Summary
Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.
Abstract
Het gebruik van primaire cardiomyocyten (CMS) in cultuur heeft een krachtige aanvulling verstrekt aan muismodellen van hart-en vaatziekten in het bevorderen van ons begrip van hart-en vaatziekten. Met name de mogelijkheid om ion homeostase, ionenkanalen, cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling en hun veranderingen te bestuderen in zieke omstandigheden en ziekteverwekkende mutaties geleid tot aanzienlijke inzichten hartziekten. Bovendien zijn het ontbreken van een adequate vereeuwigd cellijn te bootsen volwassen CM's, en de beperkingen van neonatale CM's (die veel van de structurele en functionele biomechanica kenmerk van volwassen CM missen) in de cultuur van ons begrip van de complexe wisselwerking tussen signaalwegen belemmerd, ionkanalen en contractiele eigenschappen in het volwassen hart versterken het belang van het bestuderen van geïsoleerde hartspiercellen volwassene. Hier presenteren we methoden voor de isolatie, cultuur, manipulatie van genexpressie door adenovirale-expressed eiwitten en daaropvolgende functionele analyse van cardiomyocyten van volwassen muis. Het gebruik van deze technieken zullen helpen mechanistisch inzicht ontwikkelen tot signaalwegen die cellulaire exciteerbaarheid reguleren, Ca2 + dynamiek en contractiliteit en een veel fysiologisch relevante karakterisering van cardiovasculaire ziekte.
Introduction
Muismodellen van cardiovasculaire ziekte hebben gediend als doeltreffende instrumenten voor het ophelderen fundamentele ziektemechanismen 1,2 en voor het identificeren van potentiële therapeutische targets 1,3. Met name het gebruik van beide muizenmodellen van verworven hartziekte (zoals druk-overbelasting) 4,5 en transgene muismodellen hebben ons begrip van hartkwaal 6-8. Het gebruik van celkweek technieken signalering cascades 3,9,10 en veranderingen te bestuderen in individuele eiwitten die cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling grondslag liggen in het hart 11-13 op het niveau van de cel zijn een aanvulling op de in vivo muismodellen. Echter, het gebrek aan adequate cellijnen die volwassen CM structuur en functie weerspiegelen een belangrijke beperking geweest. Onderzoekers hebben geprobeerd om dit te overwinnen door het bestuderen van afzonderlijke eiwitten, zoals ionenkanalen, in heterologe expressiesystemen
Primaire neonatale rat ventriculaire cardiomyocyten (NRVMs) zijn relatief gemakkelijk te kweken, kunnen worden besmet met adenovirussen en lentiviruses genexpressie 15 te manipuleren, eennd zijn daarom succesvol 1 gebruikt, maar hebben beperkingen eigen. Hoewel ze een fysiologische micro 1 en het werkpaard van het veld signalering zijn aanzienlijke verschillen tussen de morfologie en subcellulaire ordening NRVMs en volwassen cardiomyoctyes ze onvoldoende model voor het onderzoek van ionische stromen en excitatie-contractie koppeling in het volwassen hart . Met name NRVMs ontbreekt een definitief t-buisvormige subsysteem 4. Sinds Ca 2 + flux en dynamiek zijn sterk afhankelijk van volwassen t-buis-en sarcoplasmatisch reticulum (SR) structuur 6, Ca 2 + dynamiek en functionele studies van de cardiale contractiliteit in NRVMs zijn geen weerspiegeling van deze kritische processen bij volwassen hartspiercellen. Verder is een aantal onderdelen van signaalwegen verschillen tussen neonatale en volwassen muizen 9, waardoor andere beperking voor het bestuderen van de ziekte processen en hun impact op cellulaire prikkelbaarheid en contractiliteit in NRVMs. Tenslotte, de verdeling van de contractiele machinerie tot multidirectionele en niet-uniforme cel verkorting van de juistheid van de contractiele metingen beperken.
Het gebruik van geïsoleerde volwassen hartspiercellen geeft daarom een nauwkeuriger in vitro modelsysteem. De buitengewone groei van kennis mogelijk gemaakt door de genetische manipulatie van muizen onderstreept het belang van het verkrijgen van functionele geïsoleerde cardiomyocyten van muizen. In feite heeft de karakterisering van volwassen CM's geïsoleerd van muismodellen licht werpen op vele biologische en pathologische gebeurtenissen. Geïsoleerd CMs van transgene muismodellen hebben toegestaan voor studies van de winst of het verlies van de functie van eiwitten op de contractiele eigenschappen van enkele cellen 2,16, en de leefbaarheid in de ziekte van modellen zoals ischemie / reperfusie 17,18, waardoor informatie uit in aanvulling vivo studies over dese muizen. Het gebruik van geïsoleerde volwassen CM's van muismodellen van verworven hartziekten 3,19,20 (zoals dwarse aorta-vernauwing veroorzaakte druk overbelasting, dat nabootst hypertensie of aortaklepstenose) of de uitoefening 5,21 (voor het modelleren van fysiologische hypertrofie) maakt voor het onderzoek van de interactie van signalerende cascades betrokken bij deze processen cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling op het niveau van de cel. Bovendien is de mogelijkheid om genexpressie te manipuleren met behulp van adenovirale aangedreven genexpressie in volwassen CM biedt ons de mogelijkheid om de componenten van complexe signalerende wegen ontleden.
