Summary
Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.
Abstract
L'utilisation des cardiomyocytes primaires (CMS) dans la culture a fourni un complément puissant pour des modèles murins de la maladie de coeur dans l'avancement de notre compréhension de la maladie de coeur. En particulier, la capacité à étudier l'homéostasie ionique, de la fonction de canal ionique, l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction et leurs altérations dans des conditions pathologiques et par des mutations pathogènes ont conduit à des avancées importantes au niveau des maladies cardiaques. En outre, l'absence d'une ligne suffisante de cellules immortalisées à imiter les adultes GC, et les limites de néonatale CM (qui n'ont pas beaucoup de la caractéristique de la biomécanique structurale et fonctionnelle des adultes MC) dans la culture ont entravé notre compréhension de l'interaction complexe entre les voies de signalisation, les canaux ioniques et les propriétés contractiles du coeur adulte renforcer l'importance d'étudier adultes cardiomyocytes isolés. Ici, nous présentons des procédés pour l'isolement, la culture, la manipulation de l'expression de gène par adenovirus expreprotéines sseD et analyse fonctionnelle ultérieure de cardiomyocytes de la souris adulte. L'utilisation de ces techniques permettra de développer une approche mécanistique dans les voies de régulation de l'excitabilité cellulaire, Ca 2 + dynamique et la contractilité de signalisation et de fournir une caractérisation beaucoup plus physiologiquement pertinents de maladies cardio-vasculaires.
Introduction
Des modèles murins de maladie cardio-vasculaire ont servi d'outils efficaces pour élucider les mécanismes de la maladie 1,2 fondamentales, ainsi que pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles 1,3. En particulier, l'utilisation des deux modèles murins de maladies cardiaques acquises (tels que la pression de surcharge) et 4,5 modèles de souris transgéniques ont fait progresser notre compréhension de la maladie cardiaque 6-8. L'utilisation de techniques de culture de cellules à étudier cascades de signalisation 3,9,10 et modifications dans les protéines individuelles qui sous-tendent l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction dans le coeur de 11 à 13 au niveau de la cellule unique ont complété les modèles in vivo de souris. Cependant, le manque de lignées cellulaires appropriées qui reflètent la structure et la fonction des adultes CM a une limitation importante. Les investigateurs ont tenté de surmonter ce par l'étude de protéines individuelles, telles que des canaux ioniques, dans des systèmes d'expression hétérologues
Néonatales cardiomyocytes ventriculaires de rat primaires (NRVMs) sont relativement facile à la culture, peuvent être infectées par des adénovirus et lentivirus de manipuler l'expression du gène 15, une ont donc été utilisée avec succès une, mais des limites de leur propre. Bien qu'ils fournissent un microenvironnement physiologique 1 et ont été le cheval de bataille du champ de signalisation, des différences substantielles entre la morphologie et l'organisation subcellulaire de NRVMs et cardiomyoctyes adultes en font un modèle pour l'étude des flux ioniques et couplage excitation-contraction dans le coeur adulte insuffisant . Plus particulièrement NRVMs définitif n'ont pas une sous-système tubulaire t-4. Depuis Ca 2 + flux et dynamique dépendent de façon critique sur des T-tubulaire maturité et le réticulum sarcoplasmique (RS) la structure 6, Ca 2 + dynamique et des études fonctionnelles de la contractilité cardiaque dans NRVMs ne sont pas un reflet exact de ces processus critiques dans les cardiomyocytes adultes. De plus, certains composants de voies de signalisation diffèrent entre les souriceaux nouveau-nés et les adultes 9, fournissant ainsi une autre limitation pour étudier les processus de la maladie et leur impact sur l'excitabilité cellulaire et la contractilité dans NRVMs. Enfin, la distribution de la machinerie contractile conduit à un raccourcissement de la cellule multidirectionnel et non uniforme limitant la précision des mesures contractiles.
L'utilisation des cardiomyocytes adultes isolés fournit donc un système de modélisation plus précise in vitro. La croissance extraordinaire des connaissances rendue possible par la manipulation génétique de la souris souligne l'importance d'obtenir des cardiomyocytes isolés fonctionnels de souris. En fait, la caractérisation des adultes CM isolés à partir des modèles de souris a mis en lumière de nombreux événements biologiques et pathologiques. CM isolés à partir de modèles de souris transgéniques ont permis d'études du gain ou de la perte de la fonction des protéines sur les propriétés contractiles des cellules simples 2,16, et la viabilité des modèles de maladies telles que l'ischémie / reperfusion 17,18, complétant ainsi les informations obtenues à partir de Des études in vivo sur l'souris soi. Utilisation d'adulte isolé CM de modèles murins de maladie cardiaque acquise 3,19,20 (comme aortique surcharge transversale de pression induite par constriction, qui imite l'hypertension ou la sténose aortique) ou de l'exercice 5,21 (pour la modélisation de l'hypertrophie physiologique) permet à l'examen de l'interaction des cascades de signalisation impliquées dans ces processus avec de l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction au niveau de la cellule unique. En outre, la capacité de manipuler l'expression des gènes en utilisant l'expression du gène conduit adenovirus en adulte CM nous donne l'occasion de disséquer les composants de voies de signalisation complexes.
Du point de vue électrophysiologique, la tension de cellule entière et expériences actuelles de serrage sur adulte isolé CM ont été essentiels dans la compréhension de la nature des flux ioniques au départ et dans divers états pathologiques. En raison de la structure complexe de la membrane cellulaire et la prote différentieldans les structures d'échafaudage entre adultes GC et NRVMs ou des lignées de cellules hétérologues, la possibilité de patcher les cellules adultes donne une bien meilleure représentation des effets de certaines protéines membranaires, des protéines structurelles et canaux ioniques partenaires d'interaction sur les composantes électrophysiologiques du cœur adulte.
