Summary
Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.
Abstract
O uso de cardiomiócitos primários (CMS), em cultura tem proporcionado um complemento poderoso para modelos murinos de doenças do coração em avançar na compreensão de doenças do coração. Em particular, a possibilidade de estudar a homeostase de íons, função canal iônico, excitabilidade celular e acoplamento excitação-contração e suas alterações em condições de doentes e por mutações causadoras de doenças levaram a insights significativos sobre doenças cardíacas. Além disso, a falta de uma linha de células adequada imortalizado para imitar adulto CMs, e as limitações dos CMs neonatal (que não têm muitos da característica biomecânica estrutural e funcional do adulto CMs) na cultura têm dificultado a compreensão da complexa interação entre as vias de sinalização, canais iônicos e propriedades contráteis no coração adulto reforçando a importância do estudo adultos cardiomiócitos isolados. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento, a cultura, a manipulação da expressão gênica por adenovírus-expreproteínas sseD, e posterior análise funcional dos cardiomiócitos do rato adulto. O uso destas técnicas irá ajudar a desenvolver uma visão mecanicista em vias de sinalização que regulam a excitabilidade celular, Ca 2 + dinâmica e contratilidade e fornecer uma caracterização muito mais fisiologicamente relevante de doença cardiovascular.
Introduction
Modelos murinos de doenças cardiovasculares têm servido como ferramentas eficazes para elucidar os mecanismos fundamentais de doença 1,2, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos 1,3. Em particular, o uso de ambos os modelos de murino de doença cardíaca adquirida (tais como sobrecarga de volume) 4,5 e modelos de ratinhos transgénicos têm avanços na compreensão da doença cardíaca 6-8. A utilização de técnicas de cultura celular para estudar cascatas de sinalização 3,9,10 e alterações em proteínas individuais que estão subjacentes a excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção no coração 11-13 ao nível de uma única célula foram complementados os modelos in vivo de ratinho. No entanto, a falta de linhas celulares adequadas que reflectem a estrutura e função de adulto CM tem sido uma limitação significativa. Os investigadores têm tentado ultrapassar esta estudando proteínas individuais, tais como a canais de iões, em sistemas de expressão heterólogos
Cardiomiócitos ventriculares de rato neonatal primárias (NRVMs) são relativamente fáceis de cultura, podem ser infectadas com adenovirus e lentivírus para manipular a expressão do gene 15, umaª Assim, foram utilizadas com sucesso 1, mas têm limitações próprias. Embora eles fornecem um microambiente fisiológico 1 e tem sido o carro-chefe do campo de sinalização, diferenças substanciais entre a morfologia ea organização subcelular de NRVMs e cardiomyoctyes adultos torná-los um modelo inadequado para a investigação de fluxos iônicos e acoplamento excitação-contração no coração de adultos . Mais notavelmente NRVMs falta uma t-tubular subsistema definitiva 4. Desde Ca 2 + fluxo e dinâmica é criticamente dependente maduro t-tubular e retículo sarcoplasmático (RS) estrutura 6, Ca 2 + dinâmica e estudos funcionais da contratilidade cardíaca em NRVMs não são um reflexo preciso desses processos críticos em cardiomiócitos adultos. Além disso, alguns componentes de vias de sinalização diferente entre ratos neonatal e adulto 9, proporcionando assim uma outra limitação para o estudo de processos de doença e sua icompactas na excitabilidade celular e contratilidade em NRVMs. Finalmente, a distribuição da máquina contrátil leva ao encurtamento célula multidireccional e não uniforme, limitando a precisão das medições contrácteis.
O uso de cardiomiócitos adultos isolados fornece, portanto, um sistema in vitro de modelagem mais precisa. O crescimento extraordinário do conhecimento tornada possível pela manipulação genética de ratinhos sublinha a importância da obtenção funcionais cardiomiócitos isolados a partir de murganhos. Na verdade, a caracterização dos CMs adultas isoladas de modelos de mouse lançou luz sobre muitos eventos biológicos e patológicos. CMs isoladas a partir de modelos de camundongos transgênicos têm permitido estudos sobre o ganho ou perda de função das proteínas nas propriedades contráteis de células individuais 2,16, e viabilidade em modelos de doenças, como a isquemia / reperfusão 17,18, complementando, assim, informações obtidas a partir de estudos in vivo sobre oratinhos SE. Uso de isolado adulto CMs de modelos murinos de doença cardíaca adquirida 3,19,20 (como sobrecarga de pressão induzida pela constrição da aorta transversa, que a hipertensão imita ou estenose da válvula aórtica) ou exercício 5,21 (para a modelagem de hipertrofia fisiológica) permite a análise da interacção de cascatas de sinalização envolvidos nestes processos com excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção ao nível de uma única célula. Além disso, a capacidade de manipular a expressão de genes usando a expressão do gene dirigido adenoviral no adulto CMs nos oferece a oportunidade para dissecar os componentes de vias de sinalização complexas.
Do ponto de vista eletrofisiológico, a tensão de célula inteira e experiências atuais sobre grampo isolado adulto CMs foram fundamentais para elucidar a natureza dos fluxos iônicos no início do estudo e em vários estados de doença. Devido à estrutura complexa da membrana celular e a prote diferencialem estruturas de andaimes adulto entre as linhas de células heterólogas CMs e NRVMs ou, a capacidade de corrigir células adultas dá um muito melhor representação dos efeitos de certas proteínas de membrana, proteínas estruturais, e os parceiros de canais iónicos que interagem nos componentes electrofisiológicas do coração de adulto.
