Summary
Vi beskriver en metode til at målrette lægemidler til centralnervesystemet ved enten at implantere et kateter eller udfører en bolus injektion i højre laterale ventrikel i mus. Vi fokuserer specifikt på levering af antisense oligonukleotider. Denne teknik kan let tilpasses til andre stoffer og til rotter.
Abstract
På grund af en manglende evne til at krydse blod-hjerne barrieren, visse lægemidler skal leveres direkte ind i det centrale nervesystem (CNS). Vores laboratorium fokuserer specifikt på antisense-oligonukleotider (ASOS), skønt de viste teknikker i videoen her kan også anvendes til at levere en overflod af andre lægemidler til centralnervesystemet. Antisense-oligonukleotider (ASOS) har kapacitet til at Knockdown sekvens-specifikke mål 1 samt skift isoform forhold mellem specifikke gener 2. Opnå udbredt gen knockdown eller splejsning i CNS hos mus, kan ASOS leveres ind i hjernen ved hjælp af to separate indgivelsesveje, som begge vi viser i videoen.
De første anvendelser Alzet osmotiske pumper, forbundet til et kateter, der implanteres kirurgisk i den laterale ventrikel. Dette gør det muligt for Asos skal løbende infunderes i CNS for en udpeget periode. Den anden indebærer en enkelt bolusinjektion af high koncentration af ASO i den højre laterale ventrikel. Begge metoder bruger musen cerebrale ventrikulære system for at levere ASO til hele hjernen og rygmarven, men afhængigt af behovene i undersøgelsen, kan én metode foretrækkes frem for den anden.
Introduction
Nogle lægemidler er i stand til at krydse blod-hjerne barrieren (BBB), som kræver direkte centrale nervesystem (CNS) levering. At omgå BBB, kan lægemidler leveres direkte ind i hjernen ved hjælp af de beskrevne metoder. Mens vores laboratorium og papiret detaljeret heri fokus på antisense-oligonukleotider (ASOS), kan andre lægemidler, såsom små molekyler, antistoffer, genterapivektorer osv., Også blive leveret gennem nøjagtig samme fremgangsmåde.
Visse proteiner spiller en afgørende rolle i patogenesen af neurodegenerative sygdomme. Sådanne proteiner ofte danne giftige arter og ophobes i aggregater, hvilket fører til en eventuel neuronal død og efterfølgende neurologisk sygdom 3-4. I et forsøg på at bremse eller endog standse progressionen af disse sygdomme, kan en terapeutisk mulighed være at direkte målrette og mindske sygdomsfremkaldende protein. Men disse proteiner ofte fundet ubikvitært gennem CNS, hvilket gør det vanskeligt at e ffectively målrette dem på en global skala.
For at målrette gener hele CNS, vi administrere ASOS i muse cerebrospinalvæske (CSF) via den laterale ventrikel at omgå BBB. Denne specifikke metode drager fordel af muse ventrikulære system, der bader hele hjernen og rygmarven, for udbredt fordeling af ASOS. Vi bruger ASOS der er 18-20 mer RNA-lignende molekyler, der direkte binder mål-mRNA-sekvensen, og afhængigt af ASO kemiske modifikationer, enten A) rekruttere RNase-H at nedbryde mRNA fører til knockdown eller B) skifte alternativ splejsning 1 , 2,16,17. Det skal bemærkes, at flere molekyler eksisterer for at vælte et specifikt protein in vivo, herunder shRNA. Da disse molekyler er ikke i fokus i denne artikel, vi lede læseren at gennemgå artikler, bedre detaljer knockdown virkningsmekanismer og fordele / ulemper ved hver 5-6.
jove_content "> I tidligere arbejde har vi brugt ASOS at målrette proteinet superoxiddismutase 1 (SOD1) i en transgen rottemodel af amyotrofisk lateralsklerose (ALS) 7 (figur 4). Mutationer i SOD1 forekommer hos ca 2% af alle ALS sager 8, selvom det har været for nylig hypotese, at SOD1 kan spille en vigtig rolle i sporadiske ALS samt 9-10. Ved at reducere den samlede SOD1 niveauer i ALS transgene rotter, overlevelse efter indtræden var signifikant forøget 7.. Disse vigtige data var den første at vise, at en ASO behandling i CNS kan få gennemgribende positiv indvirkning på en neurologisk sygdom model. Siden da har Asos målrettet mod menneskelige SOD1 indtastet og afsluttet et fase I humane kliniske forsøg med minimale bivirkninger (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , der blev fremlagt på 2012 64 th Annual American Academy of Neurology. Planer om at flytte ASOS frem til fase II forsøg er i gang.I alle disse undersøgelser blev ASOS leveret til den laterale ventrikel for at mindske den samlede gen-niveauer eller ændre gensplejsning gennemhele CNS. Både osmotiske pumper og en enkelt bolus injektion kan bruges til at levere ASOS til CSF. Pumper mulighed for en langsom, kontinuerlig levering, mens intracerebroventrikulær (ICV) bolus er en hurtig, engangs-injektion. Vi har brugt begge disse metoder med succes, selvom vi ikke har rapporteret direkte sammenligning mellem pumpe og bolus i et enkelt transgen linie.
