Summary
Her beskrives isoleringen af voksne mus cardiomyoctyes bruger Langendorff perfusion system. De resulterende celler er Ca2 +-tolerante elektrisk hvilende og kan dyrkes og transficeres med adeno-eller lentivirus at manipulere genekspression. Deres funktionalitet kan også analyseres ved hjælp af MMSYS systemet og patch clamp teknikker.
Abstract
Brugen af primære cardiomyocytes (CMS) i kultur har givet et stærkt supplement til murine modeller af hjertesygdomme i at fremme vores forståelse af hjertesygdom. Især har evnen til at studere ionhomeostase, ionkanalfunktion, cellulær ophidselse og excitation-kontraktion kobling og deres ændringer i syge forhold og ved sygdomsfremkaldende mutationer ført til betydelige indsigt i hjertesygdomme. Desuden har manglen på en passende udødeliggjort cellelinje til at efterligne voksne CMS og begrænsningerne i neonatal CMS (som mangler mange af de strukturelle og funktionelle biomekanik karakteristisk for voksen CMS) i kultur hæmmet vores forståelse af det komplekse samspil mellem signalveje, ionkanaler og kontraktile egenskaber i den voksne hjerte styrke vigtigheden af at undersøge voksne isolerede cardiomyocytes. Her præsenterer vi metoder til isolering, kultur, manipulation af genekspression ved adenovirus-EXPREssed proteiner og efterfølgende funktionel analyse af kardiomyocytter fra den voksne mus. Brugen af disse teknikker vil bidrage til at udvikle mekanistisk indsigt i signalveje, der regulerer cellulær ophidselse, Ca 2 + dynamik og kontraktilitet og give en langt mere fysiologisk relevant karakterisering af hjertekarsygdomme.
Introduction
Murine modeller af hjerte-kar-sygdom har tjent som effektive værktøjer til afdækning grundlæggende sygdomsmekanismer 1,2 samt for at identificere potentielle terapeutiske mål 1,3. Især har brugen af både murine modeller af erhvervet hjertesygdom (såsom tryk-overload) 4,5 og transgene musemodeller avancerede vores forståelse af hjertesygdom 6-8. Anvendelsen af cellekulturteknikker at studere signalleringskaskader 3,9,10 og ændringer i de enkelte proteiner, der ligger til grund for cellulær excitabilitet og excitation-kontraktion kobling i hjertet 11-13 på niveau med enkelt celle har suppleret in vivo musemodeller. Imidlertid har manglen på passende cellelinjer, der afspejler voksen CM struktur og funktion været en betydelig begrænsning. Forskere har forsøgt at løse dette ved at studere individuelle proteiner, såsom ionkanaler i heterologe ekspressionssystemer
Primære neonatale rotte ventrikulære cardiomyocytter (NRVMs), er forholdsvis let at kulturen kan være inficeret med adenovirus og lentivirus at manipulere genekspression 15, ennd har derfor været anvendt med succes 1, men har begrænsninger af deres egne. Selv om de giver en fysiologisk mikromiljø 1 og har været arbejdshest af signalsystemet feltet væsentlige forskelle mellem morfologi og subcellulære organisering af NRVMs og voksne cardiomyoctyes gør dem en utilstrækkelig model for undersøgelse af ioniske strømme og excitation-kontraktion kobling i den voksne hjerte . Mest bemærkelsesværdigt NRVMs mangler en endelig t-rørformet delsystem 4. Da Ca 2 + flux og dynamik er kritisk afhængige af moden t-rørformet og sarcoplasmic reticulum (SR) struktur 6, Ca 2 + dynamik og funktionelle studier af hjertets kontraktilitet i NRVMs er ikke en nøjagtig afspejling af disse kritiske processer i voksne cardiomyocytes. Yderligere nogle komponenter i signalveje varierer mellem neonatale og voksne mus 9, hvilket giver en anden begrænsning for at studere sygdomsprocesser og deres iVIRKNING på cellulær ophidselse og kontraktilitet i NRVMs. Endelig fordelingen af kontraktile maskiner fører til flerstrenget og uensartet celle afkortning begrænser nøjagtigheden af kontraktile målinger.
Brugen af isolerede voksne cardiomyocytes giver derfor et mere præcist in vitro modellering system. Den ekstraordinære stigning i viden muliggjort af genetisk manipulation af mus understreger betydningen af at opnå funktionelle isolerede kardiomyocytter fra mus. Faktisk har karakterisering af voksne CMS isoleret fra musemodeller kaste lys over mange biologiske og patologiske begivenheder. Isolerede CMS transgene musemodeller har tilladt for undersøgelser af gevinst eller tab af funktion af proteiner på kontraktile egenskaber af enkeltceller 2,16, og levedygtigheden i sygdomsmodeller såsom iskæmi / reperfusion 17,18 og dermed supplere oplysninger fra de i vivo undersøgelser afSE mus. Brug af isolerede voksen CMS fra murine modeller af erhvervet hjertesygdom 3,19,20 (såsom tværgående pulsåresammensnøring-induceret pres overbelastning, der efterligner hypertension eller aortaklappen stenose) eller motion 5,21 (til modellering fysiologisk hypertrofi) giver mulighed for undersøgelse af samspillet mellem signaleringskaskader impliceret i disse processer med cellulær excitabilitet og excitation-kontraktion kobling ved niveauet for den enkelt celle. Endvidere evnen til at manipulere genekspressionen ved hjælp adenoviral drevet genekspression i voksen CMS giver os mulighed for at dissekere komponenterne i komplekse signaleringsveje.
