Summary
نحن هنا وصف عزلة cardiomyoctyes فأر بالغ باستخدام نظام نضح Langendorff. الخلايا الناتجة CA2 +-تسامحا، هادئة كهربائيا ويمكن أن يكون مثقف وtransfected مع-الغدة أو lentiviruses للتلاعب الجيني. ويمكن أيضا تحليل وظائفها باستخدام نظام MMSYS وتقنيات المشبك التصحيح.
Abstract
وقد وفرت استخدام العضلية الأولية (CMS) في الثقافة تكملة قوية لنماذج الفئران من أمراض القلب في دفع فهمنا لمرض القلب. على وجه الخصوص، وقد أدت القدرة على دراسة توازن الأيوني، وظيفة القناة الايونية، استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران والتعديلات في ظروف المريضة والطفرات المسببة للمرض إلى رؤى كبيرة في أمراض القلب. علاوة على ذلك، فإن عدم وجود خط الخلية كافية لتقليد الكبار خلد مضادة، والقيود المفروضة على الأطفال حديثي الولادة مضادة (التي تفتقر إلى العديد من الخصائص الميكانيكا الحيوية الهيكلية والوظيفية من الكبار CMS) في الثقافة أعاقت فهمنا للتفاعل معقد بين مسارات الإشارات، القنوات الأيونية وخصائص مقلص في قلب الكبار تعزيز أهمية دراسة الكبار العضلية معزولة. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة، والتلاعب في التعبير الجيني عن طريق الغدانية-expreالبروتينات ssed، وتحليل وظيفي لاحقة من العضلية من الماوس الكبار. فإن استخدام هذه التقنيات تساعد على تطوير البصيرة الآلي في مسارات الإشارات التي تنظم استثارة الخلوية، كا 2 + ديناميات وانقباض وتوفير توصيف أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الكثير من أمراض القلب والشرايين.
Introduction
خدموا نماذج الفئران من مرض القلب والأوعية الدموية كأدوات فعالة لتوضيح الآليات الأساسية المرض 1،2 فضلا عن تحديد الأهداف العلاجية المحتملة 1،3. على وجه الخصوص، واستخدام كلا النموذجين الفئران من أمراض القلب المكتسبة (مثل الضغط الزائد) 4،5 ونماذج الماوس المعدلة وراثيا قد تقدم فهمنا لمرض القلب 6-8. استخدام تقنيات زراعة الخلايا لدراسة الإشارات شلالات 3،9،10 وتغييرات في البروتينات الفردية التي تكمن وراء استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران في قلب 11-13 على مستوى خلية واحدة ويكمل في الجسم الحي نماذج الماوس. ومع ذلك، فإن عدم وجود خطوط الخلايا الكافية التي تعكس هيكل CM الكبار وظيفة جود قيود كبيرة. وقد سعى المحققون للتغلب على هذا من خلال دراسة البروتينات الفردية، مثل القنوات الأيونية، في أنظمة تعبير مغايرة
وسهلة نسبيا للثقافة، يمكن أن يصاب الأطفال حديثي الولادة العضلية البطين الفئران الابتدائي (NRVMs) مع الفيروسات الغدية وlentiviruses للتلاعب التعبير الجيني 15، والثانية تم لذا استخدمت بنجاح 1، ولكن لديها قيود خاصة بهم. على الرغم من أنها توفر المكروية الفسيولوجية 1 وكانت العمود الفقري للحقل الإشارات، اختلافات جوهرية بين التشكل وتنظيم التحت خلوية من NRVMs وcardiomyoctyes الكبار جعلها نموذجا غير كافية للتحقيق في تدفقات الأيونية والإثارة، تقلص اقتران في قلب الكبار . أبرزها NRVMs تفتقر إلى نهائي تي أنبوبي الفرعي 4. منذ كا 2 + تدفق وديناميكية تعتمد بشكل حاسم على ناضجة تي أنبوبي وشبكية الهيولى العضلية (SR) هيكل 6، كا 2 + ديناميات والدراسات الفنية التابعة للانقباض القلب في NRVMs ليست انعكاسا دقيقا لهذه العمليات الحرجة في العضلية الكبار. علاوة على ذلك، بعض مكونات مسارات الإشارات تختلف بين الأطفال حديثي الولادة والكبار الفئران 9، وبالتالي توفير الحد أخرى لدراسة عمليات المرض وأنا علىMPACT على استثارة الخلوية وانقباض في NRVMs. أخيرا، وتوزيع آلات مقلص يؤدي إلى متعدد الاتجاهات وغير موحدة تقصير الخلايا مما يحد من دقة القياسات مقلص.
وبالتالي فإن استخدام العضلية الكبار معزولة يوفر أكثر دقة في المختبر نظام النمذجة. نمو استثنائية من المعرفة الذي أصبح ممكنا بفضل التلاعب الجيني للفئران يؤكد أهمية الحصول العضلية المعزولة من الفئران وظيفية. في الواقع، فإن توصيف مضادة الكبار معزولة عن نماذج الماوس وتسليط الضوء على العديد من الأحداث البيولوجية والمرضية. وقد سمحت مضادة معزولة عن نماذج الماوس المعدلة وراثيا للدراسات من ربح أو خسارة وظيفة من البروتينات مقلص على خصائص الخلايا واحدة 2،16، وقدرتها على البقاء في نماذج الأمراض مثل نقص التروية / ضخه 17،18، وبالتالي استكمال المعلومات المكتسبة من في الدراسات المجراة علىالفئران حد ذاتها. استخدام الكبار معزولة مضادة من نماذج الفئران من أمراض القلب المكتسبة 3،19،20 (مثل عرضية الأبهر الناجم عن انقباض الضغط الزائد، الذي يحاكي ارتفاع ضغط الدم أو تضيق الأبهر صمام) أو ممارسة 5،21 (لنمذجة تضخم الفسيولوجية) يسمح للفحص تفاعل يشير شلالات المتورطين في هذه العمليات مع استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران على مستوى خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، والقدرة على التعامل مع التعبير الجيني باستخدام يحركها الغدانية التعبير الجيني في الكبار مضادة يتيح لنا الفرصة لتشريح مكونات مسارات الإشارات المعقدة.