Apesar de tais vantagens proeminentes no estudo adultos cardiomiócitos murinos, isolar e cultivar cardiomiócitos ratos adultos tem sido um desafio, pedindo que a necessidade de uma descrição sistemática e precisa da metodologia para isolar cardiomiócitos viáveis do mouse e mantê-los na cultura para permitir ainda mais a manipulação genética usando viral vetores. Estudos anteriores já haviam usado tanto agudamente isolado do rato adulto CMs ou culta rato adulto CMs. Estes últimos são mais fáceis de cultura de rato adulto CMs, ea maioria dos experimentos manipulando expressão gênica in vitro têm usado rato adulto CMs. Poucos estudos têm alterado e investigados functi com sucessoa expressão do gene onal em rato adulto CMs, apresentando uma grande limitação no âmbito de experiências. Portanto, aqui apresentamos detalhadamente tais metodologias, modificado a partir de investigações anteriores, para o isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infecção adenovírus 11-13,15, e análise funcional de cardiomyoctyes ventriculares adulto do rato. Este protocolo resulta em isolamento Ca 2 +-tolerantes, cardiomiócitos excitáveis que temos com sucesso cultivadas por até 72 horas e transitoriamente transfectadas com adenovírus. A funcionalidade destas células isoladas pode ser avaliada utilizando o sistema de imagem MMSYS 14,24 e patch-clamp, que também será discutida.
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Protocol
1. Cardiomyocyte Isolamento
Materiais (Figura 1)
Microdissecting fórceps
Uma pinça
Pinça hemostática delicados
Pinça hemostática
Microdissecting, serrilhados, fórceps curvos
Tesoura operacionais, em linha reta
Tesoura Operacionais, curvo
Tubos de 15 ml Falcon (5)
60 milímetros placa de Petri
Tampão fosfato (PBS)
Nylon Mesh - tamanho 400 mM poros
Pequeno funil
Cera revestido, trançado de seda 4-0, 19 mm, 7-10 cm de comprimento
Agulha não-hipodérmica, fim brusco, 24 G ou animal-alimentação agulha comercial (24 x 1 em, W/1-1/4)
A heparina de sódio
Mistura cetamina / xilazina
Pipetas Pasteur
OptiVision dissecação Goggles
Sistema Ionoptix MMSYS
Nota: Se a cultura de células, ver secção 2 em cultura de células, antes de iniciar esse protocolo.
Nota: Todos os ratos foram tratados emuma instalação de barreira e sacrificado de acordo com regulamento aprovado IACUC, práticas e procedimentos.
Nota: Antes de se iniciar o procedimento, todo o sistema deve ser pré-aquecido, para assegurar que todos os elementos do sistema de Langendorff (Figura 2A, Figura 3) são aquecidos a 37 ° C para permitir a actividade de colagenase adequada e completa.
- Injetar camundongos adultos (~ 12 semanas) com 150 unidades USP de heparina sódica para o espaço abdominal.
- Anestesiar com uma injecção de uma mistura de cetamina / xilazina na dose-dependente de peso (Tabela 1).
- 80:12 mg / kg de cetamina: xilazina receita: 2,6 ml de cetamina (100 mg / ml) + 0,4 ml de xilazina (100 mg / mL) + 37 ml de PBS. Final: cetamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
- Fixar o rato sedados para a almofada operacional, excisar o coração, e colocar em um prato de PBS temperatura ambiente ou 0,9% de solução salina (Figura 1J). Physalina siologic permite que o coração intacto para contrair para uma melhor extrusão de sangue na câmara e fácil identificação da aorta antes do passo 1.6. Camundongos foram verificados para garantir que eles estão profundamente anestesiados via perda de membro posterior toe pitada reflexo e desaceleração da freqüência respiratória antes do início da toracotomia.
- Use óculos de proteção OptiVision dissecação (Figura 1A) para identificar e expor a aorta. A remoção do tecido em torno da aorta, embora não facilitar a visualização do vaso, não é necessário para a optimização do isolamento das células se a raiz aórtica é claramente visível.
- Ferre a bomba com tampão de perfusão (Tabela 2). A temperatura deve ser mantida a 37 ° C durante a duração do processo usando um controlo, banho de água (Figura 2D) que circula.
- Montar o coração para o aparelho de Langendorff (Figura 2A). Usando dois micro-dissecando fórceps (Figuras 1D-E), prime da aorta em torno da não-hipodérmica, romba ponta de agulha (24 L) com um tubo de silicone na ponta distal. Alternativamente, um animal-agulha de alimentação comercial (24 cm x 1 em, W/1-1/4) pode ser utilizado. O tubo de silicone sobre a agulha 24 G ou a agulha de alimentação dos animais vai permitir fixar o fio de sutura ao longo da ranhura. Coloque a aorta na agulha como uma meia. (Figura 2C).
- Nota: É importante ter a certeza de que a ponta da agulha repousa na aorta ascendente, de preferência na distal da raiz da aorta com o inominada direita, mas que não se estende através da válvula aórtica para o ventrículo esquerdo, pois isso irá severamente limitar a capacidade dos buffers para perfundir eficazmente através do coração através das artérias coronárias.
