Summary
在这里，我们描述了使用Langendorff灌流系统成年小鼠cardiomyoctyes隔离。所得到的细胞是钙耐受性，电静态和可培养和转染腺病毒或慢病毒操纵基因的表达。它们的功能也可以使用MMSYS系统和膜片钳技术进行分析。
Abstract
在培养中使用的主要的心肌细胞（CMS）中提供了一个强有力的补充，以心脏疾病的小鼠模型在推进我们的心脏疾病的认识。特别是，研究离子平衡，离子通道的功能，细胞的兴奋性和兴奋 - 收缩耦联及其改建患病状况及致病突变的能力，导致显著见解心脏疾病。此外，由于缺乏足够的永生化细胞系，以模仿成人的CM，并且新生儿的CM的限制（其缺乏许多成人CM的结构和功能的生物力学特性的）中培养，阻碍了我们的信号转导途径之间的复杂的相互作用的理解，离子通道和在成人心脏加强学习成人的心肌细胞分离的重要性收缩特性。在这里，我们提出了分离，培养，操纵基因表达的腺病毒EXPRE方法ssed蛋白，并从成年小鼠心肌细胞其后的功能分析。使用这些技术将有助于开发机械洞察信号通路调节细胞的兴奋性，Ca 2 +的动力学和收缩，并提供一个更相关的生理表征心血管疾病。
Introduction
心血管疾病的小鼠模型曾担任有效的工具，基本阐明疾病机理1,2以及识别潜在的治疗靶点1,3。特别是，利用获取的心脏疾病的两个小鼠模型（如压力负荷）4,5和转基因小鼠模型的具有先进我们的心脏疾病6-8的理解。利用细胞培养技术，研究信号级联反应3,9,10和变更中，在单细胞水平的背后细胞的兴奋性和兴奋-收缩偶联在心脏11-13个别蛋白质已补充了体内小鼠模型。然而，由于缺乏反映成人CM的结构和功能足够的细胞系已经显著限制。研究者已经寻求通过研究个体的蛋白质，如离子通道，以克服这一点，在异源表达系统
小学新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）是比较容易培养，可以感染腺病毒和慢病毒操纵基因的表达15，第二因此，已经成功1使用，但有自己的限制。虽然他们提供了一个生理微环境1，并一直信令领域的主力，形态和NRVMs和成人cardiomyoctyes的亚细胞组织间的巨大差异使他们对离子通量和兴奋-收缩耦联在成人心脏调查不足的模型。最值得注意的是NRVMs缺乏一个明确的T管状子系统4。由于钙离子通量和动态都严重依赖于成熟的T管和肌浆网（SR）结构6，Ca 2 +的动力学和NRVMs心肌收缩功能的研究是不是在成人的心肌这些关键流程的准确反映。另外，信号通路的一些部件新生和成年小鼠9之间的不同，从而提供了另一个限制用于 研究疾病过程和其我MPACT在NRVMs细胞的兴奋性和收缩性。最后，该收缩机构的分布导致多方向和不均匀的细胞缩短限制收缩测量的精度。
因此，使用分离的成年心肌细胞提供了更准确的体外模型系统。知识的超常增长成为可能，小鼠遗传操作得到强调功能的心肌细胞分离小鼠的意义。事实上，成人的CM从小鼠模型中分离的特性也已摆脱了许多生物和病理事件的光。从转基因小鼠模型中分离的CM已经允许用于在疾病模型如缺血/再灌注17,18上的单个细胞2,16的收缩特性的增益或蛋白质的功能丧失，和生存能力的研究，从而补充从获得的信息体内研究对SE小鼠。从天性心脏疾病3,19,20小鼠模型（如横向主动脉缩窄致压力过载，模仿高血压或主动脉瓣狭窄）或运动5,21（用于模拟生理性肥大）允许检查使用隔离成年的CM的牵连在这些过程与在单细胞水平的细胞的兴奋性和兴奋 - 收缩偶联信号传导级联的相互作用。此外，使用腺病毒驱动的基因表达在成人的CM操纵基因表达的能力，使我们有机会来剖析复杂的信号通路的组成部分。