Fra et elektrofysiologisk perspektiv har hel-celle spænding og strøm clamp eksperimenter på isolerede voksen CMS været afgørende at belyse karakteren af ioniske flux ved baseline og i forskellige sygdomstilstande. På grund af den komplekse struktur af den cellulære membran og forskellen protei stilladser strukturer mellem voksen CMS og NRVMs eller heterologe cellelinjer, evnen til at lappe voksne celler giver en meget bedre repræsentation af virkningerne af visse membranproteiner, strukturelle proteiner og ionkanal-interagerende partnere på de elektrofysiologiske komponenter af den voksne hjerte.
Trods sådanne fremtrædende fordele i at studere voksne murine cardiomyocytes, isolere og dyrkning af voksne mus cardiomyocytes har været en udfordring, opfordrer behovet for en systematisk og præcis beskrivelse af metoden til at isolere levedygtige mus cardiomyocytter og at fastholde dem i kultur at tillade yderligere genetisk manipulation ved hjælp af viral vektorer. Tidligere undersøgelser har brugt enten akut isoleret mus voksen CMS eller kulturperler rotte voksen CMS. Sidstnævnte er lettere at kultur end voksen mus CMS, og de fleste eksperimenter manipulere genekspression in vitro har anvendt rotte voksen CMS. Få studier har med succes ændret og undersøgt functiOnal genekspression i mus voksen CMS, præsentere en stor begrænsning i omfanget af eksperimenter. Derfor, her præsenterer vi i detaljer sådanne metoder, modificeret fra tidligere undersøgelser, til isolering 7,8,22, kultur 3,10,15,23, adenovirusinfektion 11-13,15, og funktionel analyse af voksen mus ventrikulære cardiomyoctyes. Denne isolation protokol resultater i Ca 2 +-tolerante, overgearet cardiomyocytter, som vi har med held dyrkes i op til 72 timer og kortvarigt transficeret med adenovirus. Funktionaliteten af disse isolerede celler kan vurderes ved hjælp af MMSYS imaging system 14,24 og patch clamp, som også vil blive drøftet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cardiomyocyte Isolation
Materialer (Figur 1)
Microdissecting pincet
Tissue pincet
Sarte hæmostatiske pincet
Hæmostatiske pincet
Microdissecting, savtakkede, buede pincet
Operating saks, lige
Operating saks, buet
15 ml Falcon-rør (5)
60 mm petriskål
Phosphatbufret saltvand (PBS)
Nylon Mesh - 400 um porestørrelse
Lille tragt
Voks overtrukket, flettet silke 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Ikke-kanyle, stumpe ende, 24 G eller kommerciel dyr fodring nål (24 x 1 i, W/1-1/4)
Heparin natrium
Ketamin / xylazin blanding
Pasteur-pipetter
OptiVision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS-system
Bemærk: Hvis dyrkning af celler, se afsnit 2 om cellekultur, før du begynder denne protokol.
Bemærk: Alle mus blev passet ien barriere facilitet og ofret i henhold til godkendte IACUC regler, praksis og procedurer.
Bemærk: Før du begynder proceduren, skal hele systemet forvarmes for at sikre, at alle elementer i Langendorff systemet (figur 2A, figur 3) er opvarmet til 37 ° C for at give mulighed for en ordentlig og fuldstændig collagenaseaktivitet.
- Sprøjt voksne mus (~ 12 uger) med 150 USP enheder heparin natrium i den abdominale rum.
- Bedøver med en injektion af en ketamin / xylazin blanding ved en vægtafhængig dosis (tabel 1).
- 80:12 mg / kg ketamin: xylazin opskrift: 2,6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0,4 ml xylazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Final: ketamin = 6,5 mg / ml xylazin = 1 mg / ml
- Fastgør bedøvet mus til operativsystemet pad, udskære hjerte, og anbringes i en skål af stuetemperatur PBS eller 0,9% saltvand (figur 1J). Physiologic saltvand tillader intakte hjertet til at trække bedre ekstrudering af blod i kammeret og nem identifikation af aorta før trin 1.6. Mus blev kontrolleret for at sikre, at de er dybt bedøvet via tab af bagben tå knivspids refleks og opbremsning af respirationsfrekvens forud for debut af torakotomi.
- Brug OptiVision dissekere beskyttelsesbriller (figur 1a) at identificere og eksponere aorta. Fjernelse af væv rundt om aorta, selvom det lette visualisering af fartøjet, er ikke nødvendig for optimering af celleisolering hvis aortaroden er klart synlig.
- Prime pumpen med perfusionsbuffer (tabel 2). Temperaturen bør holdes på 37 ° C for længden af proceduren ved brug af en kontrolleret, cirkulerende vandbad (figur 2D).
- Monter hjertet på Langendorff Apparat (figur 2A). Ved hjælp af to mikro-dissekere pincet (fig. 1D-E), prime aorta omkring ikke-hypodermisk, stumpe ende kanyle (24 G) med silikoneslange på den distale spids. Alternativt kan en kommerciel animalske fodring nål (24 x 1 i, W/1-1/4) kan anvendes. Silikoneslange på 24 G kanyle eller dyrefoder nålen vil give mulighed for at sikre suturen over rillen. Placer aorta på nålen som en sok. (Figur 2C).