من وجهة نظر الكهربية، وقد تم الجهد خلية كاملة والتجارب المشبك الحالي على الكبار معزولة مضادة حاسمة في توضيح طبيعة التدفقات الأيونية في الأساس وفي مختلف الحالات المرضية. بسبب بنية معقدة من الأغشية الخلوية والمتواجد التفاضليةفي هياكل السقالات بين الكبار مضادة وNRVMs أو خطوط الخلايا مغاير، والقدرة على التصحيح خلايا بالغة يعطي تمثيل أفضل بكثير من آثار بعض البروتينات الغشاء، والبروتينات الهيكلية، والقناة الايونية شركاء التفاعل على المكونات الكهربية للقلب الكبار.
على الرغم من هذه المزايا البارزة في دراسة الكبار العضلية الفئران وعزل وزراعة العضلية الفئران تم تحدي، وحث على ضرورة وصف منظم ودقيق للمنهجية عزل العضلية الماوس قابلة للحياة والمحافظة عليها في الثقافة للسماح مزيد من التلاعب الجيني باستخدام الفيروسية ناقلات. وقد استخدمت الدراسات السابقة إما معزولة تماما الكبار الماوس مضادة أو مستنبت الكبار الفئران مضادة. هذه الأخيرة هي أسهل للثقافة من الماوس الكبار سم، واستخدمت معظم التجارب التلاعب التعبير الجيني في المختبر الفئران الكبار مضادة. غيرت بنجاح قليل من الدراسات والتحقيق الوظائالتعبير الجيني اونال في الماوس الكبار مضادة، وتقديم الحد الكبيرة في نطاق التجارب. وبالتالي، فإننا نقدم هنا في التفاصيل هذه المنهجيات، معدلة من التحقيقات السابقة، لعزل 7،8،22 والثقافة 3،10،15،23، عدوى الفيروسة الغدانية 11-13،15، والتحليل الوظيفي من الماوس الكبار cardiomyoctyes البطين. هذه النتائج بروتوكول العزلة في كا 2 +-تسامحا، منفعل العضلية التي لدينا مثقف بنجاح لمدة تصل إلى 72 ساعة وعابر مع اتش. وظيفة هذه الخلايا معزولة يمكن تقييمها باستخدام نظام التصوير MMSYS 14،24 والمشبك التصحيح، والتي ستناقش أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cardiomyocyte عزل
المواد (الشكل 1)
Microdissecting ملقط
ملقط الأنسجة
ملقط مرقئ حساسة
ملقط مرقئ
Microdissecting، مسننة، ملقط منحنية
مقص العاملة، على التوالي
مقص العاملة، منحني
15 مل أنابيب فالكون (5)
60 مم طبق بتري
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
شبكة النايلون - 400 ميكرون حجم المسام
قمع صغير
الشمع المغلفة، مضفر الحرير 4-0، 19 مم، 7-10 سم طويلة
إبرة تحت الجلد غير، نهاية حادة، 24 G أو إبرة تغذية الحيوان التجارية (24 × 1 في، W/1-1/4)
الهيبارين الصوديوم
خليط الكيتامين / زيلازين
الماصات باستور
اوبتي فيجن تشريح نظارات
نظام IonOptix MMSYS
ملاحظة: إذا زرع خلايا، انظر القسم 2 على زراعة الخلايا قبل البدء في هذا البروتوكول.
ملاحظة: تم يهتم جميع الفئران لفيمنشأة الحاجز والتضحية وفقا للوائح وافق IACUC والممارسات والإجراءات.
ملاحظة: قبل البدء في الإجراء، ينبغي مسخن النظام بأكمله للتأكد من أن جميع عناصر النظام Langendorff (الشكل 2A، الشكل 3) وتحسنت إلى 37 درجة مئوية للسماح للنشاط كولاجيناز السليم والكامل.
- حقن الفئران الكبار (~ 12 أسبوعا) مع 150 وحدة USP الهيبارين الصوديوم في الفضاء في البطن.
- تخدير مع حقنة من خليط الكيتامين / زيلازين في الوزن التي تعتمد على جرعة (الجدول 1).
- 80:12 ملغ / كغ الكيتامين: صفة زيلازين: 2.6 مل الكيتامين (100 ملغ / مل) + 0.4 مل زيلازين (100 ملغ / مل) + 37 مل PBS. النهائي: الكيتامين = 6.5 ملغ / مل؛ زيلازين = 1 ملغ / مل
- تأمين الماوس مخدرا إلى لوحة التشغيل، استئصال القلب، ووضع في طبق من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني أو المياه المالحة 0.9٪ (الشكل 1J). فيزالمالحة siologic يسمح قلب سليمة للتعاقد على قذف أفضل من الدم في غرفة وسهولة تحديد الشريان الأورطي قبل إلى الخطوة 1.6. تم فحص الفئران للتأكد من أنها هي تخدير عميق عبر فقدان أطرافهم قرصة أخمص قدميه الخلفيتين العاكسة وتباطؤ معدل التنفس قبل بداية بضع الصدر.
- استخدام اوبتي فيجن نظارات تشريح (الشكل 1A) لتحديد وفضح الشريان الأورطي. إزالة الأنسجة حول الأبهر، على الرغم من أنه لا تسهيل التصور للسفينة، وليس من الضروري لتعظيم الاستفادة من العزلة الخلية إذا جذر الأبهر واضحة للعيان.
- رئيس المضخة مع العازلة نضح (الجدول 2). ينبغي أن تعقد في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة الإجراء باستخدام تسيطر عليها، وتعميم حمام الماء (الشكل 2D).
- جبل القلب على جهاز Langendorff (الشكل 2A). باستخدام اثنين من ملقط تشريح الصغرى (أرقام 1D-E)، والعلاقات العامةIME الشريان الأورطي حول غير الحقن، إبرة حادة نهاية (24 G) مع أنبوب السيليكون في الطرف البعيد. بدلا من إبرة تغذية الحيوان التجارية (24 × 1 في، W/1-1/4) يمكن استخدامها. سوف أنبوب السيليكون على إبرة 24 G أو إبرة تغذية الحيوان تسمح لتأمين خياطة على الأخدود. وضع الشريان الأورطي على الإبرة كما جورب. (الشكل 2C).