- Fixar o coração para a agulha, amarrando um pequeno comprimento de sutura de seda (7-10 cm de comprimento) (Figura 1K), em torno da parte superior da aorta, assegurando que o laço é ao nível da aorta ascendente, abaixo da arter inominada direitay, mas está acima da extremidade da agulha.
- Diminuir o coração para o interior do vaso cónico (Figura 2B) para ajudar a manter uma temperatura ambiente adequada.
- Perfundir o coração com tampão de perfusão durante 5 min a uma velocidade de 1 ml / min e prender a câmara de saída do vidro para permitir que o perfusato de recolher no vidro cónico e envelope do coração. O esquema para digerir o coração é mostrado na Figura 3.
- Neste ponto, você deve ver o volume do aumento coração. Além disso, o sangue no tecido cardíaco serão substituídos por perfusato, palidez tecido.
- Solte a braçadeira de saída para drenar o perfusato. Parar a bomba para mover o tubo a partir do recipiente de tampão de perfusão para o recipiente de tampão de enzima (Figura 2E). Reiniciar a bomba comece a perfundir o coração com tampão de enzima (Tabela 2) em 1 ml / min. Prender o escoamento de novo para permitir que o tampão de enzima para o envelopecoração.
- Aqui, tal como a enzima é perfusão do coração e digerir o tecido conjuntivo, o coração se torne mais pálida e a integridade estrutural irá diminuir.
- Para determinar quando cortar os ventrículos do coração digerida, levantar o coração para fora do copo cônico, esprema delicadamente o coração com uma pinça e recolher algumas gotas de perfusato em uma pequena placa de Petri e verificar para ver se ou não células individuais estão caindo .
- Para o novato, é útil para conectar a linha de perfusão com um manómetro. Quando o coração está sendo digerido a pressão vai cair rapidamente, como o tecido conjuntivo não se sustenta a resistência. O manómetro também é útil para o principiante para assegurar que a posição da agulha se encontra acima da válvula aórtica e não no ventrículo. De baixa pressão irá indicar que a agulha se encontra na câmara ventricular e sob alta pressão indicou que a agulha toca a válvula.
- Cortar os ventrículos do coração num pratocheio de buffer de transferência (A) (Tabela 2), quando a pressão ventricular começa a cair drasticamente, ou quando você é capaz de ver as células individuais no perfusato. Isso normalmente leva ~ 7-10 min.
- Novamente utilizando micro-fórceps de dissecação (Figura 1C), mediu os ventrículos em pequenos pedaços para dissociar. A digestão de sucesso vai deixar quase sem pedaços sólidos de tecido depois de trituração, com a maior parte do tecido se tornar amorfo mediante dissociação.
- Para dissociar ainda mais o tecido, pipetar a solução in / out utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico (Figura 4) a partir da qual a ponta tinha sido cortado com um ângulo 45 °. Esta modificação serve para aumentar o espaço diametral interna da ponta da pipeta, diminuindo assim a quantidade de tensão de cisalhamento sobre as células como o tecido é triturado.
- Antes de dissecação o tecido com uma pinça, é possível separar as câmaras individuais separadamente e dissociar fibrilação ventricular esquerda ou righcélulas ventriculares t.
- Fixe a malha quadrado (Figura 1M) para um pequeno funil (Figura 1 L) usando grampos e coloque este aparelho de filtragem em um tubo Falcon 15 ml (Figura 1I).
- Utilizar a pipeta de Pasteur modificada para remover a solução de células a partir da placa e filtrar a solução para o tubo Falcon.
- Permitir que as células vivas para assentar no fundo do tubo (sedimentação de células vivas deve ter 2-4 min).
- Aliquota de 2,5 ml de cada uma das quatro soluções de cálcio (Tabela 3) em quatro tubos de 15 ml Falcon separadas.
- Mais uma vez, utilizando uma pipeta Pasteur padrão, remover cuidadosamente a pelete de células a partir do fundo do tubo e transferência das células para a primeira das soluções de cálcio.
- Permitir que as células se depositam no fundo do tubo e repetir o passo 1.17 nas soluções subsequentes de cálcio até que as células estão na última solução.
- Não deixe que as células se instalarem no fourth solução de cálcio. Tampe o tubo e transformá-lo de lado.
2. Cultura de Células
- Antes do isolamento, placa de 1 ug / ml de laminina rato natural, em lamelas de vidro e incubar durante pelo menos 1 hora a 37 ° C e 2% de CO 2. Também permitirá que o seu revestimento e meios de cultura (Tabela 4) para aquecer na incubadora a 37 ° C e 2% de CO 2. Isso permite que o CO 2 dissolvido na mídia para equilibrar.
- Não remova a parte superior da mídia. Basta soltar a parte superior para evitar a contaminação.
- Permitir que as células isoladas a sedimentar no fundo do tubo de Falcon.
- Retire o pellet usando uma pipeta Pasteur de plástico padrão e ressuspender em a quantidade adequada de chapeamento de mídia.
- Placa as células sobre as lamelas revestidas com laminina no prato de tamanho apropriado e incubar a 37 ° C e 2% de CO 2, durante pelo menos 30-60 minutos para permitir que as células a aderir às lamelas.