从电的角度来看，整个电池的电压和上分离的成CM的电流钳实验中阐明的离子通量中的基线的性质和各种疾病状态是至关重要的。由于细胞膜的结构复杂和差动保护制服的在成人的CM和NRVMs或异源的细胞系之间的脚手架结构，修补成年细胞的能力给出了某些膜蛋白，结构蛋白，并在成年心脏的电组件的离子通道相互作用伙伴的效果好得多表示。
尽管在研究成年鼠心肌细胞，分离培养成年小鼠心肌细胞已经被挑战，敦促需要的方法来隔离小鼠存活心肌，并保持他们的文化，以允许进一步的遗传操作使用病毒的系统，准确地描述这种突出的优点向量。以前的研究已经使用，也可以急性分离的小鼠成年CMS或培养的大鼠成年CMS。后者更容易培养比成年鼠的CM，和大多数实验在体外操纵基因的表达已经用大鼠成年CMS。一些研究已经成功地改变和调查FUNCTI在成年小鼠的CM ONAL基因表达，在实验的范围呈现一个大的限制。因此，在这里我们将详细介绍这些方法，从以前的调查修改，为隔离7,8,22，文化3,10,15,23，腺病毒感染11-13,15和成年小鼠脑室cardiomyoctyes功能分析。这种隔离协议导致Ca 2 +的耐性，我们已经成功地培养长达72小时，瞬时转染腺病毒兴奋心肌细胞。这些分离的细胞的功能性可使用MMSYS成像系统14,24和膜片钳，这也将讨论进行评估。
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Protocol
1。心肌细胞分离
材料（图1）
Microdissecting钳
组织钳
细腻的止血钳
止血钳
Microdissecting，锯齿，弯钳
经营剪刀，直
经营剪刀，弯
15毫升Falcon管（5）
60毫米培养皿
磷酸盐缓冲盐水（PBS）中
尼龙网 - 400微米孔径
小漏斗
涂蜡，编织丝绸4-0 19毫米，长7-10厘米
非注射针，钝端，24 G或商业动物喂养针（24×1，W/1-1/4）
肝素钠
氯胺酮/甲苯噻嗪混合
巴斯德移液器
OPTIVISION解剖镜
IonOptix MMSYS系统
注意：如果培养细胞，见细胞培养第2节开始本协议之前。
注：所有小鼠均在照顾根据IACUC批准的法规，惯例和程序的障碍设施和牺牲。
注：在开始的过程中，整个系统必须进行预热，以确保Langendorff灌注系统（ 图2A，图3）的所有元素都被加热至37℃，以便正确和完整的胶原酶活性。
- 注入成年鼠（〜12周）与150 USP单位肝素钠进入腹腔空间。
- 麻醉用在一个重量依赖性剂量（ 表1）注射氯胺酮/赛拉嗪的混合物。
- 80:12毫克/千克氯胺酮：甲苯噻嗪配方：2.6毫升氯胺酮（100毫克/毫升）+0.4毫升甲苯噻嗪（100毫克/毫升）+ 37毫升的PBS。决赛：氯胺酮= 6.5毫克/毫升;甲苯噻嗪= 1毫克/毫升
- 固定镇静鼠标操作垫，切除心脏，并放入室温的PBS的培养皿或0.9％生理盐水（ 图1J）。 PHYsiologic生理盐水允许完整心脏收缩在室内更好的挤出血液和易于识别步骤1.6之前的主动脉。小鼠进行了检查，以确保它们通过深入的后肢脚趾捏反射和呼吸频率发病前开胸的放缓损失麻醉。
- 使用OPTIVISION解剖镜（ 图1A）来识别和揭露主动脉。除去主动脉周围的组织，虽然它确实有利于容器的可视化，是没有必要的细胞分离的优化，如果在主动脉根部清晰可见。
- 素与灌注缓冲泵（ 表2）。温度应在37℃下使用保持的程序的长度的控制，循环水浴（ 图2D）。
- 安装心脏到Langendorff装置上（ 图2A）。使用两个微解剖钳（ 图1D-E），PRIME主动脉周围无皮下，钝端针（24 G）与硅胶管的远端。可选地商业动物喂养针（24×1中，W/1-1/4）都可以使用。上的24号针头或动物喂食针的硅胶管将允许用于固定缝合线在槽。将主动脉上的针为一只袜子。 （ 图2C）。