Vanuit een elektrofysiologisch perspectief hebben whole-cell spanning en stroom clamp experimenten op geïsoleerde volwassen CMs kritisch geweest in het ophelderen van de aard van de ionische stromen bij aanvang en bij diverse ziektebeelden. Vanwege de complexe structuur van de celmembraan en het differentieel protein Steigerconstructies tussen volwassen CMS en NRVMs of heterologe cellijnen, de mogelijkheid om volwassen cellen patch geeft een betere weergave van de gevolgen van bepaalde membraaneiwitten, structurele eiwitten, en ionkanaal interactie partners over de elektrofysiologische componenten van het volwassen hart.
Ondanks deze prominente voordelen in het bestuderen van volwassen muizen hartspiercellen, het isoleren en kweken van volwassen muizen hartspiercellen is uitdagend en drong de noodzaak van een systematische en nauwkeurige omschrijving van de methodologie om levensvatbare muis hartspiercellen te isoleren en ze te handhaven in de cultuur om verdere genetische manipulatie mogelijk maken met behulp van virale vectoren. Eerdere studies hebben gebruikt ofwel acuut geïsoleerd muis volwassen CMS of gekweekte ratten volwassen CMS. De laatste zijn gemakkelijker te cultuur dan volwassen muis CMs, en de meeste experimenten manipuleren van genexpressie in vitro hebben gebruikt rat volwassen CMS. Weinig studies hebben met succes veranderd en onderzocht functionale genexpressie in muizen volwassen CM's, die een grote beperking van de reikwijdte van de experimenten. Daarom, hier geven we in detail dergelijke methodieken, gewijzigd ten opzichte van eerdere onderzoeken, voor de isolatie 7,8,22, cultuur 3,10,15,23, adenovirale infectie 11-13,15, en functionele analyse van volwassen muis ventriculaire cardiomyoctyes. Deze isolatieprotocol resulteert in Ca2 +-tolerante, prikkelbare cardiomyocyten dat we met succes gekweekt gedurende maximaal 72 uur en transiënt getransfecteerd met adenovirus. De functionaliteit van deze geïsoleerde cellen kunnen worden beoordeeld met het MMSYS beeldvormingssysteem 14,24 en patch clamp, die ook zal worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cardiomyocyte Isolatie
Materials (figuur 1)
Microdissecting tang
Tissue tang
Delicate hemostatische tang
Hemostatische tang
Microdissecting, getand, gebogen tang
Operationele schaar, recht
Operationele schaar, gebogen
15 ml Falcon buizen (5)
60 mm petrischaal
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
Nylon Mesh - 400 um poriegrootte
Kleine trechter
Wax coating, gevlochten zijden 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Non-injectienaald, stomp uiteinde, 24 G of commerciële vervoedering naald (24 x 1 in, W/1-1/4)
Heparinenatrium
Ketamine / xylazine mengsel
Pasteurpipetten
OptiVision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS systeem
Opmerking: Als het kweken van cellen, zie rubriek 2 op celkweek voor het begin van dit protocol.
Opmerking: Alle muizen werden verzorgd ineen barrière faciliteit en geofferd volgens de goedgekeurde IACUC regelgeving, praktijken en procedures.
Opmerking: Voorafgaand aan het begin van de procedure, moet het hele systeem worden voorverwarmd zodat alle elementen van het Langendorff (figuur 2A, figuur 3) worden verwarmd tot 37 ° C om goede en volledige collagenase activiteit.
- Injecteren volwassen muizen (~ 12 weken) met 150 USP eenheden heparine natrium in de buikholte.
- Verdoven met een injectie van ketamine / xylazine mengsel bij een gewicht-afhankelijke dosis (Tabel 1).
- 80:12 mg / kg ketamine: xylazine recept: 2,6 ml ketamine (100 mg / ml) + 0,4 ml xylazine (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Finale: ketamine = 6,5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml
- Zet de muis verdoofd om het besturingssysteem pad, accijnzen het hart, en plaats in een schotel van kamertemperatuur PBS of 0,9% zoutoplossing (Figuur 1J). PhyIOLOGISCHE zoutoplossing kan het intacte hart samentrekken betere extrusie van bloed in de kamer en gemakkelijke identificatie van de aorta voor stap 1.6. Muizen werden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat ze diep onder narcose via het verlies van de achterste ledematen teen knijpen reflex en een vertraging van de ademhalingsfrequentie voorafgaand aan de aanvang van de thoracotomie.
- Gebruik OptiVision ontleden bril (Figuur 1A) te identificeren en bloot de aorta. Verwijderen van het weefsel rond de aorta, hoewel het de visualisatie van het vaartuig, is niet nodig voor het optimaliseren van de cel isolatie als de aortawortel duidelijk zichtbaar.
- De pomp met perfusie buffer (tabel 2). De temperatuur moet worden gehouden op 37 ° C voor de duur van de procedure met een gecontroleerde, circulerend waterbad (figuur 2D).
- Monteer het hart op de Langendorff Apparatus (Figuur 2A). Met behulp van twee-micro ontleden tang (fig. 1D-E), prIME de aorta rond de niet-onderhuids, stompe einde naald (24 G) met siliconen buis aan de distale punt. Als alternatief kan een commerciële vervoedering naald (24 x 1 in, W/1-1/4) kan worden gebruikt. De siliconen buis op de 24 G naald of de diervoeding naald zal zorgen voor het vastzetten van de hechtdraad over de groef. Plaats de aorta op de naald als een sok. (Figuur 2C).
- Opmerking: Het is belangrijk om te zorgen dat het uiteinde van de naald rust in de omhooggaande aorta, bij voorkeur in de aortawortel distale rechts innominate, maar dat het niet uitstrekken door de aortaklep in de linker ventrikel, omdat dit zal sterk beperken het vermogen van de buffers effectief perfuseren door het hart via de coronaire arteriën.