- ** Se transfecção com adenovírus, diluir o vírus em uma quantidade adequada de meios seletivos, e substituir a mídia chapeamento no prato com a mídia que contém o vírus. Deixe o vírus incubar as células durante 2 h em 37 ° C e 2% de CO 2. **
- Remova a mídia chapeamento do prato e substituir com meios de cultura.
- Alterar cuidadosamente o meio de cultura a cada dia, de modo a não perturbar as células nas lamelas.
Usando este procedimento, as células foram cultivadas com sucesso por até 72 horas. Imagens de células cultivadas e transfectadas GFP pode ser encontrada na Figura 5.
3. MMSYS Sistema
- Ligue o sistema MMSYS garantindo que a lâmpada de arco é iniciado pela primeira vez.
- Ligar os tubos da bomba para a admissão adequada e saídas da câmara MMSYS (Figura 6).
- Primeiro o sistema de tampão com cálcio (B) (Tabela 2).
- Coloque um aproxlamela de vidro de tamanho opriately na câmara e aperte (Figura 6E). A maioria das câmaras MMSYS usar 22 milímetros ou 25 milímetros lamínulas quadrados. Consulte o manual do usuário MMSYS para determinar a lamela apropriado para a sua câmara.
- Transferir 500 ul da solução de células para um pequeno tubo de Eppendorf.
- Adicionar 0,5 mL Fura2-AM (solução stock de 1 mg / mL) para o pequeno tubo de células e permitir-lhes a incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5-7 minutos. Isto permite que o Fura2-AM a "carga" para dentro das células através da rápida difusão passiva através da membrana celular.
- Deixe o Fura-2 células carregadas sedimentar para o fundo do tubo, e lavar o excesso de Fura com 500 ul de tampão de cálcio B.
- Desligue as luzes da sala.
- Usando uma pipeta Pasteur padrão, gota 1-2 gotas (dependendo da concentração de células) da solução de "carregado" de células para o centro da câmara (Figura 6C) e permitir que as células To resolver sobre a lamela por 5 min.
- A densidade de células na câmara deve ser tal que as células que não se sobrepõem individuais podem ser facilmente visualizadas na plataforma de aquisição de dados MMSYS.
- Cuidadosamente começam a fluir tampão de cálcio (B) através da câmara.
- Aumentar a temperatura da câmara para 37 ° C.
- IMPORTANTE: Não ligue o aparelho de aquecimento até que o fluxo foi iniciada. Isto pode danificar gravemente o thermocoupler realimentação (Figura 6A).
- Certifique-se de que a câmara é ligada ao MyoPacer através dos fios de ligação (Figura 6B) e começam a andar as células 5 Hz a 1,5 x o limiar de estimulação para as células.
- Escolha uma célula que está batendo na freqüência correta e movê-lo para a abertura de enquadramento.
- Ajustar as dimensões da abertura da câmara de moldação e, para que toda a célula está no centro da janela, dirigida horizontalmente, com o ap sarcomerespai.
- Para comprimento celular ajustar o vermelho e verde (direita e esquerda) indicadores fotodiodo para a borda da célula. Ajustar o contraste para optimizar o contraste preto / branco nas extremidades da célula. Consulte o manual de Ionoptix para mais detalhes.
- Colocar a caixa de uma área da célula contendo sarcomeres bem definidos e ajustar o foco para optimizar o pico do espectro de potência (vermelho). Também ajustar a luminosidade do microscópio para optimizar a janela de alisamento azul e informações contraste preto.
- Ajuste as barras de limite verdes para capturar o máximo do espectro de potência vermelho (pico) e tão pouco fundo possível.
- Iniciar a gravação.
- Depois que os dados suficientes tenham sido gravadas, clique em "Pause" para parar temporariamente a gravação e, garantindo que nem o foco nem dimensões da janela de visualização são alterados, movimentar o palco do microscópio para uma área da lamela em que nenhuma célula ou material celular pode ser vi. LenGTH de gravação varia dependendo do protocolo experimental do investigador.
- Nota: Ao clicar em "Stop" irá encerrar a gravação e nenhum fundo será capaz de ser registrado para essa célula.
- Clique em "Continuar" para gravar uma medida de fundo.
- Depois de fundo o suficiente foi gravada clique em "Stop" para terminar a gravação.
- Clique em "Arquivo >> Salvar" para salvar todos os traços para que a célula em um único arquivo zpt..
- Repita os passos de 3,12-3,20 até células suficientes foram registrados.
- Consulte o Ionoptix-MMSYS Manual do Usuário 12 para obter instruções sobre análise dos dados gravados. Dados registados de características de tipo selvagem são mostradas em cardiomiócitos na Figura 7.
4. Remendo Grampo
Fixação remendo de diferentes tipos de células têm sido bem descritos anteriormente nesta revista 25-28. Nós, portanto, se concentrar em algum críticoparâmetros ai para o sucesso de fixação pedaço de cardiomiócitos adultos isolado usando nosso protocolo descrito.
- Usando uma pipeta de puxador e vidro de borosilicato (com filamentos: OD 1,5 mm ID 0,86 milímetros - 10 cm de comprimento) puxar uma pipeta que exibe ~ 2,0-3,0 mohms quando preenchido com uma solução de pipeta (Tabela 5).
- -Polonês fogo a ponta da pipeta suavemente usando um Narishige ou outro polidor de fogo vertical. A resistência da pipeta patch deve ser 2-4 MO após polimento fogo.
