेहरे बाहरी झिल्ली और mesenchyme एक प्रारंभिक Dispase द्वितीय उपचार कदम के आधार पर अलग तरीका प्रदान करता है. पिछले अध्ययनों में, हम Dispase द्वितीय उपचार के लिए पहले चे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए Irene चोई 1 छवि और मदद और चर्चा के लिए प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों में भ्रूण सिर illustrating के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम NIH अनुदान DE012728 (TW) द्वारा समर्थित है
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
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