Summary
여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.
Abstract
문화의 기본 심근 (CMS)의 사용은 심장 질환에 대한 우리의 이해를 발전에 심장 질환의 생쥐 모델에 강력한 보완을 제공하고 있습니다. 특히, 질병 상태와 질병을 일으키는 돌연변이에 의해 이온 항상성, 이온 채널의 기능, 세포의 흥분과 자극 수축 커플 링과 그 변화를 연구 할 수있는 능력은 심장 질환에 중요한 통찰력을 이끌고있다. 또한, 문화에 성인 CMS에 모방 할 수있는 적절한 불후의 세포 라인의 부족, 그리고 신생아의 CM 제한 (성인 CM을의 구조와 기능 생체 역학 특성의 많은 부족하는) 신호 전달 경로 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 우리의 이해를 방해했다 이온 채널과 성인 고립 심근 공부의 중요성을 강화 성인 심장의 수축 특성. 여기, 우리는 아데노 바이러스-간편 체크인 의해 유전자 발현의 분리, 문화, 조작 방법을 제시ssed 단백질 및 성인 쥐에서 심근의 다음 기능 분석. 이러한 기술의 사용은 셀룰러 흥분성 조절 경로, 칼슘 2 + 역학과 수축성 시그널링에 기계론 통찰력을 개발 및 심혈관 질환의 많은 생리 학적으로 중요한 특성을 제공하는 것을 도울 것이다.
Introduction
심혈관 질환의 생쥐 모델은 잠재적 인 치료 대상에게 1,3를 식별하기위한 근본적인 질병 메커니즘 1,2 해명뿐만 아니라 효과적인 도구로 봉사했다. 특히, (예 : 압력 과부하 등) 취득 심장 질환의 두 쥐 모델 4,5 형질 전환 마우스 모델의 사용은 심장 질환 6-8에 대한 우리의 이해를 전진했다. 단일 세포 수준에서 심장 11-13 셀룰러 흥분성 및 여진 수축 결합을 기초 개별 단백질 시그널링 캐스케이드 3,9,10 및 변경을 연구 세포 배양 기술의 사용은 생체 내 마우스 모델을 갖추고있다. 그러나, 성인 CM 구조와 기능을 반영하는 적당한 세포주의 부족은 상당한 제한되었다. 조사자는 이종 발현 시스템에서, 같은 이온 채널 개별 단백질을 공부하여이를 극복하기 위해 노력했다
기본 신생아 쥐의 심실의 심근 (NRVMs)는 문화에 상대적으로 쉽게, 유전자 발현 (15)를 조작하는 아데노 바이러스와 lentiviruses에 감염 될 수있다차 때문에 성공적으로 1 사용하지만, 자신의 한계가되었습니다. 그들은 생리적 미시 1을 제공하고 신호 필드의 주력되었지만, 형태와 NRVMs 성인 된 심근의 세포 내 조직 사이에 상당한 차이가 그들에게 어른의 마음에 이온 플럭스와 여기 수축 커플 링의 조사를 위해 부적당 한 모델을 . 특히 NRVMs는 결정적인 T-관 서브 4를 부족합니다. 칼슘 2 + 유출 및 역학 성숙한 T-관과 근질 세망 (SR) 구조 6, 칼슘 2 + 역학과 NRVMs에서 심장 수축의 기능 연구에 매우 의존하기 때문에 성인 심근에서 이러한 중요한 프로세스를 정확하게 반영하지 않습니다. 또한, 신호 전달 경로의 일부 구성하여 다른 질병 과정을 연구하기위한 제한과 그 난을 제공, 신생아와 성인 마우스 (9) 사이에 차이가NRVMs에있는 세포의 흥분과 수축에 MPACT. 마지막으로, 수축기구의 분포는 수축성 측정의 정확도를 제한하는 다 방향과 불균일 셀 단축에 이르게한다.
격리 성인 심장 근세포의 사용은 따라서 더욱 정확한 생체 모델링 시스템을 제공한다. 쥐의 유전자 조작에 의해 가능하게 기술의 특별한 성장은 생쥐에서 기능적 격리 심근를 얻는 중요성을 강조한다. 사실, 마우스 모델에서 격리 성인 CM을의 특성은 많은 생물 학적 및 병리학 적 이벤트에 빛을 발산하고있다. 형질 전환 마우스 모델에서 고립 CMS가되어에서 얻은 정보를 보완, 이러한 허혈 / 재관류 (17, 18) 등의 질병 모델에서 증가 또는 단백질의 기능의 손실 단일 세포 2,16의 수축 특성에, 그리고 생존의 연구를 허용 한 생체 내 연구SE 마우스. 또는 (생리 비대를 모델링) 운동 5,21 검사를 위해 수 있습니다 (모방 고혈압이나 대동맥 판막 협착증이되도록 가로 대동맥 수축에 의한 압력 과부하 등) 취득 심장 질환 3,19,20의 쥐 모델에서 고립 된 성인 CM을 사용 단일 세포 수준에서 세포의 흥분과 자극 수축의 커플 링이 과정에 연루 신호 폭포의 상호 작용. 또한, CM이 성인에 아데노 바이러스 기반 유전자 발현을 사용하여 유전자 발현을 조작하는 능력을 우리에게 복잡한 신호 전달 경로의 성분을 해부하는 기회를 제공한다.
전기 생리학 관점에서 전체 셀 전압 및 절연 성인 CMS의 현재 클램프 실험 기준에 이온 플럭스의 본질을 해명 및 다양한 질병 상태에 중요한되었습니다. 인해 세포막의 복잡한 구조 및 차동 PROTE의성인 CMS와 NRVMs 또는 이종 세포주 사이 폴딩 구조에서, 성숙한 세포를 패치 할 수있는 능력은 특정 막 단백질, 구조 단백질, 및 성인 심장의 전기 생리 성분에 이온 채널의 상호 작용 파트너의 영향을 더 잘 표현을 제공한다.