- 注意：为确保针的端部搁置在升主动脉中，最好是在主动脉根部远侧至右无名是很重要的，但是，它并没有通过主动脉瓣进入左心室延伸，因为这会造成严重的限制缓冲器通过心脏通过冠状动脉有效灌注的能力。
- 通过把一个小的长度缝合丝（7-10厘米长）（ 图1K）主动脉周围的顶部，确保领带是在升主动脉的水平，低于右无名阿特保护心脏的针Y，但是是在针的末端上。
- 降低心脏成锥形玻璃的内部（ 图2B），以帮助保持一个合适的环境温度。
- 用5分钟的灌注缓冲液灌注心脏以1毫升/分钟的速率和夹持在玻璃腔室流出，以允许灌注液收集在锥形玻璃和包络的心脏。的示意图用于消化心脏的示于图3。
- 此时你应该看到的心脏增大音量。此外，血液在心脏组织会通过灌流液进行更换，造成组织苍白。
- 松开夹子流出排灌流。停泵从灌注缓冲容器将管线与酶缓冲容器（ 图2E）。重新启动泵，开始以1毫升/分钟，酶缓冲液（ 表2）灌注心脏。再用镊子流出，使酶缓冲的信封心脏。
- 这里，作为酶灌注心脏和消化结缔组织，心脏会变得苍白和结构的完整性会减弱。
- 确定何时从消化心脏切开心室，解除心脏出了锥形玻璃，轻轻地用钳子挤压心脏，并收集了几滴灌流液中的小培养皿中，并检查单个细胞是否被丢弃。
- 对于新手来说是有帮助的连接的压力计的灌注管线。当心脏已经消化压力将迅速下降，如结缔组织不成立的阻力。压力计也对新手来说非常有用，以确保针的位置是上述主动脉瓣，而不是在心室。低压将表明，该针是在心室腔和高压表明针触到阀。
- 切从心脏的心室成菜满转印缓冲液（A）（ 表2）当心室压力开始急剧下降，或当你能够看到单个细胞的灌流液。这通常需要〜7-10分钟。
- 再次使用微解剖钳（ 图1C），剁碎心室切成小块解离。一个成功的消化将离开组织几乎没有固体块切碎后，与大多数组织成为解离后，非晶。
- 以进一步分离的组织，采用了塑料巴斯德吸管（ 图4），从该尖端已切于一个〜45°角度吸取进/出该溶液中。这种修改是可以增加的枪头从而减少对细胞的剪切应力的量为组织被研磨内径的空间。
- 前解剖组织的钳子，可以分开单独的腔室，并分别分离心房，左心室或右击吨心室肌细胞。
- 固定平方目（ 图1M）的一个小漏斗（ 图1L）使用卡，并把这种过滤装置为15毫升猎鹰管（ 图1I）。
- 使用修改过的巴斯德移液管从培养皿取出的细胞溶液和过滤该溶液到Falcon管中。
- 使活细胞沉降到试管底部（活细胞沉淀应该采取2-4分钟）。
- 每四个钙溶液（ 表3）到4个独立15毫升Falcon管中的等分试样2.5毫升。
- 再次使用标准的巴斯德移液管小心地从管底除去细胞沉淀，将细胞转移到所述第一对钙的解决方案。
- 使细胞沉降到试管底部并在随后的钙溶液重复步骤1.17，直至细胞是在最后的解决方案。
- 不要让细胞沉淀在4吨ħ钙溶液。盖上管，并把它在其一侧。
2。细胞培养
- 之前的隔离，板1微克/毫升的天然小鼠层粘连蛋白上的玻璃盖玻片上，并孵育至少1小时，在37℃和2％CO 2下。还可以允许电镀和培养基（ 表4）在孵化器升温，在37℃和2％CO 2下。这允许在媒体中的溶解的CO 2来平衡。
- 不要从媒体卸下顶部。只需松开顶部，以避免污染。
- 让所述分离的细胞沉淀在Falcon试管的底部。
- 使用一个标准的塑料巴斯德吸管，重悬在电镀介质的适量除去沉淀。
- 镀上的层粘连蛋白包被的盖玻片上的细胞在适当的碟子和孵育在37℃和2％CO 2的至少30-60分钟，以使细胞附着在盖玻片上。
- *如果用腺病毒转染，稀释该病毒在镀介质的适量和替换在与含病毒的培养基的培养皿镀介质。让病毒孵育的细胞2小时，在37℃和2％CO 2。**