En dépit de ces avantages importants dans l'étude adultes cardiomyocytes murins, l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris adultes ont été difficiles, insistant sur la nécessité d'une description systématique et précise de la méthodologie pour isoler les cardiomyocytes de souris viables et à les maintenir en culture à la poursuite de la manipulation génétique en utilisant virale vecteurs. Des études antérieures ont utilisé soit des adultes de la souris aiguë isolé GC ou adulte de rat cultivés GC. Ces derniers sont plus facile à la culture de la souris adulte MC, et la plupart des expériences de manipulation expression génique in vitro ont utilisé rat adulte GC. Peu d'études ont modifié avec succès et une enquête fonctil'expression du gène onal des adultes de la souris CM, présentant une grande limitation dans le champ d'expériences. Par conséquent, nous présentons ici en détail ces méthodes, modifiés à partir des enquêtes précédentes, pour l'isolement 7,8,22, culture 3,10,15,23, infection adénoviral 11-13,15, et l'analyse fonctionnelle de cardiomyoctyes ventriculaires de souris adultes. Ce protocole d'isolement des résultats dans Ca 2 +, les cardiomyocytes excitables tolérantes que nous avons cultivées avec succès jusqu'à 72 h et transfectées de façon transitoire avec l'adénovirus. La fonctionnalité de ces cellules isolées peuvent être évaluées à l'aide du système d'imagerie et MMSYS 14,24 patch clamp, qui sera également discuté.
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Protocol
Une. Cardiomyocytes Isolation
Matériaux (Figure 1)
Microdissecting forceps
Pince de tissus
Pinces hémostatiques délicates
Pinces hémostatiques
Microdissecting, en dents de scie, pinces courbes
Ciseaux d'exploitation, droit
Ciseaux d'exploitation, courbe
15 ml des tubes Falcon (5)
60 mm boîte de Petri
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Nylon Mesh - taille des pores 400 pm
Petit entonnoir
Enduit de cire, tressé de soie 4-0, 19 mm, 7-10 cm de long
Aiguille hypodermique non, extrémité émoussée, 24 G ou de l'aiguille des animaux se nourrissant commercial (24 x 1, W/1-1/4)
Héparine sodique
Mélange kétamine / xylazine
Pipettes Pasteur
OptiVision dissection Lunettes
Système IonOptix MMSYS
Remarque: Si des cellules en culture, voir la section 2 sur culture cellulaire avant de commencer ce protocole.
Remarque: Toutes les souris ont été pris en charge dansun centre de barrière et sacrifié selon les règlements approuvés IACUC, pratiques et procédures.
Remarque: Avant le début de la procédure, l'ensemble du système doit être préchauffé pour assurer que tous les éléments du système de Langendorff (Figure 2A, Figure 3) sont chauffés à 37 ° C pour permettre une activité correcte et complète de la collagénase.
- Injecter des souris adultes (~ 12 semaines) avec 150 unités USP d'héparine de sodium dans la cavité abdominale.
- Anesthésier avec une injection d'un mélange de kétamine / xylazine à une dose dépendant du poids (tableau 1).
- 80:12 mg / kg de kétamine: Recette xylazine: 2,6 ml de kétamine (100 mg / ml) + 0,4 ml de xylazine (100 mg / ml) + 37 ml de PBS. Finale: kétamine = 6,5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml
- Fixez la souris sous sédation à la plage de fonctionnement, exciser le coeur, et le placer dans un plat de la température ambiante PBS ou saline à 0,9% (figure 1J). Physaline siologic permet au cœur intact de contrat pour mieux extrusion de sang dans la chambre et l'identification facile de l'aorte avant l'étape 1.6. Les souris ont été vérifiés pour s'assurer qu'ils sont profondément anesthésiés par la perte de membres postérieurs pincement de l'orteil réflexe et le ralentissement du rythme respiratoire avant le début de la thoracotomie.
- Utiliser des lunettes de dissection Optivision (figure 1A) d'identifier et d'exposer l'aorte. Retrait du tissu autour de l'aorte, mais il facilite la visualisation du navire, n'est pas nécessaire à l'optimisation de l'isolation de la cellule si la racine de l'aorte est clairement visible.
- Amorcer la pompe avec le tampon de perfusion (tableau 2). La température devrait être maintenue à 37 ° C pendant la durée de la procédure en utilisant un environnement contrôlé, bain à circulation d'eau (Figure 2D).
- Montez le coeur sur l'appareil de Langendorff (figure 2A). L'utilisation de deux micro-pinces à disséquer (figures 1D-E), prIME l'aorte dans le, émoussé aiguille de fin de non-hypodermique (24 G) avec le tube de silicone à l'extrémité distale. En variante, une aiguille des animaux se nourrissant du commerce (24 x 1, W/1-1/4) peut être utilisé. Le tube de silicone sur l'aiguille 24 G ou de l'aiguille d'alimentation animale permettra de fixer la suture sur la rainure. Placer l'aorte sur l'aiguille comme une chaussette. (Figure 2C).
- Remarque: Il est important d'être sûr que l'extrémité de l'aiguille repose dans l'aorte ascendante, idéalement dans la racine distale de l'aorte vers la droite innommé, mais il ne s'étend pas à travers la valve aortique dans le ventricule gauche, comme ce sera sévèrement limiter la capacité des mémoires tampons pour perfuser efficacement à travers le cœur via les artères coronaires.