Brug Asos i CNS er en effektiv måde at reducere den samlede protein niveauer og / eller ændre splejsning af flere proteiner. Mens vi bruger ASOS udelukkende som en behandling for neurologiske lidelser, erkender vi, at andre områder også kan drage fordel af denne teknik. Så længe proteinet af interesse udtrykkes i CNS og det endelige mål er at opnå CNS-dækkende ændringer i genekspression, ved hjælp ASOS i de demonstrerede teknikker kan være meget nyttig.
Protocol
Protokollen nedenfor er godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg ved Washington University i St. Louis og er i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for anvendelsen af forsøgsdyr. Hvis dette er din første gang udfører operationer, anbefaler vi ser på JOVE artikel om gnaver operationer som en introduktion, før du begynder 14..
ASOS kan leveres til muse CNS gennem både osmotisk pumpe-infusion og en enkelt ICV bolusinjektion. På grund af dette, er proceduren beskrevet nedenfor brudt op i to segmenter. Fordele og ulemper for hver metode vil blive berørt i Discussion afsnit. Koordinaterne anvendes i protokoller er for voksne C57BL6 og B6C3 mus. Tilsvarende rotte koordinater kan findes i tabel 1.
ALZET osmotisk pumpe
1.. Fremstilling af Alzet osmotiske pumper
- Fastsætte en steril drape og omhyggeligt slip følgende punkter på det samtidig sørge for ikke direkte at røre ved noget for at opretholde sterilitet: osmotisk pumpe (r), flow modulator (s), 1 ml steril sprøjte (r), skalpelblad og sektioner af rør (1 rørstykke = 5 pumper). For mus er der tre muligheder for pumper: 14 dage, 28 dage og 42 dage (figur 2A).
- Tag hætten og fylde sterile 50 ml koniske rør med 15-20 ml saltvandsopløsning. Op til 6 forsamlede pumper kan tilføjes per konisk rør.
- Fyld en p60 petriskål med 100% ethanol. Tilføj passende antal katetre til ethanol. For mus, er kateter længde 2,5 mm.
- Filtrere hver ASO i lige så mange 1,5 ml Eppendorf-rør som nødvendigt. Omfatte et Eppendorf-rør fyldt med sterilt 0,9% saltvand til at fylde slangen med.
- Når alt er parat, sat på sterile handsker. Sørg for ikke at røre ved noget, der ikke er sterile. Skift handsker som nødvendigt.
- For hver ASO, der skal anvendes, fyldes en 1 ml sprøjteog loadpumps ved at placere nålen i det øverste hul og langsomt fyldning indtil overskydende siver ud. Fortsæt, indtil alle pumperne er fyldt.
- Tag hætten af flow-modulatorer og indsætte i pumperne. Skub flow-modulator næsten hele vejen ind, efterlader et 3-5 mm hul.
- Ved hjælp af skalpelblad, skæres hvert stykke slange i 5 lige store segmenter. Tag et rørstykke, fylde med sterilt saltvand ved hjælp af en 1 ml sprøjte, og indsætte den øverste strømningsmodulatoren i den ene ende af slangen. Derefter tage en kanyle fra ethanol og forbinde den til den anden ende af slangen. Pumpen er nu færdigmonteret.
- Placer færdigsamlet pumpe ind i den sterile 50 ml konisk rør med saltvand til grunding. Grundingen tillader pumperne at opsuge væske at indlede afgivelsesenheden samt komme til den korrekte temperatur. Priming tid: 14 dage pumper: 4-6 hr, 28 dage pumper: 40 hr, 42 dage pumper: 60 hr. Når du er færdig montage pumperne, cap de koniske rør og anbringes i en ren37 ° C vandbad, indtil kirurgi.