- 从盘中取出镀介质并更换培养基。
- 每天认真改变培养基，以免扰乱在盖玻片的细胞。
使用这种方法，细胞已被成功地培养长达72小时。培养和GFP转染的细胞的图像可以在图5中找到。
3。 MMSYS系统
- 电源MMSYS系统确保弧灯首先启动。
- 管连接从泵到MMSYS室的适当的入口和出口（ 图6）。
- 素系统与钙缓冲液（B）（ 表2）。
- 放置APPRopriately大小的玻璃盖玻片放入室内，并拧紧（ 图6E）。大多数MMSYS室使用任何22毫米或25平方毫米盖玻片。请咨询您的MMSYS用户手册，以确定适当的盖玻片为您室。
- 转移500μl的细胞溶液到一个小离心管中。
- 加入0.5微升Fura2-AM（1微克/微升原液）的小管细胞，并让他们在黑暗中在室温下孵育5-7分钟。这允许Fura2-AM对通过细胞膜通过快速被动扩散的“负载”到细胞中。
- 让Fura-2的加载细胞沉淀在管的底部，并且用500μl钙缓冲液B的洗涤过量的Fura
- 关掉房间的灯。
- 使用标准的巴斯德移液管，滴1-2滴的“装”的细胞溶液进入腔室（ 图6C）的中心（取决于细胞浓度），并允许细胞吨Ø解决到盖玻片5分钟。
- 将细胞在所述腔室的密度应该是这样的单一的非重叠的小区所用的MMSYS数据采集平台很容易地观看。
- 小心地开始通过腔室流到钙缓冲液（B）。
- 提高室内温度37°C。
- 重要提示：不要打开加热装置，直到流已经启动。这可能会严重损坏反馈thermocoupler（ 图6A）。
- 确保该室被连接到MyoPacer通过连接线（ 图6B），开始踱步细胞5 Hz在1.5倍的细胞起搏阈值。
- 选择一个跳动在正确的频率单元格，并将其放入取景光圈。
- 调节摄像机和成帧光圈尺寸，使整个小区在该窗口的中心，朝向水平方向，与肌节AP父。
- 用于细胞长度调整红色和绿色（右和左）光电二极管指标，该小区的边缘。调整对比度以优化黑/白对比度在小区的边缘。请参阅Ionoptix手册，了解有关详情。
- 将盒中包含明确定义的肌节细胞的面积，调整焦距，以优化功率谱（红色）的峰值。也调整显微镜的亮度，以优化蓝色平滑窗口和黑对比度信息。
- 调整绿色门槛条捕捉尽可能多的红色的功率谱（峰值）和一些背景尽可能。
- 开始录制。
- 经过足够的数据已被记录，按一下“暂停”，暂时停止记录，并确保该观察窗的既不是焦点也不尺寸被改变，移动显微镜的阶段到盖玻片，其中没有细胞或细胞物质可以是一个区域见过。莱恩根据研究者的实验方案记录的第g而变化。
- 注意：点击“停止”，将终止该记录和无背景将能够被记录为单元。
- 点击“恢复”录制背景测量。
- 经过足够的背景已被记录点击“停止”，以终止录制。
- 点击“文件>>保存”，保存所有的痕迹该单元在一个单一的，ZPT文件。
- 重复步骤3.12 - 3.20到足够的细胞已被记录。
- 咨询IonOptix-MMSYS用户手册12对记录的数据进行分析说明。野生型心肌特性所记录的数据在图7中示出。
4。膜片钳
不同细胞类型的膜片钳已经很好这轴颈25-28如前所述。因此，我们专注于一些批评家人参数为成人的心肌细胞成功膜片钳用我们的协议中所述隔离。
- 用移液管牵拉和硼硅酸盐玻璃（长丝：外径1.5mm时，ID0.86 毫米- 10cm长）拉移液管表现出〜2.0-3.0MΩ时充满移液管溶液（ 表5）。
- 火抛光轻轻用成茂或其他垂直火抛光枪头。补丁吸管的电阻应为火抛后2-4个月。
- 打开计算机，放大器（Axopatch 200B），AD转换器（Digidata 1440A，Axon仪器）和微操作机器人（MP-285）上。对于全细胞膜片钳，我们开始与如前面所述标准参数。