성인 쥐의 심근 공부를 분리하고 성인 쥐의 심근이 도전이 배양, 가능한 마우스 심근를 분리하고 바이러스를 사용하여 추가로 유전자 조작을 허용하는 문화를 유지하기 위해 방법론의 체계적이고 정확한 설명의 필요성을 촉구하고있는 등 눈에 띄는 장점에도 불구하고 벡터. 이전 연구는 급성 고립 된 마우스 성인 CMS 또는 배양 된 쥐 성인 CM이 중 하나를 사용하고 있습니다. 후자는 성인 마우스 CM을보다 문화에 쉽게, 그리고 체외에서 유전자 발현을 조작하는 대부분의 실험은 쥐 성인 CMS에 사용했다. 몇 가지 연구가 성공적으로 변경하고를 functi을 조사 하였다실험의 범위에 큰 제한을 제시하는 마우스에서 성인 CM을 ONAL 유전자 발현. 따라서, 우리가 구체적으로 격리 7,8,22, 문화 3,10,15,23, 아데노 바이러스 감염 11-13,15, 성인 마우스 심실 된 심근의 기능 분석에 대한 이전의 연구에서 수정 된 방법론을 제시한다. 이 격리 프로토콜 우리는 최대 72 시간 동안 성공적으로 배양 일시적으로 아데노 바이러스로 형질이 칼슘 2 + 허용, 흥분 심근 결과. 이러한 고립 된 세포의 기능 MMSYS 이미징 시스템 14, 24 및도 논의 될 패치 클램프를 사용하여 평가 될 수있다.
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Protocol
1. 심근 격리
자료 (그림 1)
집게를 Microdissecting
조직 겸자
섬세한 지혈 겸자
지혈 겸자
Microdissecting, 톱니 모양, 곡선 포셉
운영 가위, 직선
운영 가위, 곡선
15 ML 팔콘 튜브 (5)
60mm 페트리 접시
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
나일론 메쉬 - 400 μm의 기공 크기
작은 깔때기
왁스 코팅, 꼰 실크 4-0, 19mm, 길이 7-10cm
비 피하 주사 바늘, 무딘 끝, 24 G 또는 상업적 동물 먹이 바늘 (W/1-1/4, 24 x 1)
헤파린 나트륨
케타민 / 자일 라진 혼합물
파스퇴르 피펫
OptiVision 해부 고글
IonOptix MMSYS 시스템
참고 : 세포를 배양하면,이 프로토콜을 시작하기 전에 세포 배양에 2 절을 참조하십시오.
참고 : 모든 생쥐에 든다고했다승인 IACUC 규정, 관행 및 절차에 따라 차단 시설 희생.
주 : 이전 절차를 시작하기에, 전체 시스템은 랑겐 시스템 (그림 2A, 그림 3)의 모든 요소가 적절하고 완벽한 콜라게나 제 활성 수 있도록 37 ° C로 가열되는 것을 보장하기 위해 예열해야합니다.
- 150 USP 단위 복부 공간으로 나트륨 헤파린과 성인 마우스 (12 ~ 주) 주사.
- 중량 의존 양 (표 1)에 케타민 / 자일 라진 혼합물의 주입 마취.
- 80:12 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine) : 자일 라진 조리법 : 2.6 ML 케타민 (100 ㎎ / ㎖) + 0.4 ml의 자일 라진 (100 ㎎ / ㎖) + 37 ml의 PBS. 최종 : 케타민 = 6.5 ㎎ / ㎖, 자일 라진 = 1 ㎎ / ㎖
- 운영 패드에 진정 마우스를 고정하는 마음을 절제하고, 실내 온도 PBS의 요리 또는 0.9 % 생리 식염수 (그림 1J)에 배치합니다. PHYsiologic 식염수는 그대로 심장 챔버에서 혈액의 더 나은 압출 및 1.6 단계 이전에 대동맥 쉽게 식별 계약을 체결 할 수 있습니다. 쥐들은 깊게 뒷다리 발가락 핀치 반사 전에 개흉술의 발병에 호흡 속도의 둔화의 손실을 통해 마취되는 것을 보장하기 위해 선택되었다.
- 대동맥을 파악하고 노출 OptiVision 해부 고글 (그림 1A)를 사용합니다. 대동맥 루트가 명확하게 볼 수있는 경우는 용기의 시각화를 촉진하기는하지만, 대동맥 주위의 조직을 제거하면 세포 분리의 최적화를위한 필요가 없습니다.
- 프라임 관류 버퍼 펌프 (표 2). 온도가 사용하는 절차의 기간 동안 37 ° C에서 개최한다 수욕 (그림 2D)을 순환 제어.
- 랑겐 장치 (그림 2A)에 마음을 탑재합니다. 두 개의 마이크로 해부 집게 (그림 1D-E)를 사용하여 홍보말초 끝에 실리콘 튜브 비 피하, 무딘 엔드 바늘 (24 G)의 주위 대동맥을 IME. 또는 (W/1-1/4, 24 x 1) 상용 동물 먹이 바늘을 사용할 수 있습니다. 24 G 바늘이나 동물 먹이 바늘에 실리콘 튜브는 홈에 봉합을 확보하실 수 있습니다. 양말로 바늘에 대동맥을 놓습니다. (그림 2C).
- 참고 :이 심각한 것대로, 좌심실에 대동맥 밸브를 통해 연장하지 않는 바늘의 끝이 이상적으로 오른쪽 무명의 대동맥 루트 말단에서, 상행 대동맥에 달려 있는지 확인하는 것이 중요하지만, 효과적으로 관상 동맥을 통해 심장을 관통 perfuse하는 버퍼의 능력을 제한한다.