- Bevestig het hart om de naald door binden een kleine lengte van hechten zijde (7-10 cm) (fig. 1K) rond de bovenkant van de aorta, zodat de band op het niveau van de aorta ascendens, onder de juiste innominate artery, maar boven het uiteinde van de naald.
- Laat het hart in het inwendige van de conische glazen (figuur 2B) om een geschikte omgevingstemperatuur te handhaven.
- Perfuseren het hart perfusie buffer gedurende 5 minuten bij een snelheid van 1 ml / min en klem de glazen kamer uitstroom zodat het perfusaat te verzamelen in de conische glas en envelop het hart. Het schema voor de vertering van het hart wordt getoond in figuur 3.
- Op dit moment moet u het volume van het hart stijging zien. Daarnaast zal bloed in hartweefsel vervangen door perfusaat, waardoor weefsel bleekheid.
- Laat de uitstroom klem aan het perfusaat uitlekken. Stop de pomp om de slang verplaatsen van de perfusie buffer container het enzym buffervat (figuur 2E). Start de pomp kan worden naar het hart perfuseren met enzym buffer (tabel 2) bij 1 ml / min. Klem de uitstroom weer om het enzym buffer om de envelophart.
- Hier, zoals het enzym wordt perfunderen het hart en het verteren van het bindweefsel, het hart zal bleker worden en de structurele integriteit zal afnemen.
- Om te bepalen wanneer de ventrikels gesneden uit de verteerde hart, til het hart uit de conische glas, knijp het hart met een tang en het verzamelen van een paar druppels perfusaat in een kleine petrischaal en controleer om te zien of enkele cellen dalen .
- Voor de beginner is het handig om de perfusie lijn met een manometer aansluiten. Wanneer het hart wordt steeds verteerd zal de druk snel te dalen, als het bindweefsel niet de weerstand te houden. De manometer is ook nuttig voor de beginnende zodat de positie van de naald boven de aortaklep en niet in de ventrikel. Lage druk geeft aan dat de naald in de ventriculaire kamer en hogedruk aangegeven dat de naald raakt het ventiel.
- Snijd de ventrikels van het hart in een schaalvol overdracht buffer (A) (tabel 2) wanneer de ventriculaire druk begint te dramatisch dalen of wanneer u in staat om enkele cellen zien in het perfusaat zijn. Dit duurt meestal ~ 7-10 minuten.
- Wederom met behulp van micro-ontleden pincet (figuur 1C), gehakt de ventrikels in kleine stukjes te distantiëren. Een succesvolle vertering zal vrijwel geen vaste stukjes weefsel verlaten na het hakken, met de meeste van het weefsel steeds amorfe op dissociatie.
- Om verder dissociëren het weefsel, pipet de oplossing / uit met een kunststof Pasteur pipet (figuur 4), waarvan de punt was gesneden in een ~ 45 °. Deze wijziging dient om de inwendige diametrale ruimte van de pipetpunt aldus verminderen van de hoeveelheid schuifspanning op de cellen als het weefsel getritureerd verhogen.
- Voor ontleden van het weefsel met de tang is het mogelijk om de afzonderlijke kamers te scheiden en afzonderlijk dissociëren atrium, linker ventrikel of recht ventriculaire cellen.
- Beveilig de vierkante mazen (figuur 1 M) tot een kleine trechter (figuur 1L) met klemmen en plaats deze filtering apparaat in een 15 ml Falcon buis (figuur 1I).
- Gebruik de gemodificeerde Pasteur pipet om de cel oplossing uit de schaal verwijderd en filtreer de oplossing in de Falcon buis.
- Laat de levende cellen om zich te vestigen op de bodem van de buis (live cell sedimentatie moet 2-4 min. duren).
- Aliquot 2,5 ml van elk van de vier calciumoplossingen (tabel 3) in 4 afzonderlijke 15 ml Falcon buizen.
- Wederom met een standaard Pasteur pipet, verwijder de celpellet van de bodem van de buis en breng de cellen de eerste van de calciumoplossingen.
- Laat de cellen naar de bodem van de buis en stap 1.17 herhalen de volgende calciumoplossingen totdat de cellen in de laatste oplossing.
- Laat de cellen zich te vestigen in de fourth calcium oplossing. Doe het buisje dicht en zet hem op zijn kant.
2. Celkweek
- Voor de isolatie, plaat 1 ug / ml natuurlijke muis laminine op dekglaasjes en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C en 2% CO2. Ook laat de platen en kweekmedia (tabel 4) te verwarmen in de incubator bij 37 ° C en 2% CO2. Hierdoor kan het opgeloste CO2 in de media in evenwicht.
- Verwijder de bovenkant van de media. Draai gewoon de top om besmetting te voorkomen.
- Laat de geïsoleerde cellen pellet op de bodem van de Falcon buis.
- Verwijder de pellet met een standaard kunststof Pasteur pipet en resuspendeer in de juiste hoeveelheid plating media.
- Plaat de cellen op de laminine beklede dekglaasjes in de juiste maat schotel en incubeer bij 37 ° C en 2% CO2 gedurende ten minste 30-60 minuten zodat de cellen hechten aan de dekglaasjes.
- ** Als transfecteren met adenovirus, verdunnen het virus in een geschikte hoeveelheid van plating media en vervang de beplating media in de schaal met de virus-bevattende media. Laat het virus op de cellen incuberen gedurende 2 uur bij 37 ° C en 2% CO2. **
- Verwijder de beplating media uit de schotel en te vervangen door de cultuur media.