- ملاحظة: من المهم أن تتأكد من أن نهاية الإبرة تقع في الأبهر الصاعد، من الناحية المثالية في جذر الأبهر القاصي إلى اللامسماة الحق، إلا أنه لا يمتد عبر الصمام الأبهري إلى البطين الأيسر، حيث سيؤدي ذلك بشدة تحد من قدرة المخازن المؤقتة ليروي على نحو فعال من خلال القلب عبر الشرايين التاجية.
- تأمين القلب إلى إبرة عن طريق ربط بطول صغيرة من خياطة الحرير (7-10 سم) (الشكل 1K) حول الجزء العلوي من الشريان الأورطي، وضمان أن التعادل هو على مستوى الأبهر الصاعد، دون حق اللامسماة ARTERذ، ولكن فوق نهاية الإبرة.
- خفض القلب في المناطق الداخلية من الزجاج المخروطية (الشكل 2B) للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الغرفة مناسبة.
- يروي القلب مع العازلة نضح لمدة 5 دقائق بمعدل 1 مل / دقيقة وكبح تدفق الغرفة الزجاجية للسماح للسائل الإرواء لجمع في الزجاج المخروطية والمغلف للقلب. ويرد التخطيطي للهضم القلب في الشكل 3.
- عند هذه النقطة يجب أن تشاهد حجم الزيادة القلب. بالإضافة إلى ذلك، سيتم استبدال الدم في أنسجة القلب عن طريق الإرواء، مما تسبب شحوب الأنسجة.
- الافراج عن المشبك تدفق لاستنزاف سائل الإرواء. وقف ضخ لنقل الأنابيب من الحاوية عازلة نضح إلى الحاوية عازلة انزيم (الشكل 2E). إعادة تشغيل مضخة للبدء في يروي القلب مع العازلة انزيم (الجدول 2) في 1 مل / دقيقة. المشبك تدفق مرة أخرى للسماح لانزيم المخزن المؤقت المغلف للالقلب.
- هنا، كما هو انزيم perfusing القلب وهضم النسيج الضام، فإن القلب يصبح أكثر شحوبا وسوف يقلل السلامة الهيكلية.
- لتحديد متى يتم خفض البطينين من القلب هضمها، ورفع القلب من الزجاج المخروطية، الضغط بلطف القلب مع ملقط وجمع بضع قطرات من سائل الإرواء في طبق بتري الصغيرة وتحقق لمعرفة ما إذا كان أو لم تنخفض الخلايا واحد .
- للمبتدئ فإنه من المفيد لتوصيل خط نضح مع مقياس ضغط الدم. عندما يتم الحصول على هضمها قلب الضغط سوف ينخفض بسرعة، والنسيج الضام لا يحمل المقاومة. مقياس ضغط الدم مفيد أيضا للمبتدئ لضمان أن موقف الإبرة فوق الصمام الأبهري، وليس في البطين. سوف الضغط المنخفض تشير إلى أن الإبرة في غرفة البطين وأشار أن ارتفاع ضغط إبرة تلامس صمام.
- قطع البطينين من القلب في طبقالكامل من العازلة نقل (A) (الجدول 2) عندما يبدأ الضغط البطيني إلى تراجع بشكل كبير أو عندما تكون قادرا على رؤية الخلايا واحد في الإرواء. هذا عادة ما يستغرق 7-10 دقيقة ~.
- مرة أخرى باستخدام ملقط تشريح الصغرى (الشكل 1C)، تخطر على البطينين الى قطع صغيرة لفصل. وهناك الهضم ناجحة يترك تقريبا أي أجزاء صلبة من الأنسجة بعد تنميق، مع معظم الأنسجة تصبح غير متبلور على التفكك.
- لمزيد من فصل الأنسجة، ماصة الحل في / خارج باستخدام البلاستيك ماصة باستير (الشكل 4) من الذي كان قد قطع رأس في ل~ 45 درجة زاوية. يخدم هذا التعديل لزيادة المساحة الداخلية للdiametric بالتالي غيض ماصة خفض كمية إجهاد القص على الخلايا كما هو المسحوقة الأنسجة.
- قبل تشريح الأنسجة مع ملقط فمن الممكن لفصل الغرف الفردية وحدة فصل الأذيني، البطين الأيسر أو righخلايا البطين ر.
- تأمين شبكة المربعة الشكل (1M) إلى قمع صغير (الشكل 1L) باستخدام المشابك ووضع هذا الجهاز في تصفية 15ML فالكون أنبوب (الشكل 1I).
- استخدام ماصة باستير تعديل لإزالة الحل خلية من الطبق وتحديد الحل في أنبوب فالكون.
- تسمح للخلايا الحية لتستقر في قاع الأنبوب (الترسيب الخلية الحية ينبغي أن تأخذ 2-4 دقيقة).
- قسامة 2.5ML من كل من الكالسيوم الحلول الأربعة (الجدول 3) في 4 أنابيب 15ML الصقر منفصلة.
- مرة أخرى باستخدام ماصة باستير القياسية، وإزالة بعناية بيليه الخلية من أسفل الأنبوب ونقل الخلايا إلى الأول من حلول الكالسيوم.
- تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب وكرر الخطوة 1.17 في الحلول الكالسيوم اللاحقة حتى الخلايا في الحل الأخير.
- لا تدع خلايا يستقر في fourtالحل ح الكالسيوم. غطاء الأنبوب وتحويلها على جانبها.
2. الثقافة الخلية
- قبل العزلة، لوحة 1 ميكروغرام / مل laminin الماوس الطبيعية على coverslips الزجاج واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 2٪ CO 2. تسمح أيضا الطلاء الخاص بك وسائل الإعلام والثقافة (الجدول 4) لتدفئة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 2٪ CO 2. وهذا يسمح للCO 2 الذائب في وسائل الإعلام لكي تتوازن.
- لا تقم بإزالة الجزء العلوي من وسائل الإعلام. ببساطة تخفيف الأعلى لتجنب التلوث.
- تسمح للخلايا منعزلة لتكوير في الجزء السفلي من أنبوب فالكون.
- إزالة بيليه باستخدام البلاستيك القياسية باستور ماصة وresuspend في كمية مناسبة من وسائل الاعلام الطلاء.
- لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة laminin في طبق الحجم المناسب واحتضان في 37 درجة مئوية و 2٪ CO 2 لمدة 30-60 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا التمسك لل coverslips.