- Fixez le coeur à l'aiguille en attachant une petite longueur de soie de suture (7-10 cm de long) (figure 1K) autour du sommet de l'aorte, veiller à ce que l'égalité soit au niveau de l'aorte ascendante, en dessous de la Arter innommé droity, mais est au-dessus de l'extrémité de l'aiguille.
- Abaisser le coeur à l'intérieur de la vitre de forme conique (figure 2B) pour aider à maintenir une température ambiante appropriée.
- Perfuser le cœur avec le tampon de perfusion pendant 5 min à un débit de 1 ml / min et serrer la sortie de la chambre de verre pour permettre au liquide de perfusion pour recueillir dans le verre d'enveloppe conique et le coeur. Le schéma de digestion du coeur est représentée dans la figure 3.
- À ce stade, vous devriez voir le volume de l'augmentation de coeur. En outre, le sang dans le tissu cardiaque sera remplacé par perfusion, ce qui provoque la pâleur de tissu.
- Relâchez la pince de sortie pour drainer le liquide de perfusion. Arrêter la pompe pour déplacer le tubage à partir du récipient de tampon de perfusion pour le conteneur de la mémoire tampon de l'enzyme (Figure 2E). Redémarrer la pompe à commencer à perfuser le cœur avec le tampon de l'enzyme (tableau 2) à 1 ml / min. Fixer à nouveau la sortie pour permettre le tampon de l'enzyme à l'enveloppecœur.
- Ici, comme l'enzyme est la perfusion de coeur et de digérer le tissu conjonctif, le cœur devient plus pâle et l'intégrité structurelle va diminuer.
- Pour déterminer quand couper les ventricules du coeur digéré, soulever le coeur du verre conique, presser doucement le cœur avec une pince et de recueillir quelques gouttes de liquide de perfusion dans une petite boîte de Petri et vérifier pour voir si oui ou non des cellules individuelles sont en baisse .
- Pour le novice, il est utile pour connecter la ligne de perfusion avec un manomètre. Quand le cœur est se digéré la pression va rapidement décliner, comme le tissu conjonctif ne tient pas la résistance. Le manomètre est également utile pour le débutant à faire en sorte que la position de l'aiguille se trouve au-dessus de la valve aortique et non dans le ventricule. Basse pression indiquera que l'aiguille est dans la chambre ventriculaire et haute pression a indiqué que l'aiguille touche la valve.
- Couper les ventricules du coeur dans un platplein de tampon de transfert (A) (tableau 2) lorsque la pression ventriculaire commence à chuter de façon spectaculaire ou lorsque vous êtes en mesure de voir des cellules individuelles dans la perfusion. Cela prend généralement ~ 7-10 min.
- En utilisant à nouveau micro-pinces à disséquer (figure 1C), émincer les ventricules en petits morceaux à dissocier. Une digestion réussie laissera presque pas de morceaux solides de tissus après hachage, avec la plupart des tissus de devenir amorphe lors de la dissociation.
- Pour dissocier le tissu en outre, pipeter la solution dans / à l'aide d'une pipette Pasteur en matière plastique (figure 4) à partir de laquelle la pointe a été coupée à un angle de 45 ° ~. Cette modification permet d'augmenter l'espace diamétrale intérieure de l'embout de pipette en diminuant ainsi la quantité de contrainte de cisaillement sur les cellules que le tissu est trituré.
- Avant la dissection du tissu avec la pince, il est possible de séparer les chambres individuelles et séparément dissocier auriculaire, ventriculaire gauche ou droicellules ventriculaires t.
- Fixez le maillage carré (figure 1M) pour un petit entonnoir (figure 1L) à l'aide des pinces et placer cet appareil de filtrage dans un tube Falcon de 15 ml (Figure 1I).
- Utilisez la pipette Pasteur modifié pour supprimer la solution de cellules dans le plat et filtrer la solution dans le tube Falcon.
- Laisser les cellules vivantes se déposer au fond du tube (sédimentation des cellules vivantes devrait prendre 2-4 min).
- Aliquote de 2,5 ml de chacune des quatre solutions de calcium (Tableau 3) dans 4 tubes Falcon de 15 ml séparés.
- Encore une fois l'aide d'une pipette Pasteur standard, enlever soigneusement le culot de cellules à partir de la partie inférieure du tube et de transférer les cellules sur la première des solutions de calcium.
- Laisser les cellules se déposent au fond du tube et répéter l'étape 1.17 dans les solutions de calcium ultérieures jusqu'à ce que les cellules sont dans la dernière solution.
- Ne laissez pas les cellules s'installent dans la Fourtsolution h de calcium. Boucher le tube et tourner sur le côté.
2. Culture cellulaire
- Avant l'isolement, la plaque 1 ug laminine de souris / ml naturel sur des lamelles de verre et incuber pendant au moins 1 heure à 37 ° C et 2% de CO 2. Permettent également de votre dépôt et milieux de culture (tableau 4) pour se réchauffer dans l'incubateur à 37 ° C et 2% de CO 2. Cela permet au CO 2 dissous dans les médias à s'équilibrer.
- Ne pas enlever le haut par les médias. Il suffit de desserrer le haut pour éviter la contamination.
- Laisser les cellules isolées au culot au fond du tube Falcon.
- Retirer la pastille à l'aide d'une pipette Pasteur standard en plastique et remettre en suspension dans la quantité appropriée de placage médias.
- Plaquer les cellules sur des lamelles couvre-objet revêtues de laminine dans le plat de taille appropriée et incuber à 37 ° C et 2% de CO 2 pendant au moins 30 à 60 minutes pour permettre aux cellules d'adhérer à des lamelles couvre-objet.