- Wijzigen voorzichtig het kweekmedium dagelijks om niet de cellen op de dekglaasjes verstoren.
Met deze procedure werden cellen met succes gekweekt tot 72 uur. Afbeeldingen van gekweekte en GFP getransfecteerde cellen zijn te vinden in figuur 5.
3. MMSYS System
- Power de MMSYS dat waarborgt dat de booglamp eerste wordt gestart.
- Sluit de buizen van de pomp naar de juiste inlaat en uitlaat van de MMSYS kamer (figuur 6).
- Vul het systeem met calcium buffer (B) (Tabel 2).
- Plaats een ca.opriately sized glazen dekglaasje in de kamer en zet hem vast (figuur 6E). De meeste MMSYS kamers gebruiken ofwel 22 mm of 25 mm vierkant dekglaasjes. Raadpleeg uw MMSYS handleiding om de juiste dekglaasje voor uw kamer bepalen.
- Breng 500 pi van de celoplossing om een kleine Eppendorf buis.
- Voeg 0,5 ul fura2-AM (voorraadoplossing van 1 ug / ul) aan het buisje van cellen en laat ze incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5-7 minuten. Hierdoor kan de fura2-AM tot "load" in de cellen door snelle passieve diffusie door het celmembraan.
- Laat de Fura-2 geladen cellen neer op de bodem van de buis, en was de overmaat Fura met 500 ui buffer calcium B.
- Schakel verlichting in de kamer.
- Met een standaard Pasteur pipet, druppel 1-2 druppels (afhankelijk van de celconcentratie) van het "beladen" cel oplossing in het midden van de kamer (figuur 6C) en laat de celleo vestigen op het dekglaasje gedurende 5 minuten.
- De dichtheid van de cellen in de kamer moet zodanig zijn dat enkele niet-overlappende cellen gemakkelijker kunnen worden weergegeven in de MMSYS data acquisitie platform.
- Beginnen zorgvuldig om calcium buffer (B) stroomt door de kamer.
- Verhoog de kamertemperatuur tot 37 ° C.
- BELANGRIJK: Schakel de verwarming apparaat totdat de stroom is gestart. Dit kan de feedback thermocoupler (figuur 6A) ernstig beschadigen.
- Zorg ervoor dat de kamer is verbonden met de MyoPacer via verbindingsdraden (figuur 6B) en beginnen de cellen tempo 5 Hz met 1,5 x de stimulatiedrempel van de cellen.
- Kies een cel die slaat op de juiste frequentie en beweeg het in de framing diafragma.
- Stel de camera en lijsten diafragma afmetingen, zodat de hele cel in het midden van het venster, horizontaal gerichte, met de sarcomeren apouder.
- Voor cel lengte aan te passen de rode en groene (rechts en links) fotodiode indicatoren aan de rand van de cel. Stel nu het contrast zwart / wit contrast aan de randen van de cel te optimaliseren. Raadpleeg de Ionoptix handleiding voor meer informatie.
- Plaats het vat in een gebied van de cel met welomschreven sarcomeren en de scherpstelling naar de top van het vermogensspectrum (rood) optimaliseren. Ook de helderheid van de microscoop om de blauwe smoothing raam en zwarte contrast informatie te optimaliseren.
- Pas de groene drempel bars om zoveel mogelijk van de rode vermogensspectrum (piek) en zo weinig achtergrond mogelijk vast te leggen.
- Begin met opnemen.
- Nadat voldoende data is opgeslagen, op "Pauze" om de opname tijdelijk te stoppen, zodat noch het gericht en afmetingen van het weergavevenster worden gewijzigd, verplaats stadium van de microscoop om een gebied van het dekglaasje waarin geen cellen of cellulair materiaal kan gezien. LenGTH van de opname is afhankelijk van de onderzoeker experimentele protocol.
- Opmerking: Als u op "Stop" wordt de opname te stoppen en geen achtergrond kunnen worden geregistreerd voor die cel zal zijn.
- Klik op "Doorgaan" om een achtergrond meting opnemen.
- Na genoeg achtergrond is opgeslagen klik op "Stop" om de opname te stoppen.
- Klik op "Bestand >> Opslaan" om alle sporen van die cel in een enkele. ZPT bestand wilt opslaan.
- Herhaal stap 3,12-3,20 totdat voldoende cellen zijn opgenomen.
- Raadpleeg de IonOptix-MMSYS Gebruikershandleiding 12 voor instructies over de analyse van de geregistreerde gegevens. Kenmerkend opgenomen data van wildtype cardiomyocyten in figuur 7.
4. Patch Clamp
Patchklemmen van verschillende celtypen zijn goed eerder beschreven in dit tijdschrift 25-28. Daarom richten we ons op sommige criticusal parameters voor een succesvolle patchklemmen van volwassen hartspiercellen geïsoleerd met behulp van ons protocol beschreven.
- Met behulp van een pipet trekker en borosilicaatglas (met gloeidraad: OD 1.5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm lengte) trekken een pipet die vertoont ~ 2,0-3,0 MQ wanneer gevuld met pipet oplossing (tabel 5).
- Brand-polish de pipet tip zachtjes met een Narishige of ander verticaal vuur polijstmachine. De weerstand van de patch pipet moet 2-4 MO na brand polijsten zijn.
- Zet de computer, versterker (Axopatch 200B), AD-omzetter (Digidata 1440A, Axon Instruments) en Micromanipulator (MP-285). Voor gehele cel patch clamping beginnen we met standaardparameters zoals eerder beschreven.