- ** إذا transfecting مع اتش، تمييع الفيروس في كمية مناسبة من وسائل الاعلام الطلاء والطلاء تحل محل وسائل الإعلام في الطبق مع وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. السماح للفيروس على خلايا احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية و 2٪ CO 2. **
- إزالة وسائل الإعلام الطلاء من الطبق واستبدالها مع وسائل الإعلام والثقافة.
- تغيير بعناية سائل الإعلام والثقافة في كل يوم حتى لا تعكر صفو الخلايا على لل coverslips.
باستخدام هذا الإجراء، تم تربيتها خلايا بنجاح لمدة تصل إلى 72 ساعة. يمكن الصور من الخلايا المستزرعة وGFP transfected وجدت في الشكل 5.
3. نظام MMSYS
- السلطة نظام MMSYS ضمان أن مصباح قوس يبدأ أولا.
- توصيل أنابيب من المضخة إلى مدخل ومخارج مناسبة للغرفة MMSYS (الشكل 6).
- رئيس النظام مع العازلة الكالسيوم (B) (الجدول 2).
- وضع APPRالحجم opriately ساترة الزجاج في غرفة وربط (الشكل 6E). معظم غرف MMSYS استخدام إما 22 ملم أو 25 ملم coverslips مربع. راجع دليل المستخدم الخاص بك MMSYS لتحديد ساترة مناسبة للغرفة الخاصة بك.
- نقل 500 ميكرولتر من الحل الخلية إلى أنبوب إيبندورف الصغيرة.
- إضافة 0.5 ميكرولتر Fura2-AM (محلول المخزون من 1 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب صغير من الخلايا وتسمح لهم احتضان في الظلام في RT لمدة 5-7 دقيقة. وهذا يسمح للFura2-AM إلى "تحميل" في الخلايا من خلال نشر السلبي السريع من خلال غشاء الخلية.
- السماح للخلايا تحميل FURA-2 بيليه إلى أسفل الأنبوب، وغسل الزائد FURA مع 500 ميكرولتر من العازلة الكالسيوم B.
- إطفاء الأنوار الغرفة.
- باستخدام ماصة باستير القياسية، وانخفاض 1-2 قطرات (وفقا للتركيز الخلية) من "تحميل" حل الخلية في وسط الغرفة (الشكل 6C) وتسمح للخلايا تيس تترسب على ساترة لمدة 5 دقائق.
- يجب أن تكون كثافة الخلايا في غرفة واحدة من هذا القبيل أن الخلايا غير متداخلة ويمكن الاطلاع بسهولة في منصة MMSYS الحصول على البيانات.
- تبدأ بعناية لتدفق العازلة الكالسيوم (B) من خلال الغرفة.
- زيادة درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية.
- هام: لا تشغيل جهاز التدفئة حتى شرع التدفق. وهذا يمكن أن يلحق ضررا شديدا thermocoupler ردود الفعل (الشكل 6A).
- تأكد من أن يتم توصيل الدائرة إلى MyoPacer عبر أسلاك الاتصال (الشكل 6B) وتبدأ وتيرة الخلايا 5 هرتز في 1.5X عتبة سرعة للخلايا.
- اختيار الخلية التي يتم الضرب على التردد الصحيح ونقله إلى الفتحة تأطير.
- ضبط الكاميرا وتأطير أبعاد الفتحة بحيث الخلية بأكملها في وسط النافذة، توجه أفقيا، مع أب sarcomeresالأصل.
- لطول ضبط خلية الحمراء والخضراء (اليمين واليسار) مؤشرات الثنائي الضوئي إلى حافة الخلية. ضبط التباين لتحسين التباين أسود / أبيض على حواف الخلية. الرجوع إلى دليل Ionoptix لمزيد من التفاصيل.
- وضع مربع في منطقة من الخلية التي تحتوي sarcomeres واضحة المعالم وضبط التركيز لتحسين ذروة طيف الطاقة (الحمراء). أيضا ضبط سطوع المجهر لتحسين تجانس نافذة زرقاء وسوداء على النقيض من المعلومات.
- ضبط أشرطة عتبة الأخضر لالتقاط أكبر قدر من طيف الطاقة الحمراء (الذروة) والخلفية أقل قدر ممكن.
- بدء التسجيل.
- بعد أن تم تسجيل البيانات بما فيه الكفاية، انقر على زر "إيقاف مؤقت" لإيقاف التسجيل مؤقتا، وضمان أن أيا من التركيز ولا أبعاد نافذة عرض يتم تغيير أو نقل مرحلة المجهر لمساحة ساترة التي لم الخلايا أو المواد الخلوية يمكن أن يكون رأيت. ليونGTH تسجيل يختلف اعتمادا على بروتوكول التجريبية المحقق.
- ملاحظة: النقر على "إيقاف" سيتم إنهاء تسجيل وسوف لا تكون قادرة على خلفية أن تسجل لتلك الخلية.
- انقر على "السيرة الذاتية" لتسجيل القياس الخلفية.
- بعد أن تم تسجيل ما يكفي الخلفية انقر على زر "إيقاف" لإنهاء التسجيل.
- انقر فوق "ملف حفظ" لحفظ كل آثار لتلك الخلية في واحد. ملف ZPT.
- كرر الخطوات 3،12-3،20 حتى تم تسجيل ما يكفي من الخلايا.
- الرجوع إلى دليل المستخدم IonOptix-12 MMSYS حصول على تعليمات حول تحليل البيانات المسجلة. وتظهر البيانات المسجلة سمة من النوع البري العضلية في في الشكل 7.
4. المشبك التصحيح
التصحيح لقط من أنواع مختلفة من الخلايا وصفت جيدا من قبل في هذه المجلة 25-28. لذا علينا أن نركز على بعض منتقديالمعلمات القاعدة في لقط التصحيح الناجح العضلية الكبار معزولة باستخدام بروتوكول لدينا وصفها.
- باستخدام ماصة ساحبة والزجاج البورسليكات (مع خيوط: OD 1.5 ملم، 0.86 ملم معرف - 10 سم طول) سحب ماصة التي يسلك ~ 2.0-3.0 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الجدول 5).
- النار تلميع غيض ماصة بلطف باستخدام Narishige أو غيرها من الملمع النار الرأسي. وينبغي أن تكون مقاومة ماصة التصحيح 2-4 MO بعد تلميع النار.