- ** Si la transfection avec l'adénovirus, le virus dilué dans une quantité appropriée de médias de placage et remplacer le support de placage dans le plat avec les médias contenant des virus. Soit le virus sur les cellules incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 2% de CO 2. **
- Retirez le support de revêtement de la boîte et le remplacer par un milieu de culture.
- Changer avec soin les supports de culture chaque jour afin de ne pas perturber les cellules sur les lamelles.
En utilisant cette procédure, les cellules ont été cultivées avec succès pour un maximum de 72 heures. Les images de cellules en culture transfectées GFP et peuvent être trouvés dans la figure 5.
3. Système MMSYS
- Alimenter le système MMSYS veiller à ce que la lampe à arc est lancé en premier.
- Connecter les tubes de la pompe vers l'orifice d'entrée approprié et sorties de la chambre MMSYS (Figure 6).
- Premier système avec du tampon de calcium (B) (Tableau 2).
- Placez une apprlamelle de verre de taille opriately dans la chambre et attachez (figure 6E). La plupart des chambres de MMSYS utilisent soit 22 mm ou 25 mm lamelles carrés. Consultez votre manuel d'utilisateur MMSYS pour déterminer la lamelle appropriée pour votre chambre.
- Transférer 500 pl de la solution de cellules dans un petit tube Eppendorf.
- Ajouter 0,5 ul Fura2-AM (solution stock de 1 pg / pl) pour le petit tube de cellules et de leur permettre d'incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 5-7 min. Cela permet à l'Fura2-AM à "charge" dans les cellules par la diffusion rapide passive à travers la membrane cellulaire.
- Laissez les Fura-2 cellules chargées granulés au fond du tube, et laver l'excès de Fura avec 500 ul de tampon de calcium B.
- Éteignez les lumières de la pièce.
- En utilisant une pipette Pasteur standard, déposer 1-2 gouttes (en fonction de la concentration des cellules) de la solution de cellules "chargée" dans le centre de la chambre (figure 6C) et de permettre aux cellules To s'installer sur la lamelle pendant 5 min.
- La densité des cellules de la chambre doit être telle que les cellules qui ne se recouvrent simples peuvent être facilement visualisés à l'MMSYS plate-forme d'acquisition de données.
- Soigneusement commencent à circuler tampon de calcium (B) à travers la chambre.
- Augmenter la température de la chambre à 37 ° C.
- IMPORTANT: Ne mettez pas l'appareil de chauffage jusqu'à ce que le débit a été lancé. Cela peut endommager gravement le thermocoupleur de rétroaction (figure 6A).
- Assurez-vous que la chambre est reliée à la MyoPacer via les fils de connexion (figure 6B) et commencer à arpenter les cellules 5 Hz à 1,5 fois le seuil de stimulation pour les cellules.
- Choisissez une cellule qui bat à la fréquence correcte et le déplacer dans l'ouverture de cadrage.
- Régler la caméra et de cadrage dimensions d'ouverture de sorte que la totalité de la cellule se trouve dans le centre de la fenêtre, dirigé horizontalement, avec l'ap sarcomèresparent.
- Pour ajuster la longueur de la cellule rouge et vert (droite et gauche) indicateurs de photodiodes au bord de la cellule. Ajustez le contraste pour optimiser le contraste noir / blanc sur les bords de la cellule. Reportez-vous au manuel Ionoptix pour plus de détails.
- Placer le récipient dans une zone de la cellule contenant sarcomères bien définies et ajuster la mise au point pour optimiser le pic du spectre de puissance (rouge). Régler également la luminosité du microscope pour optimiser la fenêtre de lissage bleu et de l'information de contraste noir.
- Ajuster les barres de seuil verts de capturer autant du spectre de puissance rouge (pic) et aussi peu que possible le fond.
- Commencer l'enregistrement.
- Après suffisamment de données ont été enregistrées, cliquez sur "Pause" pour arrêter temporairement l'enregistrement et, veiller à ce que ni l'objet, ni les dimensions de la fenêtre de visualisation sont modifiés, déplacer la scène du microscope à une zone de la lamelle dans laquelle aucun des cellules ou du matériel cellulaire peuvent être vu. LenGTH de l'enregistrement varie en fonction du protocole expérimental de l'enquêteur.
- Remarque: En cliquant sur "Stop" prendra fin l'enregistrement et pas de fond pourra être enregistrée pour cette cellule.
- Cliquez sur "Reprendre" pour enregistrer une mesure de fond.
- Après suffisamment de fond a été enregistrée cliquez sur "Stop" pour terminer l'enregistrement.
- Cliquez sur "Fichier >> Enregistrer" pour enregistrer toutes les traces de cette cellule dans un fichier zpt unique..
- Répétez les étapes 3.12 à 3.20 jusqu'à ce que suffisamment de cellules ont été enregistrés.
- Consultez le IonOptix-MMSYS Manuel de l'utilisateur 12 pour des instructions sur l'analyse des données enregistrées. Données enregistrées caractéristiques des cardiomyocytes de type sauvage sont présentés dans la figure 7.
4. Patch Clamp
Patch serrage de différents types de cellules ont été bien décrit précédemment dans cette revue 25-28. Nous nous concentrons donc sur un critiqueparamètres al pour la réussite de serrage de raccordement des cardiomyocytes adultes isolés en utilisant notre protocole décrit.
- En utilisant un extracteur de pipette et le verre de borosilicate (avec filament: OD 1,5 mm, 0,86 mm ID - 10 cm de longueur) tirer une pipette qui présente ~ 2,0-3,0 MQ lorsqu'elles sont remplies avec une solution de pipette (tableau 5).
- Fire-ongles la pointe de la pipette doucement à l'aide d'une polisseuse Narishige ou autre coupe-feu verticale. La résistance de la pipette de patch devrait être 2-4 MO après polissage au feu.