- Voor gekweekte volwassen CM's, verwijder ze uit de couveuse en voorzichtig te wassen het dekglaasje waarop de CM's zijn bedekt met PBS bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig het dekglaasje en plaats deze in de perfusie kamer op de omgekeerde microscoop (Nikon TE 2000).
- Zorg ervoor dat de inlaat voor het perfusie systeem steekt (zuiging) net boven het oppervlak van het dekglaasje.
- Begin perfuseren met de juiste extracellulaire oplossing (Tabel 5).
- Voor net losgemaakte volwassen CMs, plaats een collageen gecoate dekglaasje in de perfusie-systeem zoals hierboven.
- Omdat de cellen in oplossing plaats voorzichtig het extracellulaire oplossing buffer.
- Met behulp van de gewijzigde Pasteur pipet (figuur 4), voorzichtig resuspendeer de cellen in de extracellulaire buffer, neem een hoeveelheid en plaats het op het dekglaasje.
- Laat de cellen hechten gedurende 10-15 minuten voor aanvang van de perfusie als in 4.4.
- Back-vul de gehele cel patch pipet met intra-cellulaire buffer met behulp van een Microfil (World precisie-instrumenten, 28 G) naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de punt van de pipet, tik voorzichtig om de luchtbellen te zweven naar de surface van de oplossing.
- Bevestig de gevulde patch pipet om de pipet-houder, zodat er contact is tussen de micro-elektrode en de interne oplossing.
- We maken gebruik van zilverchloride elektroden, maar zorgen voor 'chloriding' de zilveren draden minstens een keer per week door onderdompeling gedurende de nacht in bleekwater.
- Sluit voorzichtig de pipet in het bad, zodat het bad elektrode is ondergedompeld te allen tijde in het bad / extracellulaire oplossing. Offset elke vloeistof junction mogelijkheden op dit moment. Grote kruispunt potentials kan een teken van de verslechterende zilverchloride op de elektroden zijn.
- Gezonde cilindrische volwassen CMs worden geïdentificeerd in de microscoop en gecentreerd in het gezichtsveld. Zoals eerder beschreven, een combinatie van het verplaatsen van de micromanipulator en de scherpte maakt nabijheid van de patch pipet en het oppervlak van het GH.
- Zodra ze zijn in hetzelfde focal plane, maken we gebruik van een combinatie van visuelenisatie van de cel en testimpuls (beschikbaar in de Axopatch 200B).
- Wanneer de weerstand van de pipet af doormidden (suggereert dat de pipet in contact met het oppervlak van de cel), en de cel blijft cilindrische kijken we na gigaohm afdichting met zachte zuigkracht.
- CMS, geven we de voorkeur mond zuig om negatieve druk te vestigen. Als een gigaseal succes wordt verkregen, we weer gebruik maken van zachte ritmische mond afzuigen 'break-in' om de cel te whole cell patch mode vast te stellen.
- Typische rust mogelijkheden van gezonde CM's zijn in de orde van -85 tot -90 mV. Zodra een gigaseal wordt verkregen, het meten van de rust membraanpotentiaal behulp stroomtang met I = 0 pA.
- Als de rust membraanpotentiaal gedepolariseerd dit een beschadigde cel of een slechte afdichting kan aangeven.
- Omdat de CM's zijn grote cellen met veel oppervlakte, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan compensatie capaciteit, vooral when snel activeren stromingen zoals natriumkanaal moet worden bestudeerd. Indien er voldoende capaciteit schadevergoeding niet kan worden verkregen met behulp van de ingebouwde compensatie instellingen van de pulsgenerator, prepulses bij sub-threshold voltage en tegengestelde polariteit kan moeten worden toegepast en de resulterende stroom afgetrokken van het opgenomen signaal. Een dergelijk protocol is eenvoudig te programmeren in Axopatch.
- Zodra whole cell patch mode is vastgesteld, wacht 15 minuten, zodat een evenwichtstoestand en stabiliteit van de afdichting te garanderen voorafgaand aan het begin spanning of stroom clamp protocollen. Wij maken gebruik van standaard protocollen die eerder zijn beschreven in deze en andere tijdschriften en zullen niet worden ingegaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatie van volwassen cardiomyoctyes resultaten staafvormige, gegroefd en zwakke (niet spontaan kloppen) cellen (Figuur 5A). Dode cellen zullen afgeronde kijken en geen strepen zullen aanwezig zijn. Rustende cellen kunnen gekweekt en getransfecteerd met adenovirus genexpressie (Figuren 5B en 5C) manipuleren. Na 24 uur van de cultuur, de morfologie van de levende cellen niet verandert, ze nog Ca 2 +-tolerant en kunnen worden afgepast door veldstimulatie. Met de voorgestelde werkwijze kan een rendement van 80-90% levensvatbare cellen worden bereikt.
Om contractiliteit van de cel te meten, de MMSYS systeemsoftware neemt de fase-informatie van de microscoop om ofwel de veranderingen in sarcomeer of cellengte melden. Getoond in (figuur 7A) is een representatief samentrekbaarheid trace via sarcomeer lengtemeting van een wild-type C57BL6 muis. Voor gezonde volwassen muis myocytes van dese muizen, de basislijn sarcomeer lengte is ~ 1,7-1,9 micrometer. Het MMSYS systeemsoftware mogelijkheid gelijktijdig contractiliteit en calciumhuishouding door meting van de verhouding van de gebonden aan de ongebonden vorm van de calcium-geactiveerde kleurstof fura2-AM. Terwijl de verhouding maatregelen kunnen afwijken van opstellingen voor gezonde cellen, de verhouding ligt typisch tussen 1,5-2,5 (figuur 7B). Als het MMSYS systeem is gekalibreerd voor calcium, kan deze verhouding worden vervolgens omgezet in absolute maat van de intracellulaire calciumconcentratie. Om de gegevens die zijn gegenereerd uit de contractiliteit en calcium sporen analyseren, moeten de sporen worden gemiddeld om een karakteristieke spoor voor die cel (figuren 7C en 7D) creëren. Deze karakteristieke sporen worden vervolgens onderworpen aan een monotransient gegevensanalyse algoritme van het MMSYS systeemsoftware die dan genereert parameters voor systolische en diastolische functie. Verdere details aanwezig in de Ion zijnOptix handleiding.