- بدوره على جهاز الكمبيوتر، مكبر للصوت (Axopatch 200B)، وتحويل م (Digidata 1440A، أكسون صكوك) ومياداة مجهرية (MP-285). للقط التصحيح خلية كاملة، ونحن نبدأ مع معلمات القياسية كما هو موضح سابقا.
- للبالغين مثقف مضادة، بإزالتها من الحاضنة وغسل بلطف ساترة التي ومطلي اتفاقية الأنواع المهاجرة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
- بلطف إزالة ساترة ووضعه في غرفة نضح على المجهر المقلوب (نيكون TE 2000).
- تأكد من أن مدخل لنظام نضح ومخرج (شفط) هي فقط فوق سطح ساترة.
- بدء perfusing مع الحل خارج الخلوي المناسبة (الجدول 5).
- للبالغين فصلها حديثا مضادة، ضع ساترة المغلفة الكولاجين في نظام نضح على النحو الوارد أعلاه.
- منذ الخلايا ستكون في الحل، استبدال بلطف حل مع العازلة خارج الخلية.
- باستخدام ماصة باستير تعديل (الشكل 4)، resuspend بلطف الخلايا في المنطقة العازلة خارج الخلية، واتخاذ قسامة ووضعه على ساترة.
- السماح للخلايا إرفاق لمدة 10-15 دقيقة قبل بدء نضح كما في 4.4.
- الخلفية ملء ماصة التصحيح خلية كاملة مع العازلة داخل الخلوية باستخدام Microfil (الآلات الدقيقة العالمي، 28 G) الإبرة. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في غيض من ماصة؛ اضغط بلطف إلى السماح للفقاعات الهواء لتطفو الى المعالم من الحل.
- إرفاق ماصة التصحيح شغل إلى حامل ماصة، وضمان أن هناك اتصال بين مسرى مكروي والحل الداخلي.
- نستخدم الفضة أقطاب كلوريد، ولكن الاعتناء 'chloriding' أسلاك الفضة على الأقل مرة واحدة في الأسبوع بغمر بين عشية وضحاها في التبييض المنزلية.
- خفض بلطف ماصة في الحمام، وضمان أن يتم مغمورة القطب حمام في كل الأوقات في الحمام / حل خارج الخلوي. تعويض أي إمكانات تقاطع السائلة في هذا الوقت. قد تكون إمكانات كبيرة تقاطع علامة على تدهور كلوريد الفضة على الأقطاب.
- ويتم تحديد الكبار أسطواني صحية مضادة في المجهر، وتركزت في مجال الرؤية. كما هو موضح سابقا، وهو مزيج من تحريك مياداة مجهرية وضبط التركيز يسمح مقربة من ماصة التصحيح وسطح سم.
- مرة واحدة هم في نفس المستوى البؤري، ونحن نستخدم مزيج من البصريةسعودة الخلية واختبار النبض (متوفرة في Axopatch 200B).
- مرة واحدة مقاومة ماصة يقلل إلى النصف (مما يدل على أن ماصة على اتصال مع سطح الخلية)، ويستمر الخلية للبحث أسطواني، ونحن إنشاء ختم gigaohm باستخدام الشفط لطيف.
- لمضادة، ونحن نفضل الفم الشفط لإنشاء الضغط السلبي. إذا تم الحصول على gigaseal بنجاح، ونحن مرة أخرى استخدام طيف الإيقاعي شفط الفم ل"في كسر" إلى الخلية لإقامة كله وضع التصحيح الخلية.
- إمكانات يستريح صحية نموذجية من مضادة هي بالترتيب من -85 إلى -90 بالسيارات. مرة واحدة يتم الحصول على gigaseal، وقياس إمكانات غشاء يستريح باستخدام المشبك الحالية مع I = 0 السلطة الفلسطينية.
- إذا تم استقطابها إمكانات غشاء يستريح هذا يمكن أن تشير إلى وجود خلية التالفة أو ختم الفقراء.
- لأن مضادة هي خلايا كبيرة مع الكثير من مساحة السطح، وتحتاج إلى اهتمام دقيق لدفعها إلى السعة التعويض، خصوصا ثالدجاجة تفعيل بسرعة التيارات مثل قناة الصوديوم يحتاج إلى دراسة. إذا لم يمكن الحصول على تعويض السعة الكافية باستخدام المدمج في إعدادات تعويض على مولد النبض، prepulses في شبه عتبة الجهد، وربما يكون العكس قطبية ليتم تطبيقها والحالية الناتجة تطرح من الإشارات المسجلة. وتمت برمجة هذا البروتوكول بسهولة في Axopatch.
- مرة واحدة وقد أنشئت كله وضع التصحيح الخلية، وانتظر 15 دقيقة للسماح للموازنة وضمان استقرار الختم قبل بداية الجهد أو بروتوكولات المشبك الحالي. نستخدم البروتوكولات القياسية التي تم وصفها سابقا في هذه المجلات وغيرها من ولن يتم بلورتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزلة النتائج cardiomyoctyes الكبار في الخلايا على شكل قضيب، مخططة، وهادئة (لا ضرب عفويا) (الشكل 5A). والخلايا الميتة تبدو مدورة وسوف لا تكون موجودة التصدعات. خلايا هادئة يمكن أن يكون مثقف وtransfected مع اتش للتلاعب التعبير الجيني (أرقام 5B و5C). بعد 24 ساعة من الثقافة، لا يغير من التشكل من الخلايا الحية، فإنها لا تزال كا 2 +-تسامحا، ويمكن الخطى من قبل التحفيز المجال. مع الإجراء المقترح، يمكن تحقيق عائد من خلايا قابلة للحياة 80-90٪.
