절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

요약

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

초록

문화의 기본 심근 (CMS)의 사용은 심장 질환에 대한 우리의 이해를 발전에 심장 질환의 생쥐 모델에 강력한 보완을 제공하고 있습니다. 특히, 질병 상태와 질병을 일으키는 돌연변이에 의해 이온 항상성, 이온 채널의 기능, 세포의 흥분과 자극 수축 커플 링과 그 변화를 연구 할 수있는 능력은 심장 질환에 중요한 통찰력을 이끌고있다. 또한, 문화에 성인 CMS에 모방 할 수있는 적절한 불후의 세포 라인의 부족, 그리고 신생아의 CM 제한 (성인 CM을의 구조와 기능 생체 역학 특성의 많은 부족하는) 신호 전달 경로 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 우리의 이해를 방해했다 이온 채널과 성인 고립 심근 공부의 중요성을 강화 성인 심장의 수축 특성. 여기, 우리는 아데노 바이러스-간편 체크인 의해 유전자 발현의 분리, 문화, 조작 방법을 제시ssed 단백질 및 성인 쥐에서 심근의 다음 기능 분석. 이러한 기술의 사용은 셀룰러 흥분성 조절 경로, 칼슘 ^{2 +} 역학과 수축성 시그널링에 기계론 통찰력을 개발 및 심혈관 질환의 많은 생리 학적으로 중요한 특성을 제공하는 것을 도울 것이다.

서론

심혈관 질환의 생쥐 모델은 잠재적 인 치료 대상에게 ^1,3를 식별하기위한 근본적인 질병 메커니즘 ^{1,2 해명뿐만} 아니라 효과적인 도구로 봉사했다. 특히, (예 : 압력 과부하 등) 취득 심장 질환의 두 쥐 모델 ^4,5 형질 전환 마우스 모델의 사용은 심장 질환 ^6-8에 대한 우리의 이해를 전진했다. 단일 세포 수준에서 심장 ^11-13 셀룰러 흥분성 및 여진 수축 결합을 기초 개별 단백질 시그널링 캐스케이드 ^3,9,10 및 변경을 연구 세포 배양 기술의 사용은 생체 내 마우스 모델을 갖추고있다. 그러나, 성인 CM 구조와 기능을 반영하는 적당한 세포주의 부족은 상당한 제한되었다. 조사자는 이종 발현 시스템에서, 같은 이온 채널 개별 단백질을 공부하여이를 극복하기 위해 노력했다 ^{(14)는,이 연구는 이온 채널 생물 물리학 또는 단백질 인신 매매, CM이의 기본 미시의 부적절한 표현의 측면에서 유용한 정보를 저희에게 제공하는 동안은 상당한 제한 사항입니다. 둘째, 이러한 이종 세포의 대부분이 성숙한 수축 장치를 가지고 있지 않기 때문에, 그것은 수축 기능 및 세포의 흥분과 수축 사이의 복잡한 상호 작용을 연구하는 것이 불가능했습니다. 이러한 이유로, 연....}

프로토콜

1. 심근 격리

자료 (그림 1)

집게를 Microdissecting
조직 겸자
섬세한 지혈 겸자
지혈 겸자
Microdissecting, 톱니 모양, 곡선 포셉
운영 가위, 직선
운영 가위, 곡선
15 ML 팔콘 튜브 (5)
60mm 페트리 접시
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
나일론 메쉬 - 400 μm의 기공 크기
작은 깔때기
왁스 코팅, 꼰 실크 4-0, 19mm, 길이 7-10cm
비 피하 주사 바늘, 무딘 끝, 24 G 또는 상업적 동물 먹이 바늘 (W/1-1/4, 24 x 1)
헤파린 나트륨
케타민 / 자일 라진 혼합물
파스퇴르 피펫
OptiVision 해부 고글
IonOptix MMSYS 시스템

참고 : 세포를 배양하면,이 프로토콜을 시작하기 전에 세포 배양에 2 절을 참조하십시오.

참고 : 모든 ....

결과

막대 모양의 가로 무늬 및 (자발적으로 박동하지 않음) 대기 셀 (그림 5A) 성인 된 심근 실적의 분리. 죽은 세포는 둥근 볼 것없고 줄무늬가 존재하지 않습니다. 대기 세포 배양과 유전자 발현 (그림 5B 및 5C)를 조작하는 아데노 바이러스로 형질이 될 수 있습니다. 배양은 24 시간, 생균의 형태가 변화하지 않는 후에, 그들은 여전히 칼슘 ^{2 +} 내성이며, 그들은 필드 자극으로 진행된다. 제안 된 절차, 80~90% 생존 세포의 수율이 달성 될 수있다.

세포의 수축력을 측정하기 MMSYS 시스템 소프트웨어는 근절 또는 셀 길이의 하나의 변화를보고 현미경으로부터 위상 정보를 걸린다. 야생형 C57BL6 마우스의 근절 길이 측정을 통해 대표 수축 트레이스 (그림 7A)에 표시됩니다. 에서 건강한 성인 마우스의 근육 세포에 대한SE 마우.......

토론

이 보고서에서, 우리는 마우스 마음에서 성공적으로 분리 및 성인의 CM 문화에 필요한 기술을 설명했다. 우리의 기술은 상술 한 방법을 이용하여 CM 기능 및 흥분성의 후속 연구를 허용한다. 성인의 CM 기능을 연구하는 중요한 매개 변수는 고립 된 CM이의 건강과 품질입니다. 전술 한 바와 같이, 우리의 기술은 아데노 바이러스 / 렌티 바이러스 배양의 감염 및 세포 흥분과 수축 기능의 분석을 사용하여 유전자 발현을 조작 의무 아르 기능성 세포의 높은 수율을 허용.

기능적 성인 쥐의 CM 분리를위한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 비 피하 바늘 상 정밀하고 심장의 급속한 삽관이다. 케어는 좌심실에 연결된 대동맥이 심장보다 쉽고 빠른 삽관을 허용하기에 충분한 길이로 해부 될 수 있는지를 확인해야합니다. t를 cannulating 때그 중심부는 바늘의 끝이 대동맥에 남아 및 관상 동맥을 통해 조직의 효율적인 관류 있도록 좌심실로 대동맥판지나 연장하지 않는 것이 필수적이다. 다음으로 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마	S7653
염화칼륨	시그마	P9333
염화마그네슘	시그마	M8266
HEPES	시그마	H3375
인산나트륨 일염기성	시그마	S8282
D-포도당 최소	시그마	G8270
타우린	시그마	T0625
2,3-부탄디온 모노심	시그마	B0752
콜라겐 분해 효소 B	Roche 응용 과학	11088807001
콜라겐 분해 효소 D	Roche 응용 과학	11088858001
Streptomyces griseus의 프로테아제 XIV	Sigma	P5147
소 혈청	시그마	의 알부민A2153
염화칼슘	시그마	C8106
최소 필수 매체	시그마	51411C
소 혈청의 알부민 용액	시그마	A8412
L-글루타민	시그마	G3126
페니실린-스트렙토마이신	시그마	P4333
인슐린-트랜스페린-아셀렌산나트륨 배지 보충제	Sigma	I1884
염화 세슘	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin– 틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산	시그마	E3889
수산화 세슘 용액	시그마	232041
테트라 에틸 암모늄 수산화물 용액	시그마	86643
OptiVisor 광학 유리 쌍안 바이저	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
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