- 对培养的成年的CM，从孵化器中移除它们，并轻轻冲洗其上的CM是在室温下镀用PBS盖玻片。
- 轻轻取出盖玻片，并将其放置在灌注室的倒置显微镜（Nikon TE 2000）。
- 保证进用于灌注系统和出口（用于吸入），只是盖玻片的表面上。
- 开始用适当的细胞外液（ 表5）灌注。
- 对于新鲜分离成年的CM，将胶原蛋白包被的盖玻片在灌注系统上面。
- 因为细胞会在溶液中，轻轻地用胞缓冲液更换溶液。
- 使用修改后的巴斯德吸管（ 图4），轻轻悬浮细胞在细胞外的缓冲区，取等分，将它放在盖玻片。
- 让细胞在开始灌注在4.4之前附上10-15分钟。
- 回填用微滤（世界精密仪器，28 G）针与细胞内缓冲的全细胞膜片吸管。确保没有气泡在吸管尖，轻轻拍打，使气泡浮到surfaCE的解决方案。
- 附加填充补丁吸管的吸液管保持器，以确保有微电极和内部溶液之间的接触。
- 我们使用的氯化银电极，但通过在家用漂白剂中浸渍过夜，取'chloriding'的护理一周的银线至少一次。
- 轻轻放下吸管进入浴缸，确保浴缸电极浸没在任何时候洗澡/细胞外液中。抵消任何液体接界电势在这个时候。大路口的潜力可能下降氯化银电极上的标志。
- 健康成人的圆筒状的CM被确定在显微镜和集中在视野中。如先前所述，移动显微操作和调整焦点的组合允许补丁吸管的接近和CM的表面上。
- 一旦它们在同一焦平面上，我们使用的视觉组合化细胞和测试脉冲（在Axopatch 200B有）。
- 一旦移液管的阻力减小一半（这表明吸管与所述细胞的表面相接触），且细胞继续寻找圆柱形，我们建立使用轻柔抽吸千兆欧姆密封。
- 对于CM的，我们更喜欢用嘴吸建立负压。如果成功获得了gigaseal，我们再次使用温和的节奏用嘴吸，以“磨合”到细胞，建立全细胞膜片模式。
- 健康CM的典型静息电位都在-85到-90毫伏的顺序。一旦获得gigaseal，使用电流钳与I = 0 pA的测量静息膜电位。
- 如果静息膜电位去极化，这代表一个损坏单元或密封不良。
- 由于CMS是大细胞有很大的表面积，仔细注意必须支付给电容补偿，尤其是瓦特母鸡快速激活的电流，如钠通道需要进一步研究。如果有足够的电容补偿不能使用获得的内置的脉冲发生器补偿设定，prepulses在亚阈值电压和相反极性可能要被应用和所得到的电流从所记录的信号中减去。这样的协议是很容易编程Axopatch。
- 一旦全细胞膜片模式已经建立，等待15分钟，使达到平衡，并保证密封的稳定性之前开始电压或电流钳协议。我们使用了在这以前已经描述的标准协议和其他期刊和后不会加以阐述。
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Representative Results
成人cardiomyoctyes结果在棒状，横纹肌和静态（不自发地跳动）的细胞（ 图5A）的隔离。死细胞会显得圆润，无条纹将出席。静止细胞可以培养和转染腺病毒操纵基因的表达（ 图5B和5C）。在培养24小时，活细胞的形态不改变，他们仍然是Ca 2 +的宽容，他们可以通过现场的刺激来节奏。与提出的方法，80-90％的活细胞的产率可以达到。
为了测量细胞的收缩，对MMSYS系统软件需要从显微镜的相位信息举报要么改变肌或细胞长度。如图（ 图7A）是通过一个野生型C57BL6小鼠的肌节长度测量有代表性的收缩痕迹。从健康成年小鼠心肌细胞SE小鼠，基线肌节长度为〜1.7-1.9微米。该MMSYS系统软件是能够同时测量收缩力和钙处理，通过测量结合的比例为钙活化染料Fura2-AM中未结合的形式。而比措施可能略有不同设置之间的，健康的细胞，其比例通常为1.5-2.5（ 图7B）之间。如果MMSYS系统已校准的钙，该比率可以被翻译成胞内钙浓度的绝对度量。为了分析从收缩力和钙的痕迹所产生的数据，该痕迹必须被平均以建立一个特征跟踪该小区（ 图7C和7D）。这些特性痕迹，然后受到来自MMSYS系统软件，然后生成的收缩和舒张功能参数monotransient数据分析算法。进一步的细节中存在的离子威捷手册。