لقياس انقباض الخلية، وبرنامج نظام MMSYS يأخذ المعلومات من المرحلة المجهر أن يقدم إما التغييرات في قسيم عضلي أو طول الخلية. هو مبين في (الشكل 7A) هو أثر انقباض ممثل عن طريق قياس طول قسيم عضلي من نوع البرية C57BL6 الماوس. لصحية myocytes الماوس الكبار منالفئران حد ذاتها، وطول قسيم عضلي الأساس هو ~ 1،7-1،9 ميكرومتر. برنامج نظام MMSYS قادر على قياس انقباض في وقت واحد والتعامل مع الكالسيوم عن طريق قياس نسبة منضمة إلى أشكال غير منضم للتنشيط الكالسيوم صبغ Fura2-AM. بينما قد تختلف التدابير نسبة قليلا بين الاجهزة، لالخلايا السليمة، وهذه النسبة عادة بين 1.5-2.5 (الشكل 7B). إذا كان قد تم معايرة نظام MMSYS للكالسيوم، ويمكن بعد ذلك أن تترجم هذه النسبة إلى قياس المطلق للتركيز الكالسيوم داخل الخلايا. من أجل تحليل البيانات التي يتم إنشاؤها من انقباض والكالسيوم آثار، يجب أن متوسط آثار لإنشاء تتبع مميزة لتلك الخلية (أرقام 7C و 7D). تلك آثار المميزة تخضع لخوارزمية تحليل البيانات monotransient من برنامج نظام MMSYS الذي يولد ثم المعلمات من أجل وظيفة الانقباضي والانبساطي ذلك الحين. مزيد من التفاصيل موجودة في ايوندليل OPTIX.
كانت العضلية الماوس الكبار أيضا تخضع لتجارب كاملة المشبك التصحيح الخلية التي تم تسجيلها في إمكانات العمل في وضع المشبك الحالية (الشكل 8).
| وزن الجسم (ز) | الكيتامين / زيلازين (مل) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0.37 |
| 35 | 0.43 |
| 40 | 0.49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0.62 |
الجدول 1. الكبار ماوس الوزن التي تعتمد على الكيتامين / زيلازين الجرعة (80:12).
| حل | وصفة |
| تايرود العازلة * (الرقم الهيدروجيني 7.4) | 1 L ده 2 O 137 ملي مول كلوريد الصوديوم 4 ملي بوكل 1 ملي MgCl 10 ملي HEPES 0.33 ملي ناه 2 ص 4 |
| نضح العازلة * (الرقم الهيدروجيني 7.4) | 500 مل تايرود العازلة 10 ملي D-(+)-الجلوكوز، والحد الأدنى 5 ملي توراين 10 ملي Butanedione Monoxime (BDM) |
| انزيم العازلة * | 50 مل الإرواء العازلة 0.024 ز كولاجيناز D (النوع الرابع) 0.018 ز كولاجيناز B (النوع الثاني) 0.003 ز البروتياز الرابع عشر من المتسلسلة غريسيوس |
| نقل العازلة (A) | 45 مل الإرواء العازلة 5 مل ألبومين المصل البقري (5 ملغ من حل / الأسهم مل) |
| الكالسيوم المخزن المؤقت (B) | 1 L تايرود العازلة 1.2 مم CaCl 5.5 ملي D-(+)-الجلوكوز، والحد الأدنى |
الجدول 2. Cardiomyocyte الكبار وصفات العزلة العازلة.
| [و CaCl] | نقل العازلة (A) | الكالسيوم المخزن المؤقت (B) |
| 0.06 ملي كا 2 + | 9.5 مل | 0.5 مل |
| 0.24 ملي كا 2 + | 8.0 مل | 2.0 مل |
| 0.60 ملي كا 2 + | 5.0 مل | 5.0 مل |
| 1.20 ملي كا 2 + | 0 مل | 10 مل |
3.Calcium المعايرة الحل صفات الجدول.
| طلي متوسطة | ثقافة متوسطة |
|
|
الجدول 4. الطلاء والثقافة وصفات وسائل الإعلام.
| ماصة الحل | الحل حمام |
|
|
الجدول 5. التصحيح المشبك حلول (حلول المعروضة هي لقياس التيارات الصوديوم).
الشكل 1. . أدوات العزلة cardiomyocyte الكبار A) OptiVisor الزجاج البصري المكبر مجهر B) ملقط الأنسجة، 5.5 في والأسنان 1X2 - Roboz العلمية C) ملقط مولوني - 4.5 في (11.5 سم) منحنى طفيف طويلة، مسننة - Roboz العلمية DE) دومون # 3 الملقط، Dumostar، حجم غيض 0.17 × 0.10 ملم. F) باكر Mosquito الملقط 5 في شقة مستقيم -. Roboz العلمي G) مايكرو تشريح مقص 4.5 في منحني شارب / شارب - Roboz العلمية H) مايكرو تشريح مقص 3.5 في مستقيم شارب / شارب 20 ملم - Roboz العلمي الأول) 15 مل فالكون أنبوب - الحرارية -J فيشر العلمية) 60MM طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني K) Softsilk: الشمع المغلفة الحرير مضفر، 19 مم - كوفيديان L) قمع بلاستيك، 6.0 سم القطر M) شبكة نايلون - 400μm حجم المسام...
الشكل 2. Langendorff جهاز. A) وكامل نظام نضح Langendorff تستخدم لعزل cardiomyocyte الكبار. B) عرض الموسع من جوفاء، المخروطية قمع جمع الزجاجية المستخدمة لتدفئة القلب. C) مقنى الرأي الموسع من الإبرة تحت الجلد غير القسطرة. (Feedin القابلة لإعادة الاستخدامز إبر (24 G، على التوالي، قمة الجولة، 25 مم طويل؛ أدوات العلوم الجميلة شركة المدينة 18061-24). D) تداول حمام مائي E) حمام المياه لاحتضان التروية، انزيم ونقل مخازن.
الرقم 3. A تخطيطي مفصل للنظام الارواء.
الشكل 4. تعديل باستور ماصة. تم تعديل ماصة عن طريق قطع من غيض في لما يقرب من 45 درجة زاوية. وهذا يسمح لمساحة أكبر ويخلق أقل إجهاد القص على الخلايا كما يتم فصل فيها. يظهر أقحم وجهة نظر أقرب من طرف تعديلها.
الرقم 5. العضلية مثقف وGFP transfected ألف) طازجة isolat العضلية الكبار إد من الماوس C57BL6 من 12 أسبوعا. تشير الأسهم إلى الخلايا الميتة أو التي تحتضر. هذه الخلايا هي أكثر تنوعا من الأصحاء، على شكل قضيب الكبار مضادة. B) cardiomyoctyes الماوس الكبار transfected GFP بعد 24 ساعة من الثقافة. C) مثقف العضلية الماوس الكبار بعد 24 ساعة. يظهر أقحم التكبير من زيادة myocytes مثقف.