2.. Pre-kirurgiske procedure
- Udslette alt med 70% ethanol for at sterilisere området og fastlægge sterile forhæng på bordpladen og stereotax at skabe et sterilt område. Det er vigtigt at være opmærksom på det sterile område hele operationen. Tænd følgende: Bead Sterilizer, Varme Pad, lys, digital visning og Oxygen / Isofluran system (figur 1).
- De følgende punkter vil blive nødvendig, hvis gøre enten en enkelt operation eller en hel batch af operationer, som vi rutinemæssigt gør: 1 tang, 1 buet hemostat, 1 par lille saks, 1 par små buede stumpe saks, 1 rotte bone cutter , 1 straight hemostat, 5-0 nylonsuturer, 1 koniske rør med 70% ethanol, 1 konisk rør med 95% ethanol, 1 konisk rør med jod, 1 konisk rør med hydrogenperoxid, pakke med sterile vatpinde, 1 flaske super lim, 1 rør antibiotisk salve, 1 tube øjetsmøremiddel og 1 elektrisk barbermaskine.
- Placer spidsen af begge sakse, tænger og buede hemostat ind perlen sterilisator i 15 sek. Fjern og i 70% ethanol. Når du udfører mere end én operation, re-sterilisere spidserne af instrumenter mellem dyr.
- Drej isofluran til 4% og O 2-0,4 L / min og direkte gasforsyning til kammeret. Vi har vores isofluran / ilt-system kalibreres mindst en gang om året for at sikre, at vi leverer den rette mængde af anæstesi. Placer musen i kammeret, og vent, indtil vejrtrækningen er betydeligt langsommere. Fjern mus og udføre en tå knivspids at sikre musen er fuldstændig bevidstløs.
- Barbere hår fra toppen af skulderen op til i mellem øjnene. Hvis musen begynder at vågne op ved at placere musens tilbage i kammeret, indtil musen er helt bevidstløs igen, bekræfter med en tå knivspids. Placer bedøvede musen på stereotax og skubbe næse kegle over næsen.Være blid som tænder og knogler er skrøbelige.
- Dirigere gasstrømmen til stereotax at holde musen bedøvet. Det er vigtigt at lejlighedsvis tjekke for at sikre, at musen er fuldstændig bevidstløs med en tå knivspids hele operationen. Fastgør hovedet med øret søjler. Vi foretrækker nivellering øre barer, selvom at målrette den laterale ventrikel, et perfekt niveau kranium er ikke nødvendigt på grund af den store størrelse af ventriklen.
- Drej isofluran niveau ned til 2,0% for vedligeholdelse. Dab øjensalve på hvert øje. Som det ses i videoen, lægge et sterilt afdækningsstykke over mus, således at kun bunden af halsen og hovedet er udsat. Derefter desinficere det kirurgiske område ved at aftørre toppen af hovedet og halsen i en cirkulær bevægelse fra midten af det barberede område og bevæger sig udad først med en vatpind dyppet i 95% ethanol efterfulgt af en vatpind dyppet i jod.
- Vi anbefaler at bruge en rektal sonde feedback-temperatur kontrolleret opvarmning system, der sikrertemperaturen af mus forbliver på et stabilt 37 ° C. Hvis temperaturen af musen falder under operationen, kan postoperativt genopretning tage længere tid og den resulterende hypotermi kan føre til afvigende protein aktivitet, herunder hyperphosphorylering af det mikrotubulus-associeret protein Tau 15.. Efter opsætning af varmeanlægget, er du nu klar til at begynde operationen.
3.. Implantation af Alzet osmotisk pumpe
- Inden du begynder operationen, sat på et par nye sterile handsker. Derefter, ved hjælp af pincet og en lille saks, lave et snit i skindet fra bunden af halsen over dyrets kranium op i mellem øjnene
- Tag stumpe saks med kurven opad, og skub ind under huden i bunden af halsen tilbage mod venstre bagben. Der bør ikke være modstand. Hvis der er, fjerne saksen, og prøv igen. Dette danner subkutane lomme til den osmotiske pumpe.
- Wipe kraniet ren med sterile vatpinde, efterfulgt af en vatpind dyppet i brintoverilte til at forbedre bregma.
- Tør de 50 ml koniske rør, der indeholder pumper til at opretholde sterilitet af pumperne. Forsigtigt tage en pumpe fra konisk rør ved hjælp af buede hemostat, at tage ekstra pleje, at pumpen ikke rører siderne af konisk rør. Hold bunden af pumpen med pincet og skubbe strømningsmodulatoren i resten af vejen med den buede arterieklemmen.
- Hold pumpen hvor