- Allumez l'ordinateur, un amplificateur (Axopatch 200B), convertisseur AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) et Micromanipulateur (MP-285). Pour l'ensemble de serrage du patch cellulaire, nous commençons avec les paramètres standard tels que décrits précédemment.
- Pour l'adulte cultivé MC, retirez-les de l'incubateur et laver délicatement la lamelle sur laquelle les CMS sont plaqués avec du PBS à température ambiante.
- Retirez délicatement la lamelle et la placer dans la chambre de perfusion sur le microscope inversé (Nikon TE 2000).
- S'assurer que l'orifice d'entrée pour le système de perfusion et de sortie (par aspiration) sont juste au-dessus de la surface de la lamelle.
- Commencer la perfusion avec la solution extra-cellulaire approprié (tableau 5).
- Pour les adultes fraîchement dissociées MC, placer une lamelle couvre-objet revêtue de collagène dans le système de perfusion comme ci-dessus.
- Etant donné que les cellules vont être en solution, remplacer doucement la solution avec un tampon extracellulaire.
- En utilisant la pipette Pasteur modifié (figure 4), remettre en suspension doucement les cellules dans le tampon extracellulaire, prélever une aliquote et le placer sur la lamelle.
- Laissez les cellules attachent pendant 10-15 min avant de commencer la perfusion sous 4.4.
- Remblayer l'ensemble pipette de patch de cellules avec un tampon intra-cellulaire en utilisant un Microfil (World Precision Instruments, 28 G) aiguille. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la pointe de la pipette, tapotez doucement pour permettre aux bulles d'air remontent à la surface de la solution.
- Fixez la pipette de patch rempli à la porte-pipette, s'assurer qu'il ya contact entre la microélectrode et la solution interne.
- Nous utilisons des électrodes de chlorure d'argent, mais prenons soin de «chloration» les fils d'argent au moins une fois par semaine par immersion pendant une nuit dans l'eau de Javel.
- Abaissez délicatement la pipette dans le bain, faire en sorte que l'électrode de bain est immergé en permanence dans la solution de bain / extra-cellulaire. Compenser les potentiels de jonction de liquide à ce moment. Grands potentiels de jonction peuvent être un signe de la détérioration de chlorure d'argent sur les électrodes.
- Cylindrique adulte en bonne santé MC sont identifiés dans le microscope et centré dans le champ de vision. Comme décrit précédemment, une combinaison de déplacement du micromanipulateur et le réglage de la mise au point permet la proximité étroite de la pipette de patch et la surface de la CM.
- Une fois qu'ils sont dans le même plan focal, on utilise une combinaison de visueltion de la cellule et de l'impulsion de test (disponible dans le Axopatch 200B).
- Une fois que la résistance de la pipette diminue de moitié (ce qui suggère que la pipette se trouve en contact avec la surface de la cellule), et la cellule continue à chercher cylindrique, on établit joint d'gigaohm utilisant une aspiration douce.
- Pour GC, nous préférons la bouche d'aspiration à établir une pression négative. Si un gigaseal est obtenu avec succès, nous utilisons à nouveau douce rythmique bouche d'aspiration à «rodage» de la cellule d'établir le mode de correction de la cellule entière.
- Potentiels de repos typiques de santé MC sont de l'ordre de -85 à -90 mV. Une fois gigaseal est obtenue, mesurer le potentiel de membrane de repos en utilisant pince de courant I = 0 pA.
- Si le potentiel de membrane au repos est dépolarisée, cela peut indiquer une cellule endommagée ou une mauvaise étanchéité.
- Parce que les GC sont de grandes cellules avec beaucoup de surface, une attention particulière doit être accordée à capacitance compensation, en particulier avecpoule à activation rapide des courants tels que le canal de sodium doit être étudié. Si la compensation de capacité adéquate ne peut être obtenue en utilisant le haut dans les paramètres de compensation sur le générateur d'impulsions, préimpulsions à la tension sous-seuil et polarité opposée peut être appliquée et le courant résultant soustrait du signal enregistré. Un tel protocole est facilement programmé dans Axopatch.
- Une fois que le mode de correction de cellules entières a été établie, attendre 15 minutes pour permettre l'équilibrage et pour assurer la stabilité du joint d'étanchéité avant de la tension de début de serrage ou des protocoles courants. Nous utilisons des protocoles standards qui ont été décrits précédemment dans le présent et d'autres revues et ne seront pas développées sur.
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Representative Results
L'isolement des résultats cardiomyoctyes adultes dans des cellules en forme de baguette, striées, et quiescentes (pas spontanément battant) (Figure 5A). Les cellules mortes seront look arrondi et aucun stries seront présents. Cellules au repos peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus de manipuler l'expression des gènes (figures 5B et 5C). Après 24 heures de culture, la morphologie des cellules vivantes ne change pas, ils sont encore Ca 2 + à tolérance, et ils peuvent être stimulés par la stimulation de champ. Avec la méthode proposée, avec un rendement de cellules viables de 80 à 90% de peut être atteint.