الرقم 6. . غرفة نظام MMSYS الأسهم الزرقاء تمثل تدفق العازلة نضح (الاحتياطي B) A) واحدة، في خط سخان الحل -. ارنر الصك شركة B) توصيل الأسلاك من غرفة إلى نظام MMSYS مشجعا مجال MyoPacer C) البلاتينية المشابك الأقطاب الكهربائية لتحفيز الحقل يقع في وسط الغرفة. D) خزان التدفق. E) غرفة في موقف فتح.
الرقم 7. سجلت بيانات النظام MMSYS ممثل لنوع البرية الفئران C57BL6 تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون. أ) آثار قاعدة MMSYS انقباض. B) نسبة كا 2 + ملزمة لكا 2 +-المسجلة غير منضم Fura2-AM لتوليد آثار قاعدة الكالسيوم. هذه آثار تتوافق مع قياسات انقباض في A). C) وبلغ متوسط آثار قاعدة انقباض جمعتها برنامج نظام MMSYS إلى انقباض التتبع مميزة. D) تتبع الكالسيوم المميزة التي تم تجميعها من آثار قاعدة في B). وتحليل آثار مركب تسمح للباحث لتوليد المعلمات البديلات من أجل وظيفة الانقباضي والانبساطي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 8. المشبك التصحيح التتبع تبين إمكانات العمل من النوع البري الماوس الكبار cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، وصفناها التقنيات اللازمة لعزل ناجحة وثقافة الكبار مضادة من القلب الماوس. أسلوبنا يسمح لدراسة لاحقة من وظيفة CM واستثارة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. المعلمة الحرجة لدراسة وظيفة من الكبار مضادة هي الصحة ونوعية مضادة معزولة. كما هو موضح أعلاه، لدينا تقنيات تسمح لارتفاع العائد من الخلايا الوظيفية التي هي قابلة للتلاعب في التعبير الجيني باستخدام / عدوى lentiviral الغدانية في الثقافة، وتحليل استثارة الخلوية وظيفة مقلص.
واحدة من أهم المعايير لعزل وظيفية الماوس الكبار مضادة غير دقيقة والقسطرة السريع للقلب على إبرة تحت الجلد غير. يجب ضمان أن الرعاية الشريان الأورطي تعلق على البطين الأيسر يتم تشريح لمدة كافية للسماح القسطرة السريع أسهل وأكثر من القلب. عندما cannulating رانه القلب، فمن الضروري أيضا أن رأس الإبرة لا تزال في الأبهر الصاعد ولا يمتد الماضية صمام الأبهر إلى البطين الأيسر للسماح لنضح كفاءة الأنسجة عن طريق الشرايين التاجية. الخطوة الحاسمة التالية التي يتم فيها تأمين الشريان الأورطي إلى الجذعية من الإبرة باستخدام الخيط الحرير. يجب أن يتم ربط الخيط على الأبهر الصاعد، بحيث يتدفق العازلة نضح retrogradely في الشرايين التاجية وتجويف البطين الأيسر ولكن لا تتدفق من خلال antegradely نهاية البعيدة من الشريان الأورطي تشريح أو الأوعية الدموية الكبرى.
بعض المحققين تجد أنه من المفيد لاقامة قياس الضغط لتقييم جودة القسطرة ونضح لاحقة من الانزيم. عند استخدام مقياس الضغط، يجب أن يكون ضغط البطين الأيسر الأولية ~ 80-100 CMH 2 O، وعلى نضح مع الانزيم، فإن الضغط ينخفض إلى ~ 40-50 CMH 2 O. عندما يصل الضغط البطيني هذه النقطة، فمنالأكثر استعداد ليكون لا بد من تخفيض من الإبرة احتمالا. لضمان أن البطينين يتم هضمها جيدا، وبضع قطرات من التدفق من خلال يمكن جمعها من تحت القلب في طبق بتري وفحصها لمعرفة ما إذا وجدت، الخلايا الحية هادئة موجودة.
مما أدى خلايا معزولة من هذا الإجراء تقديم أنفسهم بشكل جيد لكيمياء سيتولوجية مناعية. يمكن ان تكون ثابتة باستخدام أساليب التلاعب العادية 29 (أي الفورمالين، امتصاص العرق، والميثانول الجليد الباردة أو الأسيتون)، ولكن عادة ما تستخدم على مستوى أعلى من permeabilization من لcardiomyoctyes حديثي الولادة وهناك حاجة في بعض الأحيان إلى الصورة البروتينات عصاري خلوي أو هياكل البروتين (أي ألفا الأكتين الساركومير، بيتا الميوسين). أخيرا، فإن الخلايا يمكن تربيتها في وقت لاحق والمصابين الغدة أو lentiviruses للتلاعب التعبير الجيني، أو استخدامها للتحليلات الفنية التابعة للجهاز مقلص الخلوية.
منذ فترة طويلة وصفت ثقافة الماوس الكبار مضادة كماالتحدي. باستخدام التقنيات الموضحة هنا، يمكننا الثقافة بشكل روتيني هذه الخلايا لمدة تصل إلى 72 ساعة، على الرغم من أن العائد من خلايا وظيفية النقصان بشكل ملحوظ بعد 36 ساعة. عندما زرع الخلايا، لا بد من أن الخلايا تكون مطلية عند 37 درجة مئوية في 2٪ CO 2. وهذا يختلف من حديثي الولادة مضادة، والتي يفضل أن تربيتها في 10٪ CO 2 للساعة 24 أولا ثم تحولت إلى 5٪ CO 2، أو الخلايا الليفية القلب حديثي الولادة، والتي تفضل أيضا 5٪ CO 2. الطلاء والثقافة وسائل الإعلام يمكن معايرتها بحيث حلت CO 2 هو 2٪.
ومطلي الخلايا المغلفة coverslips على laminin بحيث لا يقلع من الزجاج عند تغيير وسائل الإعلام. ومع ذلك، فإن العضلية لا نعلق آمن جدا على الزجاج حتى مع طلاء laminin. ولذلك فمن المهم جدا أن الحذر يجب اتخاذها عند تغيير ثقافة وسائل الإعلام، وذلك باستخدام ماصات معقمة، وليس نظام الشفط. مرة واحدة الخليةومطلي ق، ويمكن transfected مع اتش التي يحتضنها الفيروس لمدة لا تزيد عن 2 ساعة. توقيت يعتمد على عيار الفيروس وبروتين يجري الإفراط في المعبر عنها، ولذا فإننا نوصي بإجراء التجارب الأولية لتحديد LD 50 و 50 ED للفيروس. في معظم الحالات، ونحن نستخدم وزارة الداخلية من 20-100 لاتش. مرة واحدة تم تحضين الخلايا مع الفيروس، والتعبير عن الجينات المستهدفة (ق) وعادة ما يستغرق 24-36 ساعة ~.