- Ligue o computador, amplificador (Axopatch 200B), conversor AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) e Micromanipulator (MP-285). Para remendo célula aperto todo, começamos com parâmetros padrão, como descrito anteriormente.
- Para o adulto culto CMs, removê-los da incubadora e lavar cuidadosamente a lamela em que os CMs são banhados com PBS à temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente a lamela e colocá-lo na câmara de perfusão no microscópio invertido (Nikon TE 2000).
- Certifique-se de que a entrada para o sistema de perfusão e de saída (por sucção) é um pouco acima da superfície da lamela.
- Iniciar irrigando com a solução extra-celular apropriado (Tabela 5).
- Para o adulto recém dissociada CMs, coloque uma lamela revestidas por colágeno no sistema de perfusão, como acima.
- Uma vez que as células vão estar em solução, substituir suavemente a solução com tampão extracelular.
- Usando a pipeta Pasteur modificado (Figura 4), delicadamente ressuspender as células no buffer extracelular, tomar uma alíquota e coloque-o sobre a lamela.
- Deixe as células aderir durante 10-15 minutos antes de iniciar a perfusão como em 4.4.
- Back-preencher todo o patch célula pipeta com tampão intra-celular usando um Microfil (Instrumentos de Precisão World, 28 G) da agulha. Certifique-se de que não há bolhas de ar na ponta da pipeta; bata suavemente para permitir que as bolhas de ar para flutuar para o surface da solução.
- Prenda a pipeta de patch cheio ao titular pipeta a, assegurando que não há contato entre o microeletrodos ea solução interna.
- Nós usamos eletrodos de cloreto de prata, mas cuidar de 'chloriding' os fios de prata, pelo menos uma vez por semana por imersão durante a noite em água sanitária.
- Abaixe cuidadosamente a pipeta para o banho, garantindo que o eletrodo de banho está imerso em todos os momentos no / solução extra-celular banho. Compensar quaisquer potenciais de junção líquida neste momento. Grandes potenciais de junção pode ser um sinal de deterioração de cloreto de prata sobre os eletrodos.
- Sã cilíndrica adulto CMs são identificados ao microscópio e centrado no campo de visão. Como descrito anteriormente, uma combinação de mover o micromanipulador e ajustar o foco permite a proximidade da @ patch pipette @ e a superfície do CM.
- Uma vez que eles estão no mesmo plano focal, usamos uma combinação de visuaisção da célula e pulso de teste (disponível no Axopatch 200B).
- Uma vez que a resistência da pipeta diminui para metade (sugerindo que a pipeta está em contacto com a superfície da célula), e as células continuam a procurar cilíndrica, estabelecemos selo gigaohm utilizando uma sucção suave.
- Para CMs, preferimos sucção boca para estabelecer a pressão negativa. Se um gigaseal é obtido com sucesso, mais uma vez usar suave sucção boca rítmica para 'break-in' para a célula para estabelecer o modo de correção de células inteiras.
- Potenciais de descanso típicos de saudável CMs estão na ordem de -85 a -90 mV. Uma vez que um gigaseal é obtido, medir o potencial de repouso da membrana usando pinça de corrente com I = 0 pA.
- Se o potencial de repouso da membrana é despolarizada isso pode indicar uma célula danificada ou uma vedação deficiente.
- Porque o CMs são células grandes com muita área de superfície, muita atenção deve ser dada para capacitância de compensação, especialmente wgalinha rapidamente ativando correntes como o canal de sódio precisa ser estudada. Se a compensação de capacitância adequada não pode ser obtida usando o construído em configurações de compensação sobre o gerador de impulsos, prepulses na tensão sub-limiar e polaridade oposta podem ter de ser aplicada ea corrente resultante subtraído do sinal gravado. Esse protocolo é facilmente programado em Axopatch.
- Uma vez que o modo de remendo de célula inteira foi estabelecida, esperar 15 minutos para permitir o equilíbrio e para assegurar a estabilidade do selo antes de tensão início ou protocolos de fixação correntes. Usamos protocolos padrão que foram descritos anteriormente neste e outros jornais e não serão elaboradas.
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Representative Results
O isolamento dos adultos cardiomyoctyes resultados em células em forma de bastonete, estriados, e quiescentes (não bater espontaneamente) (Figura 5A). As células mortas vão olhar arredondado e sem estrias estarão presentes. As células quiescentes podem ser cultivadas e transfectadas com o adenovírus para manipular a expressão do gene (Figuras 5B e 5C). Após 24 horas de cultura, a morfologia das células vivas não muda, elas ainda são Ca2 +-tolerante, e que pode ser acelerado por estimulação do campo. Com o processo proposto, com um rendimento de 80-90% de células viáveis pode ser alcançado.