- Bemærk: Det er vigtigt at være sikker på, at enden af nålen hviler i aorta ascendens, ideelt i aortaroden distalt til højre innominate, men at det ikke strækker sig gennem aortaklappen ind i den venstre ventrikel, da dette vil alvorligt begrænse muligheden af bufferne til effektivt at perfundere gennem hjertet via kranspulsårerne.
- Fastgør hjertet til nålen ved at binde en lille længde af sutur silke (7-10 cm lang) (figur 1K) omkring toppen af aorta, at sikre, at slips er på niveau med den opadgående aorta, under højre innominate speciesy, men er over enden af nålen.
- Sænk hjertet ind i det indre af det koniske glas (figur 2B) for at hjælpe med at opretholde en passende temperatur.
- Perfundere hjerte med perfusionsbuffer i 5 minutter ved en hastighed på 1 ml / min og fastspænde glaskammer udstrømning at tillade perfusatet samles i koniske glas og kuvert hjertet. Den skematiske for at fordøje hjertet er vist i figur 3..
- På dette tidspunkt bør du se mængden af hjertet stigning. Derudover vil blod i hjertets væv erstattes af perfusat, der forårsager væv bleghed.
- Slip udstrømningen klemme til at dræne perfusatet. Stop pumpen at bevæge slangen fra perfusionsbuffer beholderen til enzymbuffer beholderen (figur 2E). Genstarte pumpen begynder at perfundere hjertet med enzym-buffer (tabel 2) ved 1 ml / min. Klem udstrømningen igen for at tillade enzymet buffer til at indpakkeshjerte.
- Her, som enzymet perfusion af hjertet og fordøje bindevæv, vil hjertet blive blegere, og den strukturelle integritet vil aftage.
- At afgøre, hvornår at skære hjertekamrene fra den fordøjede hjertet, løft hjerte ud af den koniske glas, forsigtigt klemme hjertet med pincet og indsamle et par dråber perfusat i en lille petriskål og tjekke for at se, hvorvidt enkelte celler er faldende .
- For nybegyndere er det nyttigt at forbinde perfusion linje med et manometer. Når hjertet er ved at blive fordøjet, vil trykket falde hurtigt, idet bindevæv ikke holder modstanden. Manometeret er også nyttig for nybegyndere at sikre, at positionen af nålen er hævet over aortaklappen og ikke i ventriklen. Lavt tryk vil indikere, at nålen er i den ventrikulære kammer og højt tryk indikeret, at nålen rører ventilen.
- Skær hjertekamrene fra hjertet i en skålfuld af transfer buffer (A) (tabel 2), når den ventrikulære trykket begynder at falde dramatisk, eller når du er i stand til at se enkelte celler i perfusatet. Dette tager normalt ~ 7-10 min.
- Igen ved hjælp af mikro-dissekere pincet (figur 1C), hakkekød hjertekamrene i små stykker til at dissociere. En vellykket fordøjelse vil forlade næsten ingen solide bidder af væv efter hakning, med de fleste af vævet bliver amorfe ved dissociation.
- For yderligere at adskille væv, pipette opløsningen ind / ud med en plastik Pasteur-pipette (fig. 4), hvorfra spidsen var blevet skåret på en ~ 45 ° vinkel. Denne ændring tjener til at forøge det indre diametrale plads pipettespidsen dermed reducere mængden af shear stress på celler som vævet findeles.
- Før dissekere væv med tangen er det muligt at adskille de enkelte kamre og separat dissociere atrial, venstre ventrikel eller vet ventrikulære celler.
- Fastgør kvadrerede mesh (fig. 1 M) til en lille tragt (Figur 1 I) med klemmer og placere denne filtrering apparat ind i en 15 ml Falcon rør (Figur 1I).
- Brug den modificerede Pasteur-pipette til at fjerne celle løsning fra fadet og foretage opløsningen i Falcon røret.
- Lad levende celler til at sedimentere til bunden af røret (levende cellesedimentering bør tage 2-4 min.)
- Alikvot 2,5 ml af hver af de fire calcium løsninger (Tabel 3) i 4 separate 15ml Falcon rør.
- Igen bruger en standard Pasteur pipette forsigtigt fjerne cellepelleten fra bunden af røret og overføre cellerne til den første af de calcium-løsninger.
- Lade cellerne sig på bunden af røret, og gentag trin 1.17 i de efterfølgende calcium løsninger, indtil cellerne er i den sidste løsning.
- Lad ikke cellerne bosætte sig i fourth calciumopløsning. Sæt låg på røret og vend det på sin side.
2. Celledyrkning
- Før isolering plade 1 ug / ml naturlig muselaminin på dækglas og inkuberes i mindst 1 time ved 37 ° C og 2% CO2. Også give din plating og kultur medier (tabel 4) til at varme i inkubatoren ved 37 ° C og 2% CO 2. Dette tillader den opløste CO 2 i medierne til at komme i ligevægt.
- Du må ikke fjerne det øverste fra medierne. Du skal blot løsne toppen for at undgå forurening.
- Lad de isolerede celler for at pelletere ved bunden af Falcon-rør.
- Fjern pelleten under anvendelse af en standard plast Pasteur-pipette og resuspender i den passende mængde af plating medier.
- Plate cellerne på laminin-belagt dækglas i passende størrelse fad og inkuberes i 37 ° C og 2% CO 2 i mindst 30-60 min for at tillade cellerne at overholde dækglas.