Volwassen muis hartspiercellen werden ook onderworpen aan whole cell patch clamp experimenten waarin de actiepotentiaal werd opgenomen in stroomklem mode (figuur 8).
| Lichaamsgewicht (g) | Ketamine / Xylazine (ml) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0,55 |
| 50 | 0,62 |
Tabel 1. Volwassen muis Gewichtsafhankelijke Ketamine / Xylazine Dosering (80:12).
| Oplossing | Recept |
| Tyrode Buffer * (PH 7,4) | 1 L DDH 2 O 137 mM NaCl 4 mM KCl 1 mM MgCl 10 mM HEPES 0,33 mM NaH 2PO 4 |
| Perfusie Buffer * (PH 7,4) | 500 ml Tyrode Buffer 10 mM D-(+)-glucose, minimum 5 mM Taurine 10 mM butaandion monoxime (BDM) |
| Enzyme Buffer * | 50 ml perfusiebuffer 0,024 g Collagenase D (type IV) 0,018 g Collagenase B (Type II) 0.003 g Protease XIV uit Streptomyces griseus |
| Transfer Buffer (A) | 45 ml perfusiebuffer 5 ml Bovine serum albumine (bij 5 mg / ml voorraadoplossing) |
| Calcium Buffer (B) | 1 L Tyrode buffer 1,2 mM CaCl 5,5 mM D-(+)-glucose, minimum |
Tabel 2. Volwassen Cardiomyocyte Isolatie Buffer Recepten.
| [CaCl] | Transfer Buffer (A) | Calcium Buffer (B) |
| 0,06 mM Ca 2 + | 9.5 ml | 0,5 ml |
| 0,24 mM Ca 2 + | 8,0 ml | 2,0 ml |
| 0,60 mM Ca 2 + | 5,0 ml | 5,0 ml |
| 1,20 mM Ca 2 + | 0 ml | 10 ml |
Tabel 3.Calcium titratieoplossing Recepten.
| Plating Medium | Culture Medium |
|
|
Tabel 4. Plating en cultuur Media recepten.
| Pipetteer Oplossing | Bad Solution |
|
|
Tabel 5. Patch Clamp oplossingen (oplossingen zijn aangegeven voor het meten natriumstromen).
Figuur 1. .. Volwassen cardiomyocyte isolatie instrumenten A) OptiVisor optisch glas verrekijker vergrootglas B) Tissue tang, 5,5 in, 1x2 tanden -. Roboz Wetenschappelijk C) Moloney tang - 4,5 in (11,5 cm) lange flauwe bocht, gekartelde -. Roboz Wetenschappelijk DE) Dumont # 3 tang, Dumostar, tip afmeting 0.17 x 0.10 mm. F) Packer Mosuito Tang 5 in Straight Flat -. Roboz Wetenschappelijk G) Micro dissectieschaar 4,5 in Gebogen Sharp / Sharp -. Roboz Scientific H) Micro dissectieschaar 3,5 in Rechte Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Wetenschappelijk I) 15 ml Falcon buis - Thermo -Fisher Scientific J) 60mm petrischaal met PBS K) Softsilk: Wax gecoat gevlochten zijde, 19 mm - Covidien L) Plastic trechter, 6,0 cm diameter M) Nylon mesh - 400 urn poriegrootte.....
Figuur 2. Langendorff Apparatuur. A) De gehele Langendorff perfusie-systeem gebruikt voor volwassen cardiomyocyten isolement. B) vergrote weergave van de holle, kegelvormige glascollectie trechter gebruikt voor verwarming van de gecanuleerde hart. C) vergrote weergave van de niet-injectienaald canulatie naald. (Herbruikbare Feeding Naalden (24 G, rechte, ronde punt, 25 mm lang; Fine Science Tools Inc Item 18061-24). D) circulerend waterbad E) Water bad voor de incubatie perfusie, enzym en overdracht buffers.
Figuur 3. Een gedetailleerd schema van het perfusie systeem.
Figuur 4. Gemodificeerde Pasteur pipet. De pipet werd gewijzigd door het snijden van de tip aan een ongeveer 45 ° hoek. Dit maakt een groter oppervlak en creëert minder schuifspanning op de cellen als ze worden gescheiden. De inzet toont een beter zicht van de gewijzigde tip.
Figuur 5. Gekweekte en GFP getransfecteerde cardiomyocyten. A) Vers isolat ed volwassen hartspiercellen uit een C57BL6 muis van 12 weken. Pijlen wijzen op dode of stervende cellen. Deze cellen zijn ronder dan de gezonde, staafvormige volwassen CM. B)-GFP getransfecteerde volwassen muis cardiomyoctyes na 24 uur van de cultuur. C) Gekweekte volwassen muis cardiomyocyten na 24 uur. Inzet toont verhoogde vergroting van gekweekte myocyten.