Para medir a contração da célula, o software do sistema MMSYS leva a informação de fase do microscópio para relatar tanto as mudanças no sarcômero ou comprimento celular. Mostrado na (Figura 7A) é um traço representativo contratilidade via medição do comprimento do sarcômero de um C57BL6 rato do tipo selvagem. Para miócitos saudáveis adulto do rato docamundongos se, o comprimento do sarcômero de base é de aproximadamente 1,7-1,9 m. O software do sistema MMSYS é capaz de medir simultaneamente a contractilidade e manuseamento de cálcio através da medição da razão entre o limite às formas não ligadas do corante Fura2-AM activado com cálcio. Enquanto que as medidas de relação pode variar ligeiramente entre configurações, para as células saudáveis, a proporção é de, tipicamente, entre 1,5-2,5 (Figura 7B). Se o sistema MMSYS foi calibrado para o cálcio, este rácio pode ser então traduzido para uma medição absoluta da concentração de cálcio intracelular. A fim de analisar os dados que são gerados a partir da contratilidade e cálcio traços, os traços devem ser em média para criar um traço característico para essa célula (Figuras 7C e 7D). Esses vestígios característicos são então sujeitos a um algoritmo de análise de dados monotransient do software do sistema MMSYS que gera então os parâmetros para a função sistólica e diastólica. Mais detalhes estão presentes no IonManual Optix.
Cardiomiócitos do rato adulto também foram sujeitos a experimentos patch clamp células inteiras em que o potencial de ação foi registrada no modo pinça de corrente (Figura 8).
| Peso corporal (g) | Ketamina / xilazina (ml) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0,25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0,37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0,55 |
| 50 | 0,62 |
Tabela 1. Adulto Rato Peso dependente Ketamina / Xilazina Dosagem (80:12).
| Solução | Receita |
| Tyrode buffer * (PH 7,4) | 1 L ddH2O 137 mM de NaCl KCl 4 mM MgCl 1 mM 10 mM de HEPES 0,33 mM NaH 2 PO 4 |
| Perfusão buffer * (PH 7,4) | 500 ml de tampão de Tyrode 10 mM de D-(+)-Glucose, mínimo MM Taurina 5 10 mM butanodiona monoxime (BDM) |
| Tampão Enzimático * | 50 ml Perfusão buffer 0,024 g de colagenase D (Tipo IV) 0,018 g de colagenase B (Tipo II) 0,003 g Protease XIV, a partir do Streptomyces griseus |
| Transferir Buffer (A) | 45 ml Perfusão buffer 5 ml de albumina de soro bovino (a partir de solução a 5 mg / ml de caldo) |
| Cálcio Buffer (B) | 1 L Tyrode Tampão CaCl 1,2 mM 5,5 mM de D-(+)-Glucose, mínimo |
Tabela 2. Adulto Cardiomyocyte Isolamento Receitas de buffer.
| [CaCl] | Transferir Buffer (A) | Cálcio Buffer (B) |
| MM de Ca2 + 0,06 | 9,5 ml | 0,5 ml |
| MM de Ca2 + 0,24 | 8,0 ml | 2,0 ml |
| MM de Ca2 + 0,60 | 5,0 ml | 5,0 ml |
| MM de Ca2 + 1,20 | 0 ml | 10 ml |
Tabela 3.Calcium titulação Receitas solução.
| Galvanização Médio | Meio de Cultura |
|
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Tabela 4. Chapeamento e Receitas meios de cultura.
| Solução pipeta | Solução de banho |
|
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Tabela 5. Grampo patch Solutions (soluções são indicados para medição de correntes de sódio).
Figura 1. .. Instrumentos de isolamento dos cardiomiócitos Adulto A) OptiVisor vidro óptico lupa binocular B) pinça, 5,5 em, dentes 1x2 -. Roboz Scientific C) fórceps Moloney - 4,5 em (11,5 cm) de comprimento ligeira curva, serrilhada -. Roboz Scientific DE) Dumont # 3 Fórceps, Dumostar, tamanho da ponta de 0,17 x 0,10 milímetros. F) Packer Mosquito Fórceps 5 em linha reta plana -. Roboz científicos G) Micro Dissecting Scissors 4,5 na curva da Sharp / Sharp -. Roboz Scientific H) Micro Dissecting Scissors 3.5 em linha reta afiada / Sharp 20 milímetros -. Roboz Científica I) 15 ml tubo Falcon - Thermo Fisher Scientific-J) 60 milímetros placa de Petri contendo PBS K) Softsilk: seda trançada cera revestido, 19 de mm - Covidien L) funil de plástico, 6,0 cm de diâmetro M) de malha de nylon - 400 micras tamanho dos poros.....
Figura 2. Langendorff Apparatus. A) A todo o sistema de perfusão Langendorff utilizado para o isolamento de cardiomiócitos adultos. B) Visão ampliada do funil cônico oco, a coleta de vidro usado para aquecer o coração canulada. C) Visão ampliada da agulha de punção não hipodérmica. (Feedin reutilizávelg agulhas (24 G, ponta reta, redondo, 25 mm de comprimento; Ciência Belas Tools Inc. item 18061-24) D) de circulação banho de água E) Banho de água para incubação de perfusão, de enzimas e de transferência de buffers..
Figura 3. Um esquema detalhado do sistema de perfusão.
Figura 4. Modificado pipeta Pasteur. A pipeta foi modificado por corte da ponta com um ângulo de aproximadamente 45 °. Isto permite uma maior área de superfície e cria menos tensão de cisalhamento sobre as células que estão a ser dissociado. A inserção mostra uma visão mais próxima da ponta modificada.
Figura 5. Cardiomiócitos cultivados e GFP transfectadas. A) recentemente isolat ed cardiomiócitos adultos de um rato C57BL6 de 12 semanas. As setas apontam para as células mortas ou a morrer. Estas células são mais arredondado do que o, adulto em forma de bastonete saudável CMs. B) adulto do rato cardiomyoctyes transfectadas-GFP após 24 horas de cultura. C) cultivadas cardiomiócitos de rato adulto após 24 horas. Inset mostra o aumento da ampliação dos miócitos cultivadas.