- ** Hvis transfektion med adenovirus, fortyndes virus i en passende mængde af plating medier og erstatte klædningen medier i skålen med virus-holdige medier. Lad virus inkuberes på cellerne i 2 timer i 37 ° C og 2% CO2. **
- Fjern klædningen medier fra fadet og erstatte med kultur medier.
- Ændre forsigtigt kultur medier hver dag, så for ikke at forstyrre cellerne på dækglas.
Ved hjælp af denne procedure har celler blevet dyrket i op til 72 timer. Billeder af dyrkede og GFP-transficerede celler kan findes i figur 5.
3. MMSYS System
- Magten MMSYS sikrer, at buelampe igangsættes først.
- Tilslut rørene fra pumpen til den passende indgang og udtag af MMSYS kammer (figur 6).
- Prime systemet med calcium-puffer (B) (tabel 2).
- Placer en caopriately størrelse dækglas ind i kammeret og fastgør (Figur 6E). De fleste MMSYS kamre bruge enten 22 mm eller 25 mm kvadratiske dækglas. Kontakt din MMSYS brugermanualen til at bestemme den passende dækglas til dit kammer.
- Overfør 500 ul af celle opløsningen til et lille Eppendorf-rør.
- Tilsæt 0,5 pi fura2-AM (stamopløsning på 1 pg / pl) til lille rør af celler og give dem mulighed for at inkubere i mørke ved stuetemperatur i 5-7 min. Dette tillader fura2-AM til "load" i cellerne gennem hurtig passiv diffusion gennem cellemembranen.
- Lad Fura-2-loaded celler bundfælde til bunden af røret, og vaske overskydende Fura med 500 pi calcium buffer B.
- Sluk lyset i rummet.
- Ved hjælp af en standard Pasteur-pipette, drop 1-2 dråber (afhængigt af cellekoncentrationen) i "lastet" celle opløsningen i midten af kammeret (fig. 6C) og tillade cellerne to rette på dækglasset i 5 min.
- Tætheden af cellerne i kammeret bør være sådan, at en enkelt ikke-overlappende celler kan let ses i MMSYS dataopsamling platform.
- Begynder forsigtigt at flyde calcium buffer (B) gennem kammeret.
- Øge temperaturen kammeret til 37 ° C.
- VIGTIGT: Du må ikke slå opvarmningsapparatet indtil flowet er blevet indledt. Dette kan alvorligt skade feedback thermocoupler (figur 6A).
- Sørg for, at kammeret er tilsluttet MyoPacer via forbindelsesledninger (figur 6B) og begynde at pace cellerne 5 Hz ved 1.5x stimuleringstærsklen for cellerne.
- Vælg en celle, der er at slå på den rigtige frekvens og flytte den ind i framing blænde.
- Juster kamera og indramning blænde dimensioner, så at hele cellen er i midten af vinduet rettet vandret med sarkomerer APforælder.
- For celle længde justere rød og grøn (højre og venstre) fotodiode indikatorer til kanten af cellen. Juster kontrasten for at optimere sort / hvid kontrast i kanterne af cellen. Der henvises til Ionoptix manualen for yderligere detaljer.
- Stil den i et område af cellen med veldefinerede sarkomerer og justere fokus for at optimere toppen af effektspektret (rød). Tilpasser også lysstyrke mikroskop for at optimere den blå udjævning vinduet og sort oplysninger kontrast.
- Juster den grønne tærskel barer til at fange så meget af den røde power spektrum (peak) og så lidt baggrund som muligt.
- Begynd optagelsen.
- Efter nok data er blevet registreret, klik på "Pause" for midlertidigt at stoppe optagelsen og at sikre, at hverken fokus eller dimensioner tegnevinduet er ændret, flytte mikroskop scene til et område af dækglasset, hvor der ikke celler eller cellemateriale kan være set. LenGTH af optagelse varierer afhængigt af investigators forsøgsprotokol.
- Bemærk: Hvis du klikker på "Stop" vil afslutte optagelsen, og ingen baggrund vil være i stand til at blive optaget for den pågældende celle.
- Klik på "Genoptag" for at optage en baggrund måling.
- Efter nok baggrund er blevet optaget på "Stop" for at afslutte optagelsen.
- Klik på "File >> Save" for at gemme alle spor for denne celle i en enkelt. ZPT fil.
- Gentag trin 3,12-3,20 indtil nok celler er blevet registreret.
- Rådfør IonOptix-MMSYS Brugervejledning 12 for instruktioner om analyse af de registrerede data. Karakteristiske indspillede data i vildtype cardiomyocytes er vist i i fig. 7.
4.. Patch Clamp
Patch fastspænding af forskellige celletyper er blevet godt beskrevet tidligere i dette tidsskrift 25-28. Vi har derfor fokusere på nogle kritikeral parametre for vellykket patch fastspænding af voksne cardiomyocytter isoleret under anvendelse beskrevet vores protokol.
- Ved hjælp af en pipette aftrækker og borosilikatglas (med glødetråd: OD 1,5 mm, 0,86 mm ID - 10 cm længde) trække en pipette, der udviser ~ 2,0-3,0 MOhm når fyldt med pipette løsning (tabel 5).
- Fire-polish pipettespidsen forsigtigt ved hjælp af en Narishige eller anden lodret brand poler. Modstanden af plasteret pipette bør være 2-4 MO efter brand polering.