成年小鼠心肌细胞也受到全细胞膜片钳实验中的动作电位记录在电流钳模式（ 图8）。
| 机身重量（g） | 氯胺酮/甲苯噻嗪（毫升） |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
表1中。成年小鼠体重依赖氯胺酮/甲苯噻嗪用量（80:12）。
| 解 | 食谱 |
| 台氏缓冲液* （pH 7.4）中 | 1升双蒸2 O 137 mM氯化钠 4毫米氯化钾 1毫米氯化镁 10毫米的HEPES 0.33毫的NaH 2 PO 4 |
| 灌注缓冲液* （pH 7.4）中 | 500毫升台氏缓冲 10mM的D-（+） - 葡萄糖，最小 5 mM的牛磺酸 10毫米丁二酮肟（BDM） |
| 酶缓冲液* | 50毫升灌注缓冲液 0.024克胶原酶D（IV型） 0.018克胶原酶B（II型） 0.003克蛋白酶XIV从灰色链霉菌 |
| 转印缓冲液（A） | 45毫升灌注缓冲液 5毫升牛血清白蛋白（从5毫克/毫升储液） |
| 钙缓冲液（B） | 1升台氏缓冲液 1.2毫米氯化钙 5.5 mM的D-（+） - 葡萄糖，最小 |
表2。成年心肌细胞隔离缓冲食谱。
| [氯化钙] | 转印缓冲液（A） | 钙缓冲液（B） |
| 0.06 mM的Ca 2 +的 | 9.5毫升 | 0.5毫升 |
| 0.24 mM的Ca 2 +的 | 8.0毫升 | 2.0毫升 |
| 0.60毫米的Ca 2 + | 5.0毫升 | 5.0毫升 |
| 1.20 mM的Ca 2 +的 | 0毫升 | 10毫升 |
表3.Calcium滴定溶液的配方。
| 电镀液 | 培养基 |
|
|
表4。电镀与文化传媒食谱。
| 移液器解决方案 | 沐浴解决方案 |
|
|
表5。膜片钳解决方案（如图所示的解决方案是用于测量钠电流）。
图1。 。成人的心肌细胞分离工具a）OPTIVISOR光学玻璃双目放大镜B）组织钳，在，1×2齿5.5 - Roboz科学C）莫洛尼氏钳- 4.5英寸（11.5厘米）长轻微的曲线，锯齿- Roboz科学DE）杜蒙＃3钳，Dumostar，烙铁头尺寸0.17 x0.10毫米F）封隔器诱蚊诱卵uito镊5直平- Roboz科学G）微解剖剪刀4.5在弯曲夏普/夏普- Roboz科学高）在直夏普/夏普20毫米微解剖剪刀3.5 - Roboz科学我）14毫升猎鹰管-热-飞世尔科技十）60毫米培养皿中含有的PBS K）Softsilk：蜡涂编织的丝绸，有19毫米- Covidien公司L）的塑料漏斗，直径6.0cm M）的尼龙网- 400μm的孔径。。
图2。用于成人的心肌细胞分离B）用于地暖插管心脏。 三）非皮下注射针头插管的放大视图中空，呈圆锥形玻璃漏斗收集的放大视图Langendorff装置上A）整个Langendorff灌流系统。 （可重复使用的喂食克针（24 G，直线，圆尖，长25毫米;精细的科学工具有限公司项目18061-24）D）循环水浴E）水浴孵育灌注，酶和传输缓冲区。
图3。灌注系统的详细示意图。
图4。改性巴斯德吸管的吸液管被切割尖端在一个大约45°的角度改变。这允许更大的表面积，并建立对细胞更少的剪应力，因为他们正在离解。插图显示修改后的针尖的近距离观察。