ويمكن أيضا أن الخلايا المعزولة ومطلي coverslips على ذات حجم مناسب لغرفة نظام MMSYS يتم تحليلها لانقباض والمناولة الكالسيوم باستخدام نظام التصوير MMSYS. هذه coverslips يمكن وضعها مباشرة في غرفة، ويمكن إزالة مستنبت عن طريق تشغيل نظام الارواء. إذا كانت الخلايا غير المستزرعة ويتم استخدامها لتحليل مباشرة بعد العزلة، فإنها يمكن أن تضاف مباشرة إلى غرفة أخرى وضعت ساترة. في حينفإنه ليس من الضروري لمرحلة ما قبل معطف لل coverslips مع laminin عند تحليل الخلايا المعزولة حديثا، في تجربتنا، laminin لا يساعد الخلايا التمسك أفضل لساترة. باستخدام معدل تدفق بطيء للوحدة MMSYS بالإضافة إلى ذلك يضمن أن الخلايا تظل تعلق على ساترة. أخيرا، والبصريات المجهر، وخاصة عدسة الهدف يجب تنظيفها بدقة قبل كل تجربة، للسماح التصور الدقيق للsarcomeres اللازمة لتقييم انقباض.
العنصر الأكثر أهمية في النظام MMSYS هو واحد سخان السوائل في الخط الذي تسخن العازلة نضح (B) كما يصب في الغرفة. تم تصميم عنصر حرارة من هذه قطعة من المعدات لتبادل الحرارة مع مرور السوائل عن طريق نقل الحرارة الحمل الحراري، لذلك إذا تدفق غائب، فإن مبادل الحرارة الزائدة ويمكن ان يلحق الضرر لا يمكن إصلاحه النظام. ولذلك فمن الضروري أن يتم تشغيل سخان على فقط بعد بدء تدفق.
وسائل أخرى للتحليل جهاز مقلص من الكبار العضلية وقد وصفت سابقا، بما في ذلك أساليب متطورة باستخدام القوة الذرية المجهري 30-32. بعض من هذه الأساليب تسمح لقياس أكثر تطورا من المترجمة قوة مقلص وخصائص مثل معامل يونغ، مما يجعلها أكثر ملاءمة لقياس خلايا غير منتظمة الشكل أو الخلايا دون الساركومير أنظمة محددة بوضوح مثل مضادة المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة. ويمكن لهذه التقنيات أن تكون بنفس السهولة المستخدمة في الكبار معزولة مضادة. الاستفادة من نظام MMSYS هو السهولة النسبية لقياس انقباض والقدرة على قياس عدد كبير من الخلايا في فترة قصيرة من الزمن في الخلايا مع sarcomeres محددة بوضوح. بالإضافة إلى ذلك، نظم ينة حافة وتحليل قسيم عضلي التي يمكن قياس طول الخلية أو طول بين sarcomeres تسمح التوالي لمدة مختلفة (ولكن صبالغبطة) وسائل لقياس انقباض. برنامج الحصول على البيانات جنبا إلى جنب مع متقدمة، برامج التحليل سهلة الاستخدام يجعل من هذا النظام سهلة التعلم والاستخدام. أخيرا، القدرة على قياس ديناميات الكالسيوم في وقت واحد يسمح للعلاقة بين انقباض والكالسيوم، وهي ليست مجدية مع القوة الذرية المجهر. أيضا، لأن إخراج البيانات هو مقياس ratiometric من صبغة تنشيط الكالسيوم (Fura2-AM)، مع المعايرة الصحيحة، يمكن جمعها التدابير المطلق للتركيزات الكالسيوم الداخلية.
نجاح تسجيل إشارات القناة الايونية من الكبار العضلية يتطلب الخلايا تكون في حالة مثلى. على الفور بعد عزل وطلاء الخلايا أنها ليست ملتصقة وسوف تطفو في حل، وفي هذه المرحلة لا يمكن دراستها. في غضون ساعات قليلة أنها سوف تلتزم ساترة المغلفة وكان في هذه النقطة التي قد تكون دراستها. في تجربتنا الترقيع في غضون ساعات قليلة منالطلاء تعطي نتيجة مثلى، كما ينتظر وقتا طويلا يؤثر سلبا على الخلايا. كما هو موضح أعلاه، واختبار إمكانات غشاء يستريح بعد إنشاء ختم gigaohm وكسر في الخلية، وكذلك القدرة على إنشاء ختم gigaohm نفسها نوعان من المعلمات التي تعكس مدى صحة الخلايا هي في وقت التصحيح. في حين أنه من الأسهل أن التصحيح على الخلايا التي لم يتم التعاقد، وهذا ليس شرطا مسبقا، ويمكن الحصول عليها أختام الكافية على ضرب الخلايا كذلك. البروتوكولات المستخدمة في هذه المرحلة تعتمد على أهداف الدراسة لقط التصحيح، واستخدام تقنيات المشبك الحالية، يمكن تسجيل إمكانات العمل العفوي أو المتعمد. بدلا من ذلك، والجهد لقط يمكن استخدامها لدراسة القنوات الأيونية محددة. بالنظر إلى غطاء واق من القنوات في الغشاء، وعادة ما يقوم هذه التسجيلات في وجود حاصرات القناة الايونية. سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX)، وغالبا ما تستخدم nisoldipine، والسيزيوم لمنع قنوات الصوديوم والكالسيوم والبوتاسيوم على التوالي، althouغ استخدمت مجموعة متنوعة من الأدوية، ونشرت تفاصيل استخدامها على نطاق واسع. معظم النهج تنطوي إما تسجيل التيارات قبل وبعد تطبيق حاصرات القناة الايونية وطرح التيارات، و / أو حجب القنوات الخلفية مع حاصرات المناسبة قبل التسجيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