Pour mesurer la contractilité de la cellule, le logiciel du système MMSYS prend l'information de phase à partir du microscope à signaler soit les variations de longueur de sarcomère ou cellule. Montré dans (figure 7A) est une trace de la contractilité représentant par mesure d'une souris C57BL6 de type sauvage de longueur de sarcomère. Pour myocytes sains de souris adultes de lasouris soi, la longueur de sarcomère base est ~ 1,7-1,9 um. Le logiciel du système MMSYS est capable de mesurer simultanément la contractilité et de la manipulation de calcium en mesurant le rapport de la borne aux formes non liées de la calcium-activated colorant Fura2-AM. Bien que les mesures de rapport peuvent varier légèrement entre les configurations, pour les cellules saines, le rapport est généralement comprise entre 1,5-2,5 (figure 7B). Si le système MMSYS a été calibré pour le calcium, ce ratio peut ensuite être traduite en une mesure absolue de la concentration de calcium intracellulaire. Afin d'analyser les données qui sont générées à partir des traces de contractilité et de calcium, les traces doivent être moyennés pour créer une trace caractéristique pour cette cellule (figures 7C et 7D). Ces traces caractéristiques sont ensuite soumises à un algorithme d'analyse de données de monotransient partir du logiciel de système MMSYS qui génère ensuite les paramètres de la fonction systolique et diastolique. De plus amples détails sont présents dans le Ionmanuel d'Optix.
Cardiomyocytes de souris adultes ont été également soumis à des expériences de patch clamp de cellules entières, dans lequel le potentiel d'action a été enregistré en mode de blocage de courant (figure 8).
| Poids corporel (g) | La kétamine / xylazine (ml) |
| 15 | 0,18 |
| 20 | 0,25 |
| 25 | 0,31 |
| 30 | 0,37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0,55 |
| 50 | 0,62 |
Tableau 1. Adulte souris Poids dépendant kétamine / xylazine Dosage (80:12).
| Solution | Recette |
| Tampon Tyrode * (PH 7,4) | 1 L ddH 2 O 137 mM NaCl 4 mM KCl 1 mM de MgCl 10 mM d'HEPES 0,33 mM NaH 2 PO 4 |
| Tampon perfusion * (PH 7,4) | 500 ml de tampon Tyrode 10 mM de D-(+)-glucose, le minimum MM taurine 5 10 mM Butanedione monoxime (BDM) |
| Tampon enzyme * | 50 ml de tampon de perfusion 0,024 g collagénase D (Type IV) 0,018 g collagénase B (Type II) 0,003 g de protéase XIV de Streptomyces griseus |
| Transfert tampon (A) | 45 ml de tampon de perfusion 5 ml de sérum albumine bovine (de solution à 5 mg / ml d'actions) |
| Calcium Buffer (B) | 1 L de tampon Tyrode MM CaCl 1.2 5,5 mM de D-(+)-glucose, le minimum |
Tableau 2. Cardiomyocytes adultes Isolation tampons Recettes.
| [CaCl] | Transfert tampon (A) | Calcium Buffer (B) |
| MM de Ca 2 + 0,06 | 9,5 ml | 0,5 ml |
| MM de Ca 2 + 0,24 | 8,0 ml | 2,0 ml |
| MM de Ca 2 + 0.60 | 5,0 ml | 5,0 ml |
| MM de Ca 2 + 1,20 | 0 ml | 10 ml |
Tableau 3.Calcium titrage Recettes solution.
| Placage moyen | Milieu de culture |
|
|
Tableau 4. Placage et Culture Médias Recettes.
| Solution de pipette | Solution de bain |
|
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Tableau 5. Patch clamp Solutions (solutions sont présentés pour la mesure des courants de sodium).
Figure 1. .. Instruments d'isolement des cardiomyocytes adultes A) OptiVISOR verre optique loupe binoculaire B) pinces de tissus, de 5,5 à dents 1x2 -. Roboz scientifique C) forceps Moloney - 4,5 dans (11,5 cm) de long légère courbe, en dents de scie -. Roboz scientifique DE) Dumont # 3 Forceps, Dumostar, la taille de la pointe 0,17 x 0,10 mm. F) Packer Mosqui Forceps 5 en Droit plat -. Roboz scientifiques G) Micro dissection Ciseaux 4,5 en courbe de Sharp / Sharp -. Roboz scientifique H) Micro dissection Ciseaux 3.5 dans Droit pointus / pointus 20 mm -. Roboz scientifique I) 15 ml tube Falcon - Thermo -Fisher Scientific J) 60mm de boîte de Pétri contenant du PBS K) Softsilk: de soie tressée enduite de cire, 19 mm - Covidien L) entonnoir en plastique, 6,0 cm de diamètre M) maille Nylon - 400 microns la taille des pores.....
Figure 2. Langendorff Appareil. A) L'ensemble du système de perfusion de Langendorff utilisé pour l'isolement des cardiomyocytes adultes. B) de vue élargi du creux, conique entonnoir de collecte de verre utilisée pour réchauffer le cœur canule. C) de vue élargi de l'aiguille de ponction non-hypodermique. (Feedin réutilisableg Aiguilles (24 G, droite, bout rond, 25 mm de long; Beaux-Sciences Tools Inc. article 18061-24). D) de circulation bain d'eau E) salle de bain de l'eau pour l'incubation perfusion, enzymes et de transfert des tampons.
Figure 3. Un schéma détaillé du système de perfusion.
Figure 4. Modifié pipette Pasteur. Pipette a été modifié par la coupe de la pointe à un angle d'environ 45 °. Cela permet une plus grande surface et crée moins de contrainte de cisaillement sur les cellules qu'ils sont dissociées. L'encart montre une vue rapprochée de la pointe modifiée.
Figure 5. Cardiomyocytes cultivés et GFP transfectées. A) fraîchement isolat ed cardiomyocytes adultes provenant d'une souris C57BL6 de 12 semaines. Les flèches indiquent les cellules mortes ou mourantes. Ces cellules sont plus arrondie que la, adulte en bonne santé en forme de tige CM. B) cardiomyoctyes de souris adultes GFP transfectées après 24 heures de culture. C) cardiomyocytes cultivés de souris adulte après 24 h. Encart montre un grossissement accru de myocytes en culture.