图5。培养和GFP转染的心肌细胞。A）新鲜隔离器教育署成人的心肌细胞从C57BL6小鼠12周。箭头指向死亡或濒临死亡的细胞。这些细胞是较健康，杆状成人的CM B）的GFP转染的成年小鼠cardiomyoctyes后24小时文化。 三）培养成年小鼠心肌细胞24小时后更加圆润。插图显示培养的心肌细胞的增加倍数。
图6。 。MMSYS系统室蓝色箭头代表灌注缓冲液（缓冲液B）的流A）单 ，在线解决方案加热器- 。华纳仪器公司B）连接线从MMSYS系统室的MyoPacer场刺激C）铂金电极刺激区域位于室的中心D）流出水库E）商会夹在打开位置。
图7。录自杰克逊实验室获得的野生型C57BL6小鼠代表MMSYS系统的数据。 钙 的）MMSYS基地收缩痕迹。B）比+绑定到的Ca 2 +绑定Fura2-AM记录生成基地钙的痕迹。这些痕迹对应于A中的收缩力测量）。C）场均得到由MMSYS系统软件编译成一个特性收缩跟踪D）从B中的基础编制的痕迹钙特性曲线）基地收缩痕迹。复合痕迹分析将使研究人员生成替代参数收缩和舒张功能。 点击这里查看大图 。
图8。膜片钳跟踪显示野生型成年小鼠心肌细胞的动作电位。
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Discussion
在这份报告中，我们已经描述了成功分离和成人CM的文化从小鼠心脏所必需的技术。我们的技术可用于使用上述方法CM功能和兴奋性的后续研究。为研究成年CM的功能的关键参数是分离的CM的卫生和质量。如上所述，我们的技术允许以高收率的功能性细胞，适合于操纵用的腺病毒/慢病毒感染的培养和细胞兴奋性和收缩功能的分析基因表达。
一种用于功能成年小鼠CM的隔离的最重要的参数之一是精确和心脏快速插管到非皮下注射针。必须小心确保附着于左心室的主动脉解剖，以具有足够的长度，以允许心脏的更容易，更迅速的插管。当cannulating吨他心脏，它也是必要的，该针的尖端保持在升主动脉，并且不过去的主动脉瓣延伸到左心室，以允许组织经由冠状动脉有效灌注。下一个关键步骤是确保主动脉到用丝线缝合针的茎。缝合线应连接于升主动脉，使灌注缓冲流逆行进入冠状动脉和左心室腔但不流antegradely通过所述解剖主动脉或大血管的远端。
一些研究者发现它有助于建立一个压力计来评估插管的质量和酶的后续灌注。当使用一个压力计，初始左心室压力应为〜80 - 100 水柱 ，并且在灌注与酶，压力将降低到〜40-50 CMH 2 O。当左心室的压力达到这一点上，它是最有可能的准备是将要从针切断。以确保心室以及消化，几滴流过的可从心脏下方被收集到培养皿和检查，以查看是否有任何活的，静止细胞都存在。
由此产生分离的细胞从这个程序能够很好的免疫细胞。它们可以使用常规的固定方法29（ 即福尔马林，多聚甲醛，将冰冷的甲醇或丙酮）是固定的，但通常用于新生儿cardiomyoctyes通透性比更高水平有时需要图像细胞质蛋白或蛋白结构（ 即 α-肌动蛋白，β球蛋白）。最后，可以将细胞培养，并随后感染了腺或慢病毒操纵基因的表达，或用于细胞收缩装置的功能分析。
成年小鼠CM的文化早已被描述为具有挑战性的。用描述的技术在这里，我们可以定期的文化，这些细胞长达72小时，虽然功能细胞的产量36小时后显着下降。当培养的细胞中，是非常重要的细胞可以在37℃下在2％CO 2的镀覆。这是新生儿的CM，这倾向于在10％的CO 2，以进行培养的第24小时，然后切换到5％的CO 2，或新生儿心脏成纤维细胞，这也更喜欢，5％CO 2的不同。电镀和培养基可以达到平衡，使得溶解的CO 2为2％。