- Tænd for computeren, forstærker (Axopatch 200B), AD konverter (Digidata 1440A, Axon Instruments) og mikromanipulator (MP-285). For hele celle patch fastspænding, starter vi med standardparametre som tidligere beskrevet.
- For dyrkede voksne CMS, fjerne dem fra inkubatoren og forsigtigt vaske dækglasset som CMS er belagt med PBS ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt dækglasset og placere den i perfusionskammeret på inverteret mikroskop (Nikon TE 2000).
- Sikre, at indløbet til perfusion, og udløb (til udsugning) ligger lige over overfladen af dækglasset.
- Start perfusion med passende ekstra-cellulær opløsning (tabel 5).
- For frisk dissocierede voksen CMS, placere en kollagen-belagt dækglas i perfusionssystemet som ovenfor.
- Da celler vil være i opløsning, forsigtigt erstatte opløsningen med ekstracellulære puffer.
- Brug af den modificerede Pasteur pipette (figur 4), forsigtigt opblande cellerne i det ekstracellulære buffer, tage en portion og placere den på dækglasset.
- Lad cellerne vedhæfte i 10-15 min før du starter perfusion som i 4.4.
- Back-fylde hele celle patch pipette med intra-cellulær buffer ved hjælp af en Microfil (World Precision Instruments, 28 G) nål. Sørg for, at der ikke er luftbobler i spidsen af pipetten, blidt tryk for at tillade luftboblerne til at flyde til surface af opløsningen.
- Fastgør den fyldte patch-pipetten til pipette-holderen, der sikrer, at der er kontakt mellem mikroelektrode og indre opløsning.
- Vi bruger sølvchloridelektroder, men tage sig af 'chloriding »de sølvtråde mindst en gang om ugen ved at nedsænke natten over i husholdningernes blegemiddel.
- Sænk forsigtigt pipetten i badet, der sikrer, at badet elektrode nedsænket på alle tidspunkter i bad / ekstra-cellulær løsning. Opveje eventuelle væskeovergangen potentialer på dette tidspunkt. Store kryds potentialer kan være et tegn på forværrede sølvchlorid på elektroderne.
- Sund cylindrisk voksen CMS identificeret i mikroskop og centreret i synsfeltet. Som tidligere beskrevet er en kombination af at flytte mikromanipulator og justere fokus giver mulighed for umiddelbar nærhed af patch-pipetten og overfladen af CM.
- Når de er i samme fokusplan, bruger vi en kombination af visuelning af cellen og test puls (fås i Axopatch 200B).
- Når modstanden af pipetten fald i halvdelen (tyder på, at pipetten er i kontakt med overfladen af cellen), og cellen fortsætter med at se cylindrisk opbygger vi gigaohm tætning ved hjælp af mild sugning.
- Til CMS, foretrækker vi munden sugning at etablere undertryk. Hvis gigaseal succesfuldt er opnået, vi igen bruge blid rytmisk munden sugning "break-in" til cellen at indføre helcelle patch tilstand.
- Typiske hvile potentialer af sund CMS i størrelsesordenen -85 til -90 mV. Når en gigaseal er opnået, måle potentiale hvile membran ved hjælp strømtang med I = 0 pA.
- Hvis hvilepotentiale membran depolariseres dette kan indikere en beskadiget celle eller en dårlig tætning.
- Fordi CMS er store celler med en masse af areal, der skal betales til kapacitans kompensation, især w omhyggelig opmærksomhedhøne hurtigt aktiverende strømme såsom natrium-kanaler skal undersøges. Hvis der ikke kan opnås tilstrækkelig kapacitans kompensation ved hjælp af den indbyggede indstillinger på impulsgeneratorens kompensation, prepulses på sub-tærskel spænding og modsat polaritet kan have til at blive anvendt, og den resulterende strøm trækkes fra det optagede signal. En sådan protokol er nemt programmeres i Axopatch.
- Når hel celle patch tilstand er blevet etableret, vente 15 min for at tillade ligevægt og for at sikre stabiliteten af pakningen før start spænding eller strøm clamp protokoller. Vi bruger standard protokoller, der er blevet beskrevet tidligere i dette og andre tidsskrifter og vil ikke blive uddybet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen af voksne cardiomyoctyes resulterer i stavformede, riller og hvilende (ikke spontant slående) celler (figur 5A). Døde celler vil se afrundet og ingen riller vil være til stede. Hvilende celler kan dyrkes og transficeres med adenovirus at manipulere genekspression (figurerne 5B og 5C). Efter 24 timer af kultur, er morfologien af levende celler ikke ændres, er de stadig Ca2 +-tolerant, og de kan tempo ved feltstimulering. Med den foreslåede fremgangsmåde kan et udbytte på 80-90% levedygtige celler opnås.