- 넥타이 오른쪽 무명의 arter 아래, 상행 대동맥의 수준에 있음을 보장 대동맥의 상단 주위 (7-10 ㎝ 길이) 봉합 실크의 작은 길이 (그림 1K)를 묶어서 바늘에 마음을 고정Y 있지만 바늘의 단부 위에.
- 적당한 주위 온도를 유지하는 데 도움이되는 원뿔 유리의 내부 (그림 2B)로 마음을 낮 춥니 다.
- 1 ㎖ / 분의 속도로 5 분 동안 관류 완충액으로 심장 Perfuse 및 관류가 원추형 유리 수집하고 심장을 싸고 있도록 유리 챔버 유출 클램프. 심장을 소화 대한 회로도는도 3에 도시된다.
- 이 시점에서 당신은 심장 증가의 볼륨을 볼 수 있습니다. 또한, 심장 조직에 혈액이 조직 창백 원인, 관류 액으로 대체됩니다.
- 관류 액을 배출 유출 클램프를 해제합니다. 효소 버퍼 용기 (그림 2E)로 관류 버퍼 컨테이너에서 튜브를 이동하는 펌프를 중지합니다. / 분 1 ㎖에 효소 버퍼 (표 2)와 함께 마음을 perfuse하기 시작 펌프를 다시 시작합니다. 효소 버퍼 봉투 수 있도록 다시 유출 클램프마음.
- 여기에, 효소가 심장을 관류하고 결합 조직을 소화 한, 마음이 창백하게되고 구조적 무결성은 감소 할 것이다.
- , 소화 마음에서 심실을 잘라 원뿔 유리로 마음을 들어 올려 부드럽게 집게로 마음을 짜 작은 페트리 접시에 관류 액 몇 방울을 수집하고 하나의 세포가 삭제되는지 여부를 확인하는시기를 결정하는 .
- 초보자의 경우는 압력계와 관류 라인을 연결하는 것이 도움이된다. 심장이 소화 점점되면 결합 조직의 저항을 보유하지 않는 압력이 급격히 감소합니다. 혈압계는 바늘의 위치가 대동맥판 위와하지 뇌실에 있는지 확인하는 것도 초보자에 유용하다. 낮은 압력은 바늘 심실 챔버에 위치하며 고압 니들 밸브 닿을 나타내는 것을 나타낼 것이다.
- 접시에 심장의 심실을 잘라심실 압력이 당신이 관류에 하나의 셀을 참조 할 수있을 때 극적으로 떨어 뜨리거나하기 시작하면 전송 버퍼 (A) (표 2)의 전체. 이것은 일반적으로 ~ ~ 10 분입니다.
- 다시 (그림 1C) 마이크로 해부 집게를 사용하여, 해리 작은 조각으로 심실를 말하다. 성공적으로 소화 조직의 대부분이 해리에 따라 비정질되고으로 닦지 후 조직의 거의 고체 덩어리를 떠나지 않을 것입니다.
- 또한, 조직을 떼어 놓다 끝 ~ 45 ° 각도로 절단했다있는 플라스틱 파스퇴르 피펫 (그림 4)를 사용하여 / 아웃 솔루션을 피펫합니다. 본 변형 예에서는 조직이 연화 될 때 피펫 팁, 따라서 세포에 전단 응력의 양을 감소하는 내경 공간을 증가시키는 역할을한다.
- 집게로 조직을 해부하기 전에 개별 실을 분리하고 별도로 심방, 심실 또는 맞 해리 할 수 있습니다T 심실 세포.
- 클램프를 사용하여 작은 깔때기 (그림 1 L)에 제곱 메쉬 (그림 1M)를 확보하고 15ML 팔콘 튜브 (그림 1I)에이 여과 장치를 배치합니다.
- 접시에서 세포 용액을 제거하고, 팔콘 튜브에 솔루션을 필터링하기 위해 수정 된 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- (살아있는 세포의 침전이 2-4 분 소요) 라이브 세포가 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 4 별도의 15ML 팔콘 튜브에 네 칼슘 솔루션 (표 3)의 각각의 나누어지는 2.5ml를.
- 다시 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여 조심스럽게 튜브의 바닥으로부터 세포 펠렛을 제거하고 칼슘의 용액 제에 세포를 옮긴다.
- 세포는 마지막 때까지 용액에 세포가 튜브의 바닥에 침전하고 후속 칼슘 용액에 1.17 단계를 반복하는 것을 허용한다.
- 세포가 사톤에 정착시키지 말라H 칼슘 솔루션을 제공합니다. 튜브 캡을 옆으로 돌립니다.
2. 세포 배양
- 격리, 접시 1 UG / ㎖ 자연 마우스 유리 커버 슬립 위에 라미닌 및 37 ° C에서 최소 1 시간 동안 배양하고 2 %의 CO 2 전에. 또한 도금 및 배양 배지 (표 4) 37 ° C에서 인큐베이터에서 따뜻하게 2 % CO 2 할 수 있습니다. 이 매체에 용해 된 CO 2는 평형 수 있습니다.
- 미디어에서 정상을 제거하지 마십시오. 단순히 오염을 방지하기 위해 상단을 풉니 다.
- 분리 된 세포가 팔콘 튜브의 하단에있는 펠렛 할 수 있습니다.
- 미디어 도금의 적절한 양의 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과에 resuspend을 사용하여 펠렛을 제거합니다.
- 적절한 크기의 접시에 라미닌 코팅 커버 슬립에 세포를 플레이트와 37 ° C에서 부화하고 2 % 이상 30 ~ 60 분에 대한 CO 2 세포가 커버 슬립을 준수 할 수 있도록.
- ** 아데노 바이러스로 형질 경우 도금 매체의 적절한 양으로 바이러스를 희석 바이러스 - 함유 매체와 접시에 도금 미디어를 교체한다. 바이러스가 37 ° C에서 2 시간 2 %의 CO 2 세포에 품어 보자. **
- 요리에서 도금 용지를 제거하고 배양 배지로 교체.