Figuur 6. . MMSYS systeem kamer Blauwe pijlen staan voor de stroom van de perfusie buffer (buffer B) A) Single, in-line oplossing verwarming -... Warner Instrument Corporation B) Aansluiten draden van de MMSYS systeem kamer naar de MyoPacer veld stimulator C) Platinum elektroden voor veldstimulatie gelegen in het centrum van de kamer. D) Uitstroom reservoir. E) kamer klemmen in de open positie.
Figuur 7. Representatieve MMSYS systeem vastgelegde gegevens voor wild-type muizen C57BL6 verkregen van Jackson Labs. A) MMSYS basis contractiliteit sporen. B) Ratio van Ca 2 +-gebonden aan Ca 2 +-ongebonden fura2-AM opgenomen op basis van calcium sporen genereren. Deze sporen komen overeen met de contractiliteit metingen in A). C) Averaged base contractiliteit sporen samengesteld door de MMSYS systeemsoftware tot een karakteristiek contractiliteit trace. D) Karakteristiek calcium trace samengesteld uit de basis sporen in B). Analyse van de samengestelde sporen zal de onderzoeker om surrogaat parameters voor de systolische en diastolische functie te genereren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 8. Patch clamp trace met de actiepotentiaal van een wild-type volwassen muis cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit verslag hebben we de technieken die noodzakelijk zijn voor een succesvolle isolatie en kweek van volwassen CMS in het muizenhart beschreven. De techniek maakt vervolgstudie CM functie en prikkelbaarheid volgens de hierboven beschreven werkwijzen. De kritische parameter voor het bestuderen functionaliteit van volwassen CM is de gezondheid en de geïsoleerde CM. Zoals hierboven beschreven, onze technieken maken een hoge opbrengst van functionele cellen die vatbaar zijn voor manipulatie van genexpressie met adenovirale / lentivirale infecties in cultuur en analyse van de cellulaire exciteerbaarheid en contractiele functie zijn.
Een van de belangrijkste parameters voor de isolatie van functionele volwassen muis CM nauwkeurig en snel canulatie van het hart op de niet-injectienaald. Er moet voor worden gezorgd dat de aorta aan de linker ventrikel ontleed een voldoende lengte zodat voor eenvoudiger en snellere canulatie van het hart. Wanneer cannulating thij hart, is het ook essentieel dat de punt van de naald blijft in de omhooggaande aorta en niet voorbij de aortaklep in de linker ventrikel om een doelmatig perfusie van het weefsel via de kransslagaders. De volgende cruciale stap is het bevestigen van de aorta om de steel van de naald met een zijden hechtdraad. De hechting moet worden gebonden op de omhooggaande aorta, waardoor de perfusie buffer stroomt retrograad in de kransslagaders en linker ventriculaire holte maar niet antegradely stromen door het distale uiteinde van de ontleed aorta of de grote vaten.
Sommige onderzoekers vinden het nuttig om een drukmeter om de kwaliteit van de infusen en vervolgens perfusie van het enzym bepalen. Bij gebruik van een manometer, dient de initiële linker ventriculaire druk worden ~ 80-100 cmH 2 O, en na perfusie met het enzym, wordt de druk verlaagd tot ~ 40-50 cmH 2 O. Wanneer de ventriculaire druk dit punt bereikt ishoogstwaarschijnlijk direct vanaf de naald te snijden. Om de ventrikels goed verteerd, kan een paar druppels van de doorstroming in een petrischaal ophalen onder het hart en gecontroleerd om te zien of levende, latente cellen aanwezig zijn.
De resulterende geïsoleerde cellen uit deze procedure lenen zich goed om immunocytochemie. Ze kunnen worden bevestigd met regelmatige bevestigingssystemen 29 (bijvoorbeeld formaline, paraformaldehyde, ijskoude methanol of aceton), maar een hoger permeabilisatie dan wordt meestal gebruikt voor neonatale cardiomyoctyes is soms nodig om het cytosolische eiwitten of structuren (bijvoorbeeld alfa- sarcomerische actine, beta myosine). Ten slotte kunnen de cellen worden gekweekt en vervolgens geïnfecteerd met adeno-of lentivirussen genexpressie te manipuleren, of voor functionele analyse van de cellulaire contractiele apparaat.
Cultuur van volwassen muis CM's is al lang beschreven alsuitdagend. Met behulp van de technieken beschreven hier, kunnen we routinematig cultuur deze cellen voor maximaal 72 uur, hoewel de opbrengst van functionele cellen sterk afneemt na 36 uur. Bij kweken van de cellen, is het noodzakelijk dat de cellen worden uitgeplaat bij 37 ° C in 2% CO2. Dit verschilt van neonatale CM, die benaderd worden gekweekt bij 10% CO2 gedurende de eerste 24 uur en vervolgens in 5% CO2 of neonatale fibroblasten, die ook de voorkeur 5% CO2. De beplating en cultuur media kunnen worden in evenwicht gebracht, waardoor de opgeloste CO 2 is 2%.
De cellen worden uitgeplaat op laminine beklede dekglaasjes zodat ze niet tillen van het glas, wanneer de media veranderd. Echter, de cardiomyocyten niet erg stevig hechten aan het glas zelfs met de laminine coating. Het is daarom zeer belangrijk dat voorzichtigheid geboden bij het veranderen van het kweekmedium, met steriele pipetten en geen vacuüm afzuigsysteem. Zodra de cels zijn bedekt, kunnen ze worden getransfecteerd met adenovirus door het incuberen van het virus niet meer dan 2 uur. De timing is afhankelijk van de titer van het virus en het eiwit over-expressie daarom over het uitvoeren inleidende experimenten LD50 en ED50 bepalen het virus. In de meeste gevallen gebruiken we een MOI van 20-100 voor het adenovirus. Nadat de cellen zijn geïncubeerd met virus, de expressie van het doelgen (en) neemt doorgaans ~ 24-36 uur.