Figura 6. . Câmara sistema MMSYS setas azuis representam o fluxo de tampão de perfusão (Tampão B) A) única, solução aquecedor em linha -... Warner Instrument Corporation B) Ligar os fios do sistema de câmara de MMSYS ao estimulador de campo MyoPacer C) platina eléctrodos de estimulação do campo localizado no centro da câmara. D) reservatório de Escoamento. E) Secção grampos na posição aberta.
Figura 7. Dados do sistema MMSYS representante inscrito para camundongos selvagens C57BL6 obtidos de Jackson Labs. A) vestígios de contratilidade de base. MMSYS B) Relação de Ca 2 +-obrigado a Ca 2 +-desacoplado Fura2-AM gravado para gerar traços base de cálcio. Esses traços correspondem às medições de contratilidade em A). C) média vestígios de contratilidade de base compilados pelo software do sistema MMSYS em um traço característico contratilidade. D) traço característico de cálcio compilado a partir de vestígios de base em B). Análise dos traços compostos permitirá ao pesquisador gerar parâmetros substitutos para a função sistólica e diastólica. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 8. Remendo traço braçadeira mostrando o potencial de um tipo selvagem do rato adulto cardiomiócitos ação.
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Discussion
Neste relatório, nós descrevemos as técnicas necessárias para o isolamento do sucesso e da cultura do adulto CMs do coração mouse. A nossa técnica permite o estudo subsequente da função LV e excitabilidade utilizando os métodos descritos acima. O parâmetro fundamental para o estudo da funcionalidade do adulto CMs é a saúde ea qualidade do CMs isoladas. Como descrito acima, as nossas técnicas de permitir um elevado rendimento de células funcionais que são susceptíveis a manipulação da expressão de genes usando as infecções de adenovírus / lentivirais em cultura, e análise de excitabilidade celular e a função contráctil.
Um dos parâmetros mais importantes para o isolamento de rato adulto funcional CMs é precisa e rápida de punção do coração para a agulha não hipodérmica. Cuidado deve ser assegurado que a aorta ligado ao ventrículo esquerdo é dissecado a um comprimento suficiente para permitir a punção mais fácil e mais rápido do coração. Quando canulação tele coração, é também essencial que a ponta da agulha permanece na aorta ascendente e não se estende para além da válvula aórtica no ventrículo esquerdo para permitir perfusão eficiente do tecido através das artérias coronárias. O próximo passo é essencial assegurar a aorta para a haste da agulha utilizando uma sutura de seda. A sutura deve ser amarrado na aorta ascendente, de modo que o tampão de perfusão retrógrada flui para as artérias coronárias e cavidade ventricular esquerda, mas não flui de forma anterógrada fora através da extremidade distal da aorta dissecada ou dos grandes vasos.
Alguns pesquisadores acham que é útil para configurar um medidor de pressão para avaliar a qualidade da canulação e perfusão subsequente da enzima. Ao utilizar um medidor de pressão, a pressão inicial do ventrículo esquerdo deve ser ~ 80-100 cm H 2 O, e sobre a perfusão com a enzima, a pressão diminui para ~ 40-50 cmH2O Quando a pressão ventricular chega a esse ponto, éprovavelmente pronto para ser cortados a partir da agulha. Para garantir que os ventrículos são bem digerida, algumas gotas do flow-through pode ser recolhida a partir de sob o coração em uma placa de Petri e verificado para ver se alguma, células quiescentes vivos.
As células isoladas resultantes deste procedimento se prestam bem a imunocitoquímica. Eles podem ser fixados através de métodos de fixação comuns 29 (isto é formalina, paraformaldeído, de metanol gelado e acetona), mas um nível mais elevado de permeabilização que é tipicamente usado para cardiomyoctyes neonatais é por vezes necessária a proteínas citosólicas de imagem ou de estruturas de proteínas (isto é, alfa- actina sarcomérica, beta miosina). Finalmente, as células podem ser cultivadas e subsequentemente infectadas com adeno-lentivírus ou para manipular a expressão de genes, ou usados para análises funcionais do aparelho contráctil celular.
Cultura do rato adulto CMs tem sido descrito comodesafiadora. Utilizando as técnicas descritas aqui, podemos rotineiramente cultura destas células para até 72 horas, embora o rendimento de células funcionais diminui acentuadamente após 36 horas. Quando a cultura das células, é imperativo que as células sejam colocadas em placas a 37 ° C em 2% de CO 2. Isto é diferente de CMs neonatal, que preferem ser cultivadas em 10% de CO 2 durante as primeiras 24 horas e, em seguida, transferido para 5% de CO 2, ou fibroblastos cardíacos neonatais, que também preferem 5% de CO 2. O meio de revestimento e a cultura pode ser equilibradas de modo a que o CO2 dissolvido é de 2%.