- 커버 슬립에 세포를 방해하지 않도록 조심스럽게 매일 문화 미디어를 변경합니다.
이 절차를 사용하여, 세포가 성공적으로 최대 72 시간 동안 배양되었다. 형질 전환 배양 GFP 세포의 이미지는 그림 5에서 찾을 수 있습니다.
3. MMSYS 시스템
- 아크 램프가 처음 시작되는 것을 보장 MMSYS 시스템의 전원을 켭니다.
- 펌프에서 MMSYS 챔버의 적절한 입구와 출구 (그림 6)에 튜브를 연결합니다.
- 프라임 칼슘 완충액 (B)를 가진 시스템 (표 2).
- 하거든 Appr 배치챔버 및 건다 (그림 6E)에 opriately 크기의 유리 커버 슬립. 대부분의 MMSYS 챔버는 22mm 또는 25mm 사각형의 coverslips 하나를 사용하십시오. 당신의 챔버에 적합한 커버 슬립을 결정하기 위해 MMSYS 사용자 설명서를 참조하십시오.
- 작은 에펜 도르프 튜브에 세포 용액 500 μl를 전송합니다.
- 세포의 작은 튜브에 0.5 μL Fura2-AM (1 ㎍ / μL의 원액)를 추가하고 5-7 분 동안 실온에서 어둠 속에서 부화 할 수 있습니다. 이 Fura2-AM은 세포막을 통해 빠른 수동 확산을 통해 세포에 "로드"할 수 있습니다.
- 의 Fura-2로드 된 세포가 튜브의 바닥에 펠렛시켜, 칼슘 버퍼 B. 500 μL와 과량의 Fura 흘려
- 실내 조명을 끄십시오.
- 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버 (그림 6C)의 중심에 "로드"셀 솔루션 (세포 농도의 따라) 1 ~ 2 방울을 떨어 뜨려 세포 t이 허용O 5 분의 coverslip에 정착.
- 챔버에서 세포의 밀도는 단일 비 중첩 셀 쉽게 MMSYS 데이터 수집 플랫폼에서 볼 수있는 것이어야한다.
- 조심스럽게 챔버를 통해 칼슘 버퍼 (B)를 유동하기 시작합니다.
- 37 ° C.에 챔버 온도를 증가
- 중요 : 흐름이 개시 될 때까지 가열 장치를 켜지 마십시오. 이것은 심각하게 피드백 thermocoupler (그림 6A)를 손상시킬 수 있습니다.
- 연결 전선 (그림 6B)를 통해 챔버 MyoPacer에 연결되어 있는지 확인하고 1.5 배 세포에 대한 서성 거려 임계 값에서 세포에게 5 Hz에서 페이스를 시작합니다.
- 정확한 주파수에서 뛰는 셀을 선택하고 프레임 조리개로 이동합니다.
- 셀 전체가 수평 방향, 윈도우의 중심에 오도록 sarcomeres의 AP와, 카메라와 프레임 개구 치수를 조정부모.
- 셀 길이의 경우 셀의 가장자리 (좌우), 포토 다이오드 표시를 붉은 색과 녹색을 조정합니다. 셀의 가장자리에 흰색 / 검은 색 대비를 최적화하기 위해 대비를 조정합니다. 자세한 내용은 Ionoptix 설명서를 참조하십시오.
- 잘 정의 된 sarcomeres를 포함하는 셀의 영역에 상자를 놓고 파워 스펙트럼 (적색)의 피크를 최적화하기 위해 초점을 조정합니다. 또한 청색 평활화 윈도우 및 검은 콘트라스트 정보를 최적화하는 현미경의 밝기를 조정한다.
- 빨간색 전원 스펙트럼 (피크)과 가능한 한 작은 배경 많이 캡처 녹색 임계 값 막대를 조정합니다.
- 녹음을 시작합니다.
- 충분한 데이터가 기록 된 후, 녹음 일시 정지 "일시 중지"를 클릭하고,보기 윈도우의 초점도 크기도가 변경되는 것을 보장, 어떤 세포 또는 세포 물질이있을 수있는 커버 슬립의 영역으로 현미경의 무대를 이동 본. 렌기록 GTH는 조사의 실험 프로토콜에 따라 달라집니다.
- 참고 : "중지"를 클릭하면 녹음이 중단되며 더 배경은 셀에 기록 할 수 없습니다.
- 배경 측정을 기록하는 "다시 시작"을 클릭합니다.
- 충분한 배경은 녹음을 종료하려면 "중지"를 클릭 기록 된 후.
- 하나. ZPT 파일에 해당 셀에 대한 모든 흔적을 저장하려면 "파일 >> 저장"을 클릭합니다.
- 충분한 세포가 기록 될 때까지 3.20 - 반복 3.12 단계를 반복합니다.
- 기록 된 데이터의 분석에 대한 지침은 IonOptix-MMSYS 사용자 매뉴얼 (12)를 참조하십시오. 야생 형 심근의 특징 기록 된 데이터는 그림 7에 나와 있습니다.
4. 패치 클램프
서로 다른 종류의 세포 패치 클램프는 잘 저널 25 ~ 28 이전에 기술되어있다. 따라서 우리는 일부 비판에 초점성인 심근의 성공적인 패치 클램핑 알 매개 변수는 우리의 프로토콜을 사용하여 설명입니다.
- 피펫 풀러와 붕규산 유리 (필라멘트 : OD 1.5 mm, 0.86 mm ID - 10cm 길이)를 사용하여 피펫 용액 (표 5)로 가득 할 때 ~ 2.0-3.0 MΩ 전시 피펫을 당깁니다.
- 불 닦으 부드럽게 Narishige 또는 다른 수직 화재 폴리 셔를 사용하여 피펫 팁. 패치 피펫의 저항은 불 연마 후 2 ~ 4 MO해야한다.