For at måle cellens kontraktilitet den MMSYS systemsoftware tager faseinformationen fra mikroskop for at rapportere enten ændringer i sarkomer eller celle længde. Vist i (figur 7A) er en repræsentativ kontraktilitet spor via sarkomeret længde måling af en vildtype C57BL6 mus. For sunde voksen mus myocytes fraSE mus baseline sarkomeret længde er ~ 1,7-1,9 mM. Den MMSYS systemsoftware er i stand til samtidigt at måle kontraktilitet og calcium håndtering ved at måle forholdet mellem bundet til de ubundne former af calcium-aktiverede farvestof fura2-AM. Mens forholdet foranstaltninger kan variere lidt mellem opsætninger, for raske celler, er forholdet typisk mellem 1,5-2,5 (Figur 7B). Hvis MMSYS systemet er kalibreret til calcium, kan dette forhold så blive oversat til et absolut mål for intracellulær calciumkoncentration. For at analysere de data, der er genereret ud fra kontraktilitet og calcium spor, skal sporene som middelværdier for at skabe et karakteristisk spor for at celle (figur 7C og 7D). Disse karakteristiske spor, underkastes derpå en monotransient dataanalyse algoritme fra MMSYS systemsoftware, der genererer derefter parametre for systolisk og diastolisk funktion. Yderligere detaljer findes i IonOptix manual.
Voksen mus kardiomyocytter var også genstand for hele celle patch clamp eksperimenter hvor handlingen potentiale blev optaget i strømtang (figur 8).
| Kropsvægt (g) | Ketamin / Xylazin (ml) |
| 15 | 0.18 |
| 20 | 0.25 |
| 25 | 0.31 |
| 30 | 0,37 |
| 35 | 0,43 |
| 40 | 0,49 |
| 45 | 0.55 |
| 50 | 0,62 |
Tabel 1. Voksen Mouse vægtafhængig Ketamin / Xylazin Dosering (80:12).
| Opløsning | Opskrift |
| Tyrode Buffer * (PH 7,4) | 1 L ddH2O 137 mM NaCI 4 mM KCI 1 mM MgCl 10 mM HEPES 0,33 mM NaH 2PO 4 |
| Perfusion buffer * (PH 7,4) | 500 ml Tyrode buffer 10 mM D-(+)-glucose, minimum 5 mM taurin 10 mM butandion Monoxime (BDM) |
| Enzyme Buffer * | 50 ml perfusionsbuffer 0,024 g Collagenase D (type IV) 0.018 g Collagenase B (Type II) 0,003 g Protease XIV fra Streptomyces griseus |
| Overførsel Buffer (A) | 45 ml perfusionsbuffer 5 ml bovint serumalbumin (fra 5 mg / ml stamopløsning) |
| Calcium Buffer (B) | 1 L Tyrode buffer 1,2 mM CaCI 5,5 mM D-(+)-glucose, minimum |
Tabel 2. Voksen Cardiomyocyte Isolation Buffer Opskrifter.
| [CaCl] | Overførsel Buffer (A) | Calcium Buffer (B) |
| 0,06 mM Ca2 + | 9,5 ml | 0,5 ml |
| 0,24 mM Ca2 + | 8,0 ml | 2,0 ml |
| 0,60 mM Ca2 + | 5,0 ml | 5,0 ml |
| 1.20 mM Ca2 + | 0 ml | 10 ml |
Tabel 3.Calcium titreringsopløsningen opskrifter.
| Udpladningsmedium | Dyrkningsmedium |
|
|
Tabel 4. Plating og Kultur Medier opskrifter.
| Pipette Solution | Badopløsningen |
|
|
Tabel 5. Patchclamp Solutions (løsninger er vist, er til måling af natrium strømme).
Figur 1. .. Voksen cardiomyocyte isolation instrumenter A) OptiVisor optisk glas kikkert lup B) Tissue pincet, 5,5 i, 1x2 tænder -. Roboz Scientific C) Moloney pincet - 4,5 i (11,5 cm) lang svag kurve, savtakket -. Roboz Scientific DE) Dumont # 3 Tang, Dumostar, tip størrelse 0,17 x 0,10 mm. F) Packer Mosquito Tang 5 i Straight Flat -. Roboz Scientific G) Micro Dissecting Saks 4.5 i Curved Sharp / Sharp -. Roboz Scientific H) Micro Dissecting Saks 3.5 i Straight Sharp / Sharp 20 mm -. Roboz Scientific I) 15 ml Falcon rør - Thermo -Fisher Scientific J) 60mm petriskål indeholdende PBS K) Softsilk: Wax belagt flettet silke, 19 mm - Covidien L) Plastik tragt, 6,0 cm i diameter M) Nylon mesh - 400μm porestørrelse.....
Figur 2. Langendorff Apparatur. A) Hele Langendorff perfusion system, der anvendes for voksne cardiomyocyte isolation. B) forstørret visning af den hule, koniske samling glastragt anvendes til at opvarme kanyle hjerte. C) forstørret visning af den ikke-hypodermisk kanyle nål. (Genanvendelig feeding Needles (24 G, lige, rund spids, 25 mm lang, Fin Science Tools Inc. Item 18.061-24). D) Cirkulerende vandbad E) Vandbad udrugning perfusion, enzym og overføre buffere.
Fig. 3. En detaljeret skematisk af perfusion system.
Figur 4.. Modificeret Pasteur-pipette. Pipetten blev modificeret ved skæring af spidsen på en cirka 45 °. Dette giver mulighed for et større overfladeareal og skaber mindre forskydningsspænding på cellerne, da de bliver dissocieret. Det indsatte viser et tættere billede af den modificerede spids.
Figur 5. Kulturperler og GFP transficeret cardiomyocytes. A) Frisk isolat ed voksne kardiomyocytter fra en C57BL6 mus på 12 uger. Pile peger på døde eller døende celler. Disse celler er mere afrundet end den sunde, stavformede voksen cm. B) GFP-transficerede voksen mus cardiomyoctyes efter 24 timer af kulturen. C) Kulturperler voksen mus kardiomyocytter efter 24 timer. Indsat viser øget forstørrelse af dyrkede myocytter.