As células foram semeadas em lamelas revestidas com laminina, de modo que eles não se levante do vidro quando o meio é mudado. No entanto, os cardiomiócitos não dão muito firmemente ao vidro, mesmo com o revestimento da laminina. Por isso é muito importante que o cuidado ser tomado quando se muda o meio de cultura, utilizando pipetas estéreis, e não um sistema de aspiração a vácuo. Uma vez que a células são semeadas, que podem ser transfectadas com o adenovírus por incubação do vírus de não mais que 2 hr. O tempo depende do título do vírus e a proteína ser sobre-expressos, por isso, recomendado a realização de experiências preliminares para determinar a LD 50 e ED 50 para o vírus. Na maioria dos casos, usamos um MOI de 20-100 para o adenovírus. Uma vez que as células foram incubadas com o vírus, a expressão de gene (s) alvo tipicamente leva ~ 24-36 h.
Células isoladas que são plaqueadas em lamelas de um tamanho adequado para o sistema de câmara de MMSYS também podem ser analisados para a contractilidade e manuseamento de cálcio utilizando o sistema de imagem MMSYS. Estas lamelas pode ser directamente colocada na câmara, e o meio de cultura pode ser removido rodando sobre o sistema de perfusão. Se as células não estão a ser cultivadas e estão a ser utilizados para a análise directamente depois do isolamento, eles podem ser adicionados directamente à câmara de uma vez uma lamela foi colocada. Enquantonão é necessário pré-coat as lamelas com laminina ao analisar as células recém-isoladas, em nossa experiência, a laminina não ajuda as células melhor aderir à lamela. Usando uma taxa de fluxo lento para a unidade MMSYS adicionalmente assegura que as células permanecem ligados à lamela. Por fim, a ótica do microscópio, particularmente a lente objetiva deve ser cuidadosamente limpos antes de cada experiência, para permitir a visualização precisa de sarcômeros necessários para a avaliação da contratilidade.
O componente mais importante do sistema do aquecedor MMSYS é único na linha de fluido que aquece o tampão de perfusão (B) à medida que flui para dentro da câmara. O elemento termogênico deste equipamento é projetado para a troca de calor com o passar fluido através de transferência de calor por convecção, por isso, se o fluxo está ausente, o trocador vai superaquecer e irreparavelmente pode danificar o sistema. Assim, é imperativo que o aquecedor está ligado somente após o fluxo é iniciado.
Outros métodos de análise do aparelho contráctil de cardiomiócitos adultos foram previamente descritos, incluindo os métodos sofisticados utilizando microscopia de força atómica 30-32. Alguns destes métodos permite uma medição mais sofisticada da força contrátil localizada e propriedades, tais como o módulo de elasticidade, tornando-os mais adequados para a medição de células de formato irregular ou de células sem sistemas sarcoméricas claramente definidas, tais como o MC derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas. Estas técnicas podem ser facilmente utilizados no adulto isolado CMs. A vantagem do sistema MMSYS é a relativa facilidade de medir a contractilidade e a capacidade de medir um grande número de células em um curto período de tempo em células com sarcomeres claramente definidos. Além disso, os sistemas de ponta macia e análise sarcómero que pode medir o comprimento da célula ou o comprimento entre sarcomeres permitir, respectivamente, para dois diferentes (mas r) Métodos exaltados para medir a contratilidade. O software de aquisição de dados combinado com o, software avançado análise amigável torna este sistema fácil de aprender e usar. Finalmente, a capacidade de medir a dinâmica do cálcio simultaneamente permite a correlação entre a contratilidade ea homeostase do cálcio, o que não é viável com microscopia de força atômica. Além disso, como a saída de dados é uma medida raciométrica de um corante ativado por cálcio (Fura2-AM), com a calibragem correta, as medidas absolutas de concentrações internas de cálcio pode ser coletado.
Gravação de sucesso dos sinais dos canais de íons de cardiomiócitos adultos requer as células estar na condição ideal. Imediatamente após o isolamento e plaqueamento das células que não são aderentes e irá flutuar na solução; nesta fase, eles não podem ser estudados. Dentro de algumas horas que vai aderir a uma lamela revestida e é neste ponto que pode ser estudada. Na nossa experiência patching dentro de algumas horas dechapeamento produz o resultado ideal, como esperar muito tempo adversamente afeta as células. Como descrito acima, testando o potencial de repouso da membrana depois de se estabelecer uma vedação gigaohm e invadir a célula, bem como a capacidade de estabelecer uma vedação gigaohm si são dois parâmetros que reflectem como saudável as células estão no momento da aplicação de patches. Embora seja mais fácil de corrigir em células que não sejam entidades, isto não é um pré-requisito, vedações adequadas podem ser obtidas em células batendo bem. Os protocolos utilizados neste momento depende dos objetivos do estudo patch clamping, usando técnicas de fixação atuais, potenciais de ação espontâneos ou induzidos pode ser gravado. Alternativamente, a tensão de aperto podem ser utilizados para estudar os canais iónicos específicos. Dada a panóplia de canais na membrana, tais gravações são usualmente realizadas na presença de agentes bloqueadores de canais de iões. Tetrodotoxin (TTX), nisoldipina, eo césio são freqüentemente usados para bloquear os canais de sódio, cálcio e potássio, respectivamente, embora seja favorávelgh uma variedade de medicamentos têm sido utilizados, e os detalhes de sua utilização têm sido publicados extensivamente. A maioria das abordagens envolvem tanto correntes de gravação, antes e após a aplicação de bloqueadores dos canais de iões e subtraindo as correntes, e / ou de bloqueio dos canais de fundo com os bloqueadores apropriados, antes de gravação.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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