- 컴퓨터, 앰프 (Axopatch 200B), AD 컨버터 (Digidata 1440A, 축삭 악기)과 미세 조작기 (MP-285)를 켭니다. 전체 세포 패치 클램프를 위해, 우리는 전술 한 바와 같이 표준 매개 변수와 함께 시작합니다.
- 배양 성인 CMS에 대한, 인큐베이터에서 제거하고 부드럽게 CM을 실온에서 PBS로 도금되어있는 coverslip을 씻어.
- 부드럽게 커버 슬립을 제거하고 거꾸로 현미경 (니콘 TE 2 재관류 챔버에 배치000).
- (흡입 용) 관류 시스템 및 콘센트 입구 그냥 커버 슬립의 표면 위에 있는지 확인합니다.
- 적절한 세포 외 용액 (표 5)와 관류 시작합니다.
- 갓 해리 성인 CMS에 대한 상기와 같이 관류 시스템에서 콜라겐 코팅 coverslip에 배치합니다.
- 세포가 솔루션에있을 것입니다 때문에, 부드럽게 세포 버퍼 솔루션을 교체합니다.
- 수정 된 파스퇴르 피펫 (그림 4)를 사용하여 부드럽게 세포 버퍼에 세포를 재현 탁 나누어지는을하고 커버 슬립에 놓습니다.
- 세포를 8.8에서와 같이 관류를 시작하기 전에 15 분 동안 부착하자.
- 백 채우기이 Microfil (세계 정밀 계측기, 28 G) 바늘을 사용하여 세포 내 버퍼 전체 세포 패치 피펫. 공기 방울이 피펫 팁에 없는지 확인; 온화 기포 하던가에 떠 있도록 탭용액 CE.
- 미세 전극 내부 솔루션 사이의 접촉이 있다는 것을 보장 피펫 홀더에 못 패치 피펫을 연결합니다.
- 우리는 염화은 전극을 사용하지만, 가정용 표백제에 하룻밤 담가 실버 와이어는 적어도 일주일에 한 번 'chloriding'알아서.
- 조심스럽게 목욕 전극은 욕조 / 세포 외 용액에 항상 담겨지고 보장, 욕조에 피펫을 낮 춥니 다. 이 때 액체 접합 전위 오프셋. 큰 접합 전위는 전극에서 염화은 악화의 징후 일 수있다.
- 건강한 성인 원통형 CMS는 현미경에서 식별 및 시야의 중심에있다. 전술 한 바와 같이, 미세 조작기를 이동 및 초점 조정의 조합 부근 패치 피펫의 근접성 및 CM의 표면을 허용한다.
- 그들이 동일 초점면에지면, 우리는 카메라의 조합을 사용셀 (Axopatch 200B에서 사용 가능) 테스트 펄스 화.
- 피펫의 저항 (피펫 세포의 표면과 접촉하는 것을 제안), 그리고 셀은 원통형 모양 계속 반으로 감소하면, 우리는 부드러운 흡입을 이용하여 도장 기가 옴을 확립한다.
- CMS에 대한, 우리는 부정적인 압력을 설정하는 입 흡입을 선호한다. 기가 시일이 성공적으로 취득하는 경우, 우리는 다시 전체 세포 패치 모드를 설정하기 위해 셀에 '브레이크의'로 부드러운 리듬 입 흡입을 사용합니다.
- 건강의 CM 일반적인 휴식 전위는 -85 -90 값의 순서로되어 있습니다. 기가 시일 취득하면, I = 0 펜실바니아와 현재의 클램프를 사용하여 휴식 막 잠재력을 측정합니다.
- 휴식 막 잠재력이 화되면이 손상된 세포 또는 가난한 씰을 표시 할 수 있습니다.
- CMS가 표면적의 많은 큰 세포 때문에 세심한주의가 특히 승, 보상 커패시턴스 지불 할 필요가이러한 나트륨 채널로 암탉 빠르게 활성화 전류는 공부해야합니다. 적절한 커패시턴스 보정하여 얻어 질 수없는 경우에 펄스 발생기에 보상 설정 내장, 서브 임계 전압에서 prepulses와 반대 극성을인가하고 기록 된 신호로부터 감산 결과 현재해야 할 수도있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 Axopatch에 프로그램된다.
- 전체 세포 패치 모드가 설정되면, 평형 수 있도록 15 분을 대기 전에 시작 전압 또는 전류 클램프 프로토콜 씰의 안정성을 보장합니다. 우리는 이전에 설명 된 표준 프로토콜 및 기타 저널을 사용에 자세히 설명하지 않습니다.
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Representative Results
막대 모양의 가로 무늬 및 (자발적으로 박동하지 않음) 대기 셀 (그림 5A) 성인 된 심근 실적의 분리. 죽은 세포는 둥근 볼 것없고 줄무늬가 존재하지 않습니다. 대기 세포 배양과 유전자 발현 (그림 5B 및 5C)를 조작하는 아데노 바이러스로 형질이 될 수 있습니다. 배양은 24 시간, 생균의 형태가 변화하지 않는 후에, 그들은 여전히 칼슘 2 + 내성이며, 그들은 필드 자극으로 진행된다. 제안 된 절차, 80~90% 생존 세포의 수율이 달성 될 수있다.