Figur 6. . MMSYS systemet kammer Blå pile repræsenterer strømmen af perfusionsbuffer (puffer B)) Enkelt, in-line opløsning varmelegeme -... Warner Instrument Corporation B) Tilslutningsslidser fra MMSYS systemet kammeret til MyoPacer feltet stimulator C) Platin elektroder til feltstimulering beliggende i centrum af kammeret. D) Udstrømning reservoir. E) Chamber klemmer i åben position.
Figur 7. Repræsentative MMSYS systemdata registreret for vildtype C57BL6 mus opnået fra Jackson Labs. A) MMSYS basen kontraktilitet spor. B) Forholdet mellem Ca 2 +-bundet til Ca 2 +-ubundet fura2-AM indspillet til at generere basen calcium spor. Disse spor svarer til kontraktilitet målingerne i A). C) i gennemsnit basis kontraktilitet spor indsamlet af MMSYS systemsoftware i en karakteristisk kontraktilitet spor. D) Karakteristisk calcium spor indsamlet fra basen spor i B). Analyse af de sammensatte spor vil gøre det muligt for forskeren at generere surrogat parametre for systolisk og diastolisk funktion. Klik her for at se større figur .
Figur 8. Patch clamp spor viser handling potentialet i en vildtype voksen mus cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport har vi beskrevet de teknikker, der er nødvendige for en vellykket isolering og dyrkning af voksne CMS musen hjerte. Vores teknik giver mulighed for efterfølgende undersøgelse af CM funktion og ophidselse hjælp af de metoder, der er beskrevet ovenfor. Den kritiske parameter for at studere funktionalitet voksen CMS sundhed og kvalitet af den isolerede CMS. Som beskrevet ovenfor vores teknikker giver mulighed for et højt udbytte af funktionelle celler, som er modtagelige for manipulation af genekspression under anvendelse af adenovirus / lentivirale infektioner i kultur og analyse af cellulær excitabilitet og kontraktile funktion.
En af de vigtigste parametre for isolation af funktionel voksen mus CMS er præcis og hurtig kanylering af hjertet på ikke-kanyle. Care skal sikres, at aorta knyttet til den venstre ventrikel dissekeres en tilstrækkelig længde til at give mulighed for lettere og hurtigere kanylering af hjertet. Når kanylering than hjerte, er det også vigtigt, at spidsen af nålen forbliver i aorta ascendens og ikke strækker sig forbi aortaklappen ind i den venstre ventrikel for at muliggøre effektiv perfusion af vævet via koronararterier. Det næste afgørende skridt er at sikre aorta til stilken af nålen ved hjælp af en silkesutur. Suturen skal bindes på aorta ascendens, således at perfusionsbuffer strømme retrograd i kranspulsårerne og venstre ventrikulære hulrum, men ikke flyde antegradely ud gennem den distale ende af det dissekerede aorta eller store kar.
Nogle efterforskere finder det nyttigt at oprette en trykmåler til at vurdere kvaliteten af kanylering og efterfølgende perfusion af enzymet. Når du bruger en trykmåler, bør den initiale tryk i venstre ventrikel være ~ 80-100 cmH 2 O, og efter perfusion med enzymet, vil trykket falde til ~ 40-50 cmH 2 O. Når den ventrikulære tryk når dette punkt, er detsandsynligvis klar til at blive at blive skåret fra nålen. For at sikre at hjertekamrene er godt fordøjet, kan et par dråber af den gennemstrømning der indsamles fra under hjertet i en petriskål og kontrolleres for at se, om nogen levende, hvilende celler er til stede.
De resulterende isolerede celler fra denne procedure egner sig godt til immuncytokemi. De kan fastgøres ved hjælp af regulære fastgørelsesmetoder 29 (dvs. formalin, paraformaldehyd, iskold methanol eller acetone), men et højere niveau af permeabilization end der typisk anvendes til neonatale cardiomyoctyes er undertiden nødvendig til billede cytosoliske proteiner eller protein strukturer (dvs. alfa- sarcomerisk actin, beta myosin). Endelig kan cellerne dyrkes og efterfølgende inficeret med adeno-eller lentivirus at manipulere genekspression eller anvendes til funktionelle analyser af cellulære kontraktile apparat.
Kultur af voksne mus CMS har længe været beskrevet somudfordrende. Ved hjælp af de teknikker, der er beskrevet her, kan vi rutinemæssigt kultur disse celler for op til 72 timer, selv om udbyttet af funktionelle celler falder markant efter 36 timer. Ved dyrkning af cellerne, er det bydende nødvendigt, at cellerne udpladet ved 37 ° C i 2% CO2. Dette er forskelligt fra neonatal CMS, som foretrækker at blive dyrket ved 10% CO2 i de første 24 timer og derefter skiftede til 5% CO 2 eller neonatale kardiale fibroblaster, som også foretrækker 5% CO2. Klædningen og kultur medier kan i ligevægt, således at den opløste CO 2 er 2%.