将细胞接种于层粘连蛋白包被的盖玻片上，使得它们不会抬离玻璃当媒体被改变。然而，心肌细胞不重视很牢固的玻璃甚至与层粘连蛋白涂层。因此，这是非常重要的改变培养基时，用无菌吸管的谨慎服用，而不是一个真空抽吸系统。一旦进入细胞S是镀，它们可以通过培养病毒的时间不超过2小时，进行转染腺病毒。时间取决于病毒和蛋白过度表达的效价，因此我们建议进行初步实验，以确定病毒的LD 50和ED 50。在大多数情况下，我们使用20-100的MOI的腺病毒。一旦细胞已被孵育病毒，靶基因（次）的表达通常需要〜24-36小时。
被镀上一个合适大小的盖玻片为MMSYS系统腔室分离的细胞也可以被用于收缩和钙处理使用MMSYS成像系统进行分析。这些盖玻片可直接放置到室中，并且培养液中可以通过打开和灌注系统上被移除。如果该细胞不被培养，并在分离后直接被用于分析，可以将它们直接加入到腔室一次盖玻片已放置。而这是没有必要预先涂有层粘连蛋白的盖玻片在分析新鲜分离的细胞中，在我们的经验，层粘连蛋白确实帮助细胞更好地附着在盖玻片。使用慢速流动速率为MMSYS单元还确保了细胞保持附着在盖玻片。最后，显微镜，特别是物镜的光学系统必须严格每次实验之前，清洗，以允许所需的收缩力的评估肌节的准确的可视化。
该MMSYS系统中最重要的组成部分是单列直插式流体加热器加热的灌注缓冲液（B）中，因为它流入腔室。这台设备的产热元素的目的是通过对流传热传递流体进行热交换，因此，如果流不存在，交换机会过热并可能造成不可弥补的损坏系统。因此，至关重要的是，该加热器被打开时启动的流后进行。
成年心肌细胞的收缩装置分析的其他方法先前已被描述，包括使用原子力显微镜30-32复杂的方法。其中一些方法允许对局部收缩力和例如杨氏模量特性更精密测量，使它们更适合于不规则形状的细胞或细胞没有明确定义的肌节的系统，如从诱导的多能干细胞衍生的CM的测量。这些技术可以很容易地分离出成人CMS上使用。该MMSYS系统的优点是相对容易测量收缩力和测量的时间在细胞中有明确的肌节在短时间内大量的细胞的能力。此外，可以测定该细胞的长度或肌节间长度的软边缘及肌节分析系统分别允许两个不同的（但Ř兴高采烈的）方法来测量收缩。数据采集软件结合先进的，用户友好的分析软件，使该系统易于学习和使用。最后，同时测量钙动力学的能力允许对收缩力和钙稳态，这是不可行的用原子力显微镜之间的相关性。此外，由于数据输出是一个钙激活染料（Fura2-AM）的比例计量，以正确的校准，可以收集细胞内钙浓度的绝对测量。
成功的记录从成人的心肌细胞离子通道信号需要细胞处于最佳状态。紧随隔离它们不贴壁，并在溶液中漂浮的细胞，电镀;在此阶段不能进行研究。在几个小时内，他们将坚持涂盖玻片，这是在这一点上，他们可能会进行研究。根据我们的经验在几个小时之内修补电镀产生最佳的结果，因为等待时间过长产生不利影响的细胞。如上所述，测试的静息膜电位建立千兆欧姆密封并破入细胞后，以及建立一个千兆欧姆密封件本身是两个参数，反映了细胞如何健康处于修补的时间的能力。虽然它是比较容易修补到细胞中未收缩，这不是一个先决条件，充足的密封件可上跳动的细胞以及获得。在这一点上使用的协议依赖于膜片钳研究的目标;使用电流钳技术，自发或诱发动作电位可以被记录下来。可替换地，电压钳位可用于研究特定的离子通道。由于在膜通道的盔甲，例如录音中的离子通道阻断剂的存在下，通常执行。河豚毒素（TTX），尼索地平，和铯经常被用于阻断钠，钾，钙通道分别althouGH多种药物已被使用，其使用的细节已经发表了大量文章。大多数方法涉及任一记录电流之前和之后的离子通道阻断剂的应用和减去的电流，和/或阻断背景频道与相应的受体阻断剂在记录之前。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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