세포의 수축력을 측정하기 MMSYS 시스템 소프트웨어는 근절 또는 셀 길이의 하나의 변화를보고 현미경으로부터 위상 정보를 걸린다. 야생형 C57BL6 마우스의 근절 길이 측정을 통해 대표 수축 트레이스 (그림 7A)에 표시됩니다. 에서 건강한 성인 마우스의 근육 세포에 대한SE 마우스는 기준선 근절 길이는 ~ 1.7-1.9 μm의 수 있습니다. MMSYS 시스템 소프트웨어는 동시에 칼슘 - 활성화 된 염료 Fura2-AM의 결합되지 않은 형태로 결합의 비율을 측정함으로써 수축 및 칼슘 처리를 측정 할 수있다. 비 조치 설정에 따라 약간의 차이가있을 수 있지만, 건강한 세포에 대한 비율은 일반적으로 1.5 ~ 2.5 (그림 7B) 사이에있다. MMSYS 시스템 칼슘 보정 한 경우,이 비율은 다음 세포 내 칼슘 농도의 절대 측정 값으로 변환 될 수있다. 수축성 칼슘 트레이스에서 생성 된 데이터를 분석하기 위해서, 트레이스는 그 셀에 대한 특성 트레이스 (도 7C 및 7D)를 만들기 위해 평균화되어야한다. 이러한 특성 흔적은 다음 수축기 및 이완기 기능에 대한 매개 변수를 생성하는 MMSYS 시스템 소프트웨어에서 monotransient 데이터 분석 알고리즘이 적용됩니다. 더 자세한 사항은 이온에 존재하는Optix의 설명서를 참조하십시오.
성인 마우스 심근는 활동 전위가 현재 클램프 모드로 촬영하는 전체 세포 패치 클램프 실험 (그림 8)의 대상이었다.
| 바디 무게 (g) | 케타민 / 자일 라진 (ML) |
| 15 | 0.18 |
| (20) | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| (30) | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| (40) | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| (50) | 0.62 |
표 1. 성인 마우스 무게 의존 케타민 / 자일 라진 투여 (80:12).
| 해결 | 조리법 |
| 타이로드 버퍼 * (산도 7.4) | 1 L의 DDH 2 O 137 mM의 NaCl을 4 mM의 KCl을 1 mM의 MgCl2를 10 mM의 HEPES 0.33 밀리미터의 NaH 2 PO 4 |
| 관류 버퍼 * (산도 7.4) | 500 ㎖의 타이로드 버퍼 10mM의 D-(+) - 글루코스, 최소 5 mM의 타우린 10 mM의 부탄 Monoxime (BDM) |
| 효소 버퍼 * | 50 ㎖ 관류 버퍼 0.024 g 콜라게나 D (유형 IV) 0.018 g 콜라게나 B (유형 II) 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의 0.003 g의 단백질 분해 효소 XIV |
| 버퍼로 이동 (A) | 45 ㎖의 관류 버퍼 5 ㎖ 소 혈청 알부민 (5 ㎎ / ㎖의 원액부터) |
| 칼슘 완충액 (B) | 1 L 타이로드 버퍼 1.2 ㎜ 염화칼슘 5.5 mM의 D-(+) - 글루코스, 최소 |
표 2. 성인 심근 절연 버퍼 요리법.
| [염화칼슘] | 버퍼로 이동 (A) | 칼슘 완충액 (B) |
| 0.06 밀리미터 칼슘 2 + | 9.5 ML | 0.5 ㎖ |
| 0.24 밀리미터 칼슘 2 + | 8.0 ML | 2.0 ML |
| 0.60 밀리미터 칼슘 2 + | 5.0 ㎖ | 5.0 ㎖ |
| 1.20 밀리미터 칼슘 2 + | 0 ML | 10 ㎖ |
표 3.Calcium 적정 솔루션 조리법.
| 중간 도금 | 문화 매체 |
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표 4. 도금 및 문화 미디어 조리법.
| 피펫 솔루션 | 목욕 솔루션 |
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표 5. 패치 클램프 해법 (도시 해법 나트륨 전류를 측정 용).
그림 1. .. 성인 심근 격리 악기 A) OptiVisor 광학 유리 쌍안 돋보기 B) 조직 겸자, 1 × 치아 5.5 -. Roboz 과학 C) 몰 로니 집게 -. Roboz 과학 DE) 뒤몽 - (11.5 cm) 길이의 약간의 곡선, 톱니 모양의 4.5 # 3 집게, Dumostar, 팁 크기 0.17 X 0.10 mm. F) 패커 Mosquito 집게 스트레이트 플랫 5 -. Roboz 과학 G) 마이크로 해부 가위 4.5 곡선 샤프 / 샤프 -. Roboz 과학 H) 스트레이트 샤프 / 샤프 20mm의 마이크로 해부 가위 3.5 -. Roboz 과학 I) 15 ML 팔콘 튜브 - 열 - 피셔 과학 J) 60mm 페트리 PBS K) Softsilk를 포함하는 요리 : 왁스 코팅 꼰 실크, 19mm - 코비 디엔 L) 플라스틱 깔때기, 6.0 cm 직경 M) 나일론 메쉬 - 400μm의 기공 크기.....
그림 2. 성인 심근 격리. B) 유관 마음. C) 비 피하 삽관 바늘의 확대보기를 따뜻하게하는 데 사용되는 중공 원추형 유리 수집 깔때기의 확대 표시에 사용 랑겐 장치.) 전체 랑겐 관류 시스템. (재사용 FeedinG 바늘 (24 G, 직선, 원형 팁 25 mm 길이, 파인 과학 도구 주식 상품 18061-24). D) 물 목욕을 순환 E) 물 살포, 효소 및 전송 버퍼를 배양 목욕.
도 3. 관류 시스템의 상세한 회로도.
그림 4. 수정 파스퇴르 피펫. 피펫은 약 45 ° 각도로 팁의 절단에 의해 수정되었습니다. 이것은 더 큰 표면적을 허용하고 그들이 분해되는 등의 세포에 적은 전단 응력을 만듭니다. 삽입 된 수정 된 팁의 가까이보기를 보여줍니다.
그림 5. 형질 전환 배양 GFP 심근.) 갓 isolat와 12 주 C57BL6 마우스에서 에드 성인 심근. 화살표는 죽었거나 죽어가는 세포를 가리 킵니다. 이 세포는 CM을. B) GFP 형질 성인 마우스 된 심근 (24) 문화. C)의 시간 배양 성인 마우스 심근 24 시간 후 후 건강, 막대 모양의 성인보다 더 반올림됩니다. 삽입 된 배양 심근 세포의 증가 배율을 보여줍니다.