Geïsoleerde cellen die zijn uitgeplaat op dekglaasjes van een geschikte grootte voor het MMSYS systeem kamer kan ook worden geanalyseerd contractiliteit en calciumhuishouding met het MMSYS beeldvormingssysteem. Deze dekglaasjes kunnen direct worden geplaatst in de kamer, en het kweekmedium kan worden verwijderd door het perfusie systeem. Als de cellen niet zijn gekweekt en worden gebruikt voor analyse direct na isolatie, kunnen zij direct worden toegevoegd aan de kamer eenmaal dekglaasje is geplaatst. Terwijlhet is niet nodig om vooraf de vacht van de dekglaasjes met laminin bij het analyseren van vers geïsoleerde cellen, in onze ervaring, laminin helpt de cellen beter aan het dekglaasje. Met behulp van een trage debiet voor de MMSYS unit bovendien zorgt ervoor dat cellen blijven verbonden aan het dekglaasje. Tenslotte moet de optiek van de microscoop, vooral de objectieflens zorgvuldig worden gereinigd voorafgaand aan elk experiment, zodat nauwkeurige visualisatie sarcomeren nodig voor de beoordeling van contractiliteit.
De meest cruciale onderdeel van het MMSYS systeem is de single in-line vloeistof kachel die de perfusie buffer (B) verwarmt als het uitmondt in de kamer. De thermogene element van dit apparaat is ontworpen om warmte uit te wisselen met het passeren van vloeistof via convectieve warmteoverdracht, dus als de stroom afwezig is, zal de wisselaar oververhit raken en onherstelbaar het systeem beschadigen. Het is daarom absoluut noodzakelijk dat de verwarming wordt aangezet nadat de stroom wordt gestart.
Andere analyses van het contractiele apparaat van volwassen hartspiercellen werden eerder beschreven, waaronder geavanceerde methoden met behulp van atomic force microscopie 30-32. Sommige van deze methoden is het mogelijk voor meer geavanceerde meting van gelokaliseerde contractiekracht en eigenschappen zoals Young's modulus, waardoor ze meer geschikt voor het meten van onregelmatig gevormde cellen of cellen zonder duidelijk omschreven sarcomerische systemen zoals CMs afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze technieken kunnen net zo makkelijk gebruikt op de geïsoleerde volwassen CM's zijn. Het voordeel van het MMSYS systeem is het relatieve gemak van het meten van de contractiliteit en de mogelijkheid om een groot aantal cellen te meten in een korte tijd in cellen met duidelijk gedefinieerde sarcomeren. Bovendien, de zachte randen en sarcomeer analysesystemen die de lengte van de cel of de lengte tussen sarcomeres kan meten respectievelijk zorgen voor twee verschillende (maar ropgetogen) methoden om contractiliteit meten. De data-acquisitie software in combinatie met de geavanceerde, gebruiksvriendelijke analyse software maakt dit systeem eenvoudig te leren en te gebruiken. Tenslotte, de mogelijkheid om calciumdynamiek gelijktijdig meten maakt correlatie tussen contractiliteit en calcium homeostase, die niet haalbaar met atomaire kracht microscopie. Ook, omdat de data-uitgang is een ratiometrische maatregel van een calcium-geactiveerde kleurstof (fura2-AM), met de juiste kalibratie, absolute maatregelen van interne calcium concentraties kunnen worden verzameld.
Succesvolle opname van ionkanaal signalen van volwassen hartspiercellen vereist de cellen in optimale conditie. Onmiddellijk na isolatie en plateren van de cellen die niet hechtend en zal drijven in oplossing, in dit stadium niet kunnen worden onderzocht. Binnen een paar uur zullen zij zich aan een gecoate dekglaasje en het is op dit punt dat ze kunnen worden bestudeerd. In onze ervaring patchen binnen een paar uurplating levert het optimale resultaat, zoals te lang wachten een negatieve invloed op de cellen. Zoals hierboven beschreven testen de rust membraanpotentiaal na vaststelling van een gigaohm afdichting en breken in de cel, alsmede de mogelijkheid om een gigaohm verbinding zelf zijn twee parameters die weergeven hoe de gezonde cellen bij de patching vast. Hoewel het gemakkelijker patch op cellen die geen aanbestedende, dit is geen vereiste, adequate afdichting kan worden verkregen op slaan cellen ook. De protocollen die gebruikt worden op dit punt hangt af van de doelstellingen van de patchklemmen studie, met de huidige clamp technieken, kan spontane of geïnduceerde actiepotentialen worden opgenomen. Alternatief kan spanning klemmen worden gebruikt om specifieke ionkanalen te bestuderen. Gezien het arsenaal van kanalen in het membraan worden dergelijke opnamen gewoonlijk in aanwezigheid van ionkanaal blokkers. Tetrodotoxine (TTX) worden nisoldipine en cesium vaak respectievelijk natrium-, calcium-en kaliumkanalen te blokkeren, although een verscheidenheid van medicijnen zijn gebruikt, en de details van het gebruik ervan zijn uitgebreid gepubliceerd. De meeste benaderingen omvatten zowel opnemen stromen voor en na toepassing van ionenkanaal blokkers en aftrekken van de stroming en / of blokkerende achtergrond kanalen met de nodige blokkers vóór opname.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