Figure 6. . Chambre de système MMSYS flèches bleues représentent le flux de la mémoire tampon de perfusion (tampon B) A) unique, en ligne solution de chauffage -... Warner Instrument Corporation B) Raccordement des fils de la chambre de système MMSYS au stimulateur de champ MyoPacer C) Platinum électrodes pour la stimulation de champ situé dans le centre de la chambre. D) réservoir d'écoulement. E) Chambre de serrage en position ouverte.
Figure 7. Les données du système de MMSYS représentatives enregistrées pour les souris de type sauvage C57BL6 obtenues auprès de Jackson Labs. A) des traces de contractilité de base. MMSYS B) Ratio de Ca 2 + lié à Ca 2 + non liée Fura2-AM enregistré pour générer des traces de calcium de base. Ces traces correspondent aux mesures de contractilité dans A). C) moyenné traces de contractilité de base compilées par le logiciel du système MMSYS dans une contractilité trace caractéristique. D) de la trace de calcium Caractéristiques compilées à partir des traces de bases B). L'analyse des traces composites permettra au chercheur de générer des paramètres de substitution pour la fonction systolique et diastolique. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 8. Patch clamp trace montrant le potentiel d'une cardiomyocytes de souris adulte de type sauvage action.
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Discussion
Dans ce rapport, nous avons décrit les techniques nécessaires pour permettre l'isolement et la culture des adultes CM du coeur de la souris. Notre technique permet une étude subséquente de la fonction et de l'excitabilité CM utilisant les procédés décrits ci-dessus. Le paramètre critique pour l'étude de la fonctionnalité des adultes MC est la santé et la qualité de l'isolement CM. Comme décrit ci-dessus, nos techniques permettent un rendement élevé de cellules fonctionnelles qui se prêtent à une manipulation de l'expression génique utilisant les infections adénovirales / lentiviraux dans la culture, et l'analyse de l'excitabilité cellulaire et la fonction contractile.
L'un des paramètres les plus importants pour l'isolement de la souris fonctionnelle des adultes CMS est précis et rapide cathétérisme du cœur sur l'aiguille hypodermique non. Il faut veiller à ce que le joint aorte dans le ventricule gauche est disséquée jusqu'à une longueur suffisante pour permettre une plus facile et plus rapide de la canulation du coeur. Lorsque cannulating til cardiaque, il est également essentiel que la pointe de l'aiguille reste dans l'aorte ascendante et ne s'étend pas au-delà de la valvule aortique dans le ventricule gauche pour permettre une perfusion efficace du tissu via des artères coronaires. L'étape cruciale suivante est la sécurisation de l'aorte à la tige de l'aiguille à l'aide d'une suture de soie. Le fil de suture doit être attaché sur l'aorte ascendante, de sorte que le tampon de perfusion s'écoule de manière rétrograde dans les artères coronaires et de la cavité ventriculaire gauche, mais ne s'écoule pas à travers antegradely l'extrémité distale de l'aorte disséquée ou des gros vaisseaux.
Certains chercheurs trouvent utile de mettre en place un manomètre pour évaluer la qualité de la perforation et la perfusion ultérieure de l'enzyme. Lors de l'utilisation d'une jauge de pression, la pression ventriculaire gauche initiale doit être ~ 80 - 100 cmH 2 O, et lors de la perfusion avec l'enzyme, la pression diminue à ~ 40-50 cmH 2 O. Lorsque la pression ventriculaire atteint ce point, il estprobablement prêt à être à couper de l'aiguille. Pour veiller à ce que les ventricules sont bien digérés, quelques gouttes de l'écoulement continu peuvent être recueillis sous le coeur dans une boîte de Pétri et vérifiées pour voir si toutes les cellules vivantes, de repos sont présents.
Les cellules isolées résultant de cette procédure se prêtent bien à l'immunocytochimie. Ils peuvent être fixés en utilisant des méthodes de fixation ordinaires 29 (c.-à-formol, paraformaldéhyde, le méthanol glacée ou acétone), mais un niveau plus élevé de perméabilisation que est généralement utilisé pour cardiomyoctyes néonatale est parfois nécessaire pour l'image protéines cytosoliques ou de structures de protéines (c.-à-alpha- actine sarcomérique, bêta myosine). Enfin, les cellules peuvent être cultivées et ensuite infectés avec des lentivirus adéno-ou de manipuler l'expression génique, ou utilisées pour des analyses fonctionnelles de l'appareil contractile cellulaire.
Culture de la souris adulte GC a longtemps été décrit commedifficile. En utilisant les techniques décrites ici, nous pouvons culture régulièrement ces cellules pour jusqu'à 72 heures, même si le rendement des cellules fonctionnelles diminue fortement après 36 heures. Lorsque la culture des cellules, il est impératif que les cellules sont ensemencées à 37 ° C dans 2% de CO 2. Ceci est différent du nouveau-né GC, qui préfèrent être cultivées à 10% de CO 2 pour les 24 premières heures et puis passer à 5% de CO 2, ou fibroblastes cardiaques néonatales, qui préfèrent également 5% de CO 2. Les médias de placage et de la culture peut être équilibré afin que le CO 2 dissous est de 2%.