그림 6. . MMSYS 시스템 챔버 블루 화살 관류 완충액 (완충액 B)의 흐름을 나타내는 A) 단, 라인 용액 히터 -... 워너 인스트루먼트 주식회사 B) MyoPacer 필드 자극기에 MMSYS 시스템 챔버로부터 전선을 연결 C) 백금 챔버의 중심에 위치 필드 자극 전극. D) 유출 저수지. E) 상공 회의소는 개방 위치에 클램프.
그림 7. 대표 MMSYS 시스템 데이터는 잭슨 연구소에서 얻은 야생형 C57BL6 마우스에 대한 기록. 칼슘의) MMSYS베이스 수축 추적합니다. B) 비율 칼슘 2 + 바인딩 + - 언 바운드 Fura2-AM은 기본 칼슘 성분을 생성하는 기록. 이러한 트레이스)의 수축력 측정에 대응한다. C) 특성 수축성 트레이스. D) B의베이스 트레이스에서 컴파일 특징 칼슘 자국)에 MMSYS 시스템 소프트웨어에 의해 컴파일베이스 수축성 트레이스 평균. 복합 트레이스의 분석은 연구자가 수축기 및 이완기 기능에 대한 대리 변수를 생성 할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 8. 야생형 성인 쥐 심근 세포의 활동 전위를 나타내는 패치 클램프 추적.
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Discussion
이 보고서에서, 우리는 마우스 마음에서 성공적으로 분리 및 성인의 CM 문화에 필요한 기술을 설명했다. 우리의 기술은 상술 한 방법을 이용하여 CM 기능 및 흥분성의 후속 연구를 허용한다. 성인의 CM 기능을 연구하는 중요한 매개 변수는 고립 된 CM이의 건강과 품질입니다. 전술 한 바와 같이, 우리의 기술은 아데노 바이러스 / 렌티 바이러스 배양의 감염 및 세포 흥분과 수축 기능의 분석을 사용하여 유전자 발현을 조작 의무 아르 기능성 세포의 높은 수율을 허용.
기능적 성인 쥐의 CM 분리를위한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 비 피하 바늘 상 정밀하고 심장의 급속한 삽관이다. 케어는 좌심실에 연결된 대동맥이 심장보다 쉽고 빠른 삽관을 허용하기에 충분한 길이로 해부 될 수 있는지를 확인해야합니다. t를 cannulating 때그 중심부는 바늘의 끝이 대동맥에 남아 및 관상 동맥을 통해 조직의 효율적인 관류 있도록 좌심실로 대동맥판지나 연장하지 않는 것이 필수적이다. 다음으로 중요한 단계는 실크 봉합사를 이용하여 바늘의 줄기로 대동맥을 확보한다. 관류 버퍼는 관상 동맥과 좌심실 공동 내로 유입되지만 retrogradely 해부 대동맥 또는 큰 혈관의 선단부 통해 antegradely 밖으로 흐르지 않도록 봉합사는 대동맥 묶여한다.
일부 연구자는 도움이 삽관의 품질과 효소의 연속 관류를 평가하기 위해 압력 게이지를 설정하는 찾을 수 있습니다. 100 CMH 2 O, 및 효소 관류시의 압력은 2 ~ 40-50 CMH O.로 감소 할 것이다 - 압력계를 사용하는 경우, 초기 좌심실 압력은 80 ~이어야 심실 압력이이 지점에 도달하면,이며가장 가능성이 바늘에서 절단 될 준비. 심실이 잘 소화되도록하려면 흐름을 통해 몇 방울은 페트리 접시에 심장 아래에서 수집 및 라이브, 정지 세포가 존재하는지 확인할 수 있습니다.
이 과정에서 생성 된 고립 된 세포가 아니라 면역 세포에 자신을 빌려. 그들은 정규 정착 방법 (29) (즉, 포르말린, 파라 포름 알데히드, 빙냉 메탄올 또는 아세톤)를 사용하여 고정 될 수 있지만,보다 permeabilization의 높은 수준은 일반적으로 신생아 된 심근에 사용은 때때로 화상 세포질 단백질 또는 단백질 구조에 필요하다 (즉, α- sarcomeric 말라, 베타 마이 오신). 마지막으로, 세포를 배양하고이어서 유전자 발현을 조작하기 위하여 아데노 - lentiviruses 또는 감염, 또는 셀룰러 수축성 장치의 기능적인 분석을 위해 이용 될 수있다.
성인 마우스의 CM 문화 긴으로 설명되었습니다도전. 기능성 세포의 수율이 36 시간 후에 현저히 감소 비록 여기에 설명 된 기술을 사용하여, 우리는, 일상적으로 배양 최대 72 시간 동안 이들 세포를 수있다. 세포를 배양 할 때, 세포는 2 % CO 2에서 37 ° C에서 도금하는 것이 필수적이다. 이는 처음 24 시간 동안 10 % CO 2에서 배양 한 다음 5 % CO 2,도 5 % CO 2의 선호 신생아 심근 아세포로 전환하는 것을 선호 신생아 cms의 상이하다. 용해 된 CO 2는 2 %가되도록 도금과 문화 미디어 평형을 할 수 있습니다.
미디어가 변경되는 경우가 유리의 리프트 오프되지 않도록 균체 라미닌 - 코팅 된 커버 슬립에 도금된다. 그러나, 심근도 라미닌 코팅 유리에 매우 안전하게 연결하지 않습니다. 그것은주의 멸균 피펫을 사용하여, 배양 배지를 변경할 때 찍은 아닌 진공 흡입 시스템 일 수 있다는 것이 매우 중요하다. 일단 세포의는 도금, 그들은 더 이상 2보다 시간 동안 바이러스를 배양하여 아데노 바이러스로 형질 할 수 있습니다. 시기는 바이러스와 표현을 통해 복지 단백질의 역가에 따라, 그래서 우리는 바이러스에 대한 LD 50 ED (50)를 결정하기 위해 예비 실험을 실시하는 것이 좋습니다. 대부분의 경우에, 우리는 아데노 바이러스에 대한 20-100의 MOI를 사용한다. 세포는 바이러스와 함께 배양 한 후, 목적 유전자 (들)의 발현은 일반적으로 24-36 시간 ~ 걸린다.