Cellerne udplades på laminin-overtrukne dækglas, således at de ikke løftes af glaspladen, når mediet ændres. Men de cardiomyocytes ikke vedhæfte meget sikkert til glasset selv med laminin belægning. Det er derfor meget vigtigt, at der udvises forsigtighed, når ændre kulturen medier, ved hjælp af sterile pipetter, og ikke et vakuum aspiration system. Når cellens udplades, kan de transficeres med adenovirus ved at inkubere virus for ikke mere end 2 timer. Timingen afhænger titer af virus og proteinet er overudtrykt, så vi anbefaler ledende foreløbige eksperimenter for at bestemme LD50 og ED50 for virus. I de fleste tilfælde bruger vi en MOI på 20-100 for adenovirus. Når cellerne er blevet inkuberet med virus, ekspressionen af målgenet (r) tager typisk ~ 24-36 timer.
Isolerede celler, der er udpladet på dækglas af en passende størrelse for MMSYS systemet kammeret kan også analyseres for kontraktilitet og calcium håndtering ved hjælp af MMSYS imaging system. Disse dækglas kan placeres direkte ind i kammeret, og dyrkningsmediet kan fjernes ved at tænde perfusionssystemet. Hvis cellerne ikke bliver dyrket og bliver brugt til analyse umiddelbart efter isolering, kan de tilsættes direkte til kammeret, når et dækglas er anbragt. Menser det ikke nødvendigt at pre-coat dækglas med laminin, når man analyserer frisk isolerede celler, i vores erfaring, laminin hjælper cellerne bedre holde sig til dækglasset. Ved hjælp af en langsom flow for MMSYS enheden derudover sikrer, at celler forbliver knyttet til dækglasset. Endelig skal optikken i mikroskop, især objektivlinsen være omhyggeligt rengjort før hvert eksperiment for at tillade nøjagtig visualisering af sarkomerer nødvendige for vurdering af kontraktilitet.
Det mest afgørende komponent i MMSYS system er den eneste in-line væske, der varmer perfusionsbuffer (B), som det flyder ind i kammeret. Termogeniske element af dette stykke udstyr er beregnet til at udveksle varme med passerer væske via konvektiv varmeoverførsel, så hvis strømmen er fraværende, vil veksleren overophedet og kunne repareres beskadige systemet. Det er derfor afgørende, at varmeren er tændt, når strømmen påbegyndes.
Andre metoder til analyse af den kontraktile apparat af voksne cardiomyocytter er tidligere blevet beskrevet, herunder avancerede fremgangsmåder, der anvender atomic force mikroskopi 30-32. Nogle af disse metoder giver mulighed for mere avanceret måling af lokaliserede kontraktile kraft og egenskaber såsom Youngs modul, hvilket gør dem mere velegnet til måling af uregelmæssigt formede celler eller celler uden klart definerede sarcomerisk systemer såsom CMS stammer fra inducerede pluripotente stamceller. Disse teknikker kan være lige så nemt bruges på den isolerede voksne CMS. Fordelen ved MMSYS system er den relative lethed måle kontraktilitet og evnen til at måle et stort antal celler i en kort periode i celler med klart definerede sarkomerer. Derudover soft-edge og sarkomer analysesystemer, der kan måle længden af cellen eller længde mellem sarkomerer henholdsvis mulighed for to forskellige (men ropstemt) metoder til at måle kontraktilitet. Købet af data software kombineret med den avancerede, brugervenlige analyse software gør dette system let at lære og bruge. Endelig er evnen til at måle calcium dynamik samtidig giver mulighed for korrelation mellem kontraktilitet og calciumhomeostase, som ikke er mulig med atomic force mikroskopi. Også, fordi de data, output er en ratiometrisk mål for et calcium-aktiverede farvestof (fura2-AM), med korrekt kalibrering, kan opsamles absolutte mål for interne calcium koncentrationer.
Vellykket optagelse af ion-kanal signaler fra voksne cardiomyocytes kræver cellerne være i optimal stand. Umiddelbart efter isolering og forkromning af de celler, de ikke er vedhængende og vil flyde i opløsning; på dette tidspunkt, de ikke kan studeres. Inden for et par timer vil de klæbe til en coatet dækglas, og det er på dette punkt, at de kan undersøges. Det er vores erfaring patching inden for et par timerforkromning giver det optimale resultat, da man venter for længe negativt påvirker cellerne. Som beskrevet ovenfor teste hvile membran potentiale efter at have etableret en gigaohm sæl og bryde ind i cellen, samt evnen til at etablere en gigaohm sæl selv er to parametre, som afspejler, hvordan sunde cellerne er ved at lappe. Selv om det er lettere at lappe på celler, der ikke er ordregivende, dette er ikke en forudsætning, tilstrækkelige sæler kan opnås på at slå celler så godt. De protokoller, der anvendes på dette punkt afhænger af målene i patch fastspænding undersøgelsen, med de nuværende clamp teknikker, kan optages spontan eller induceret virkningspotentialer. Alternativt kan spændingsfikseringsenheden anvendes til at studere specifikke ionkanaler. I betragtning af den lange række af kanaler i membranen, er sådanne optagelser normalt udføres i nærvær af ionkanal-blokkere. Tetrodotoxin (TTX), er nisoldipin og cæsium ofte bruges til at blokere natrium-, calcium-og kaliumkanaler henholdsvis although en række medikamenter er blevet brugt, og detaljerne i deres anvendelse er blevet offentliggjort i udstrakt grad. De fleste tilgange involverer enten indspilning strømninger før og efter anvendelsen af ionkanal-blokkere og fratrække de strømninger, og / eller blokere baggrund kanaler med de relevante blokkere forud for optagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