Les cellules sont étalées sur des lamelles revêtues de laminine de sorte qu'ils ne se soulèvent pas hors de la vitre lorsque le support est modifié. Cependant, les cardiomyocytes ne s'attachent pas très solidement au verre, même avec le revêtement de la laminine. Il est donc très important que la prudence sera prise lors du changement de milieu de culture, en utilisant des pipettes stériles, et non pas un système d'aspiration sous vide. Une fois que la cellules sont étalées, elles peuvent être transfectées avec l'adénovirus en incubant le virus de pas plus de 2 heures. Le calendrier dépend le titre du virus et la protéine étant surexprimé, nous vous recommandons donc mener des expériences préliminaires pour déterminer la DL 50 et ED 50 pour le virus. Dans la plupart des cas, nous utilisons une MOI de 20-100 pour l'adénovirus. Une fois que les cellules ont été incubées avec le virus, l'expression du gène (s) cible prend généralement 24 à 36 h ~.
Les cellules isolées qui sont étalées sur des lamelles d'une taille appropriée pour la chambre destinée au système MMSYS peuvent également être analysés pour déterminer la contractilité et de la manipulation de calcium à l'aide du système d'imagerie MMSYS. Ces lamelles peuvent être directement placés dans la chambre, et le milieu de culture peuvent être éliminés par mise sous tension du système de perfusion. Si les cellules ne sont pas en culture et sont utilisés pour l'analyse directement après isolement, ils peuvent être ajoutés directement à la chambre une fois une lamelle couvre-objet a été placé. Tandis queil n'est pas nécessaire de pré-enduire les lamelles avec la laminine lors de l'analyse des cellules fraîchement isolées, dans notre expérience, la laminine fait d'aider les cellules adhèrent mieux à la lamelle. L'utilisation d'un débit lent pour l'unité MMSYS assure en outre que les cellules restent attachés à la lamelle. Enfin, l'optique du microscope, en particulier la lentille de focalisation doivent être scrupuleusement nettoyés avant chaque expérience, pour permettre la visualisation précise de sarcomères nécessaires à l'évaluation de la contractilité.
Le composant le plus important du système MMSYS est le seul dispositif de chauffage de fluide en ligne qui chauffe le tampon de perfusion (B) comme il s'écoule dans la chambre. L'élément thermogénique de cette pièce d'équipement est conçu pour échanger de la chaleur avec le passage du fluide via le transfert de chaleur par convection, si le débit est absent, l'échangeur sera surchauffe et pourrait irrémédiablement endommager le système. Il est donc impératif que le chauffage est en marche qu'après l'écoulement est lancé.
D'autres méthodes d'analyse de l'appareil contractile des cardiomyocytes adultes ont été décrits précédemment, y compris des méthodes sophistiquées utilisant microscopie à force atomique de 30 à 32. Certaines de ces méthodes permettent de mesurer de façon plus sophistiquée de la force et des propriétés telles que le module de Young contractile localisée, ce qui les rend plus adaptées à la mesure de cellules ou de cellules de forme irrégulière sans système sarcomériques clairement définis, tels que les GC dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Ces techniques peuvent être tout aussi bien utilisé sur l'adulte isolé GC. L'avantage du système MMSYS est la facilité relative de la mesure de la contractilité et de la capacité à mesurer un grand nombre de cellules dans un court laps de temps dans des cellules avec des sarcomères clairement définis. En outre, les systèmes soft-bord et d'analyse des sarcomères qui peuvent mesurer la longueur de la cellule ou la longueur entre les sarcomères permettent respectivement pour deux r différente (maisméthodes exalté) pour mesurer la contractilité. Le logiciel d'acquisition de données combinée avec le logiciel avancé convivial analyse rend ce système facile à apprendre et à utiliser. Enfin, la capacité de mesurer la dynamique du calcium permet simultanément pour la corrélation entre la contractilité et de l'homéostasie du calcium, ce qui n'est pas possible avec la microscopie à force atomique. De plus, comme la sortie de données est une mesure ratiométrique d'un colorant activé par le calcium (Fura2-AM), avec un étalonnage correct, des mesures absolues de la concentration en calcium internes peuvent être collectées.
Enregistrement réussi de signaux de canal ionique de cardiomyocytes adultes exige que les cellules soient dans un état optimal. Immédiatement après l'isolement et le placage des cellules qu'ils ne sont pas adhérentes et flottent dans la solution; à ce stade, ils ne peuvent pas être étudiés. En quelques heures, ils adhèrent à une lamelle enduit et c'est à ce moment qu'ils peuvent être étudiés. Dans notre expérience patch en quelques heures deplacage donne le résultat optimal, que d'attendre trop longtemps défavorable affecte les cellules. Comme décrit ci-dessus, tester le potentiel de repos de la membrane après l'établissement d'un joint de gigaohm et la rupture dans la cellule, ainsi que la possibilité d'établir un joint de gigaohm lui-même sont deux paramètres qui reflètent la façon dont les cellules sont en bonne santé au moment de patcher. Bien qu'il soit plus facile à patcher sur des cellules qui ne sont pas contractent, ce n'est pas une condition préalable, joints adéquats peuvent être obtenus sur battant ainsi les cellules. Les protocoles utilisés à ce stade dépendent des objectifs de l'étude correctif de serrage; utilisant des techniques de serrage actuels, potentiels d'action spontanés ou induits peuvent être enregistrées. En variante, la tension de serrage peut être utilisée pour étudier les canaux ioniques spécifiques. Compte tenu de la panoplie de canaux dans la membrane, ces enregistrements sont généralement effectuées en présence de bloqueurs de canaux ioniques. Tétrodotoxine (TTX), nisoldipine et le césium sont souvent utilisés pour bloquer des canaux sodium, de calcium et de potassium respectivement, although une variété de médicaments ont été utilisés, et les détails de leur utilisation ont été publiées en profondeur. La plupart des approches impliquent soit des courants d'enregistrement avant et après l'application des bloqueurs de canaux ioniques et en soustrayant les courants, et / ou bloquant les canaux de fond avec les inhibiteurs appropriés avant l'enregistrement.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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