MMSYS 시스템 챔버에 대한 적절한 사이즈의 coverslips에 도금되어 격리 된 세포는 또한 MMSYS 촬상 시스템을 사용하여 수축성 칼슘 처리에 대해 분석 할 수있다. 이러한 커버 슬립 직접 챔버 내에 배치 될 수 있으며, 배양액 관류 시스템에 선회에 의해 제거 될 수있다. 세포가 배양되고되지 않고 직접 분리 한 후 분석을 위해 사용되는 경우에 커버 슬립이 배치되면, 그것들은 챔버에 직접 첨가 될 수있다. 동안그것은 갓 고립 된 세포를 분석 할 때, 우리의 경험에, 라미닌이 세포가 더 잘 커버 슬립을 준수하는 데 도움이 않습니다 라미닌와 커버 슬립을 코트에게 사전에 할 필요가 없습니다. MMSYS 유닛의 느린 유속을 사용하여 별도로 세포는 커버 슬립에 부착으로 유지. 마지막으로, 현미경, 특히 대물 렌즈의 광학 극명 수축성의 평가를 위해 필요한 sarcomeres 정확한 시각화를 허용하기 전에 각 실험으로 세정되어야한다.
MMSYS 시스템의 가장 중요한 구성 요소는 챔버로 유입로 관류 완충액 (B)를 가열 한 라인 유체 히터이다. 장비의 조각의 열 발생 요소는 대류 열 전달을 통해 유체를 통과하여 열을 교환하도록 설계되어 있으므로 유동이 존재하지 않는 경우, 교환기는 과열되어 회복 할 수 없게 시스템이 손상 될 수 있었다. 이 히터는 흐름이 시작된 후에 만 전원이 켜져 있는지, 따라서 필수적입니다.
성인 심장 근세포의 수축성 분석 장치의 다른 방법은 이전의 원자 힘 현미경 (30-32)를 사용하여 정교한 방법을 포함하여 설명되었다. 이러한 방법 중 일부는 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 CM을 명확하게 정의 sarcomeric 시스템이없는 불규칙한 모양의 세포 또는 세포의 측정을 위해 그들이 더 적합하고, 현지화 된 수축력과 같은 탄성 계수와 같은 속성의보다 정교한 측정 할 수 있습니다. 이 기술은 쉽게 고립 성인 CMS에서 사용할 수 있습니다. MMSYS 시스템의 장점은 명확하게 정의 수축성 sarcomeres 가진 세포에서 단시간에 다수의 셀을 측정하는 능력을 측정하는 비교적 용이하다. 또한, 셀의 길이 또는 sarcomeres 사이의 길이를 측정 할 수있는 소프트 에지 및 근절 분석 시스템은 각각 두 개의 서로 다른 (그러나 R 허용의기 양양) 방법 수축력을 측정합니다. 고급 사용자 친화적 인 분석 소프트웨어와 함께 데이터 수집 소프트웨어를 배우고 사용하는이 시스템은 쉽습니다. 마지막으로, 동시에 칼슘 역학을 측정 할 수는 수축성과 원자 힘 현미경으로 가능하지 칼슘 항상성 사이의 상관 관계에 있습니다. 데이터 출력은 칼슘 활성화 염료 (Fura2-AM)의 비율 계량 측정하기 때문에 또한, 정확한 교정과, 내부의 칼슘 농도의 절대 조치를 수집 할 수 있습니다.
성인 심장 근세포에서 이온 채널 신호의 성공적인 기록은 세포가 최적의 상태에 요구한다. 즉시가 부착되지 않고 용액에 뜰 것이다 세포의 분리 및 도금 다음,이 단계에서 그들은 공부를 할 수 없습니다. 몇 시간 내에 그들이 코팅 커버 슬립에 밀착하고 그들이 연구 될 수 있다는 것을이 점에서이다. 우리의 경험을 몇 시간 내에 패치에도금, 최적의 결과를 얻을 수에 악영향을 너무 오래 대기로 세포에 영향을 미칩니다. 기가 옴 시일을 확립하고 세포에 침입 한 후 휴지 막 전위뿐만 아니라, 그 자체가 세포 패팅시 얼마나 건강한 반영이 파라미터이다 기가 옴 시일을 확립 할 수있는 능력을 시험 상술 한 바와 같이. 이 계약되지 않은 세포에 패치를 쉽게하지만,이 전제 조건 아니다 충분한 물개뿐만 아니라 세포를 구타에 얻을 수있다. 이 시점에서 사용되는 프로토콜은 패치 클램프 연구의 목적에 따라, 현재의 클램프 기술을 이용하여, 자발적 또는 유도 된 활동 전위가 기록 될 수있다. 대안으로, 클램핑 전압은 특정 이온 채널을 연구하는데 사용될 수있다. 멤브레인의 채널 갑옷 관련 이러한 레코딩은 일반적으로 이온 채널 차단제의 존재하에 수행된다. 테트로도톡신 (TTX), 니솔 디핀, 세슘은 종종 각각 althou을 나트륨, 칼슘 및 칼륨 채널을 차단하는 데 사용GH 다양한 약물이 사용되어 있고, 그 사용의 정보 광범위 발표되었다. 대부분의 접근은 어느 녹화 이온 채널 차단제의인가 및 전류를 감산 전후 전류, 및 / 또는 이전 기록에 적합한 차단제 배경 채널 차단을 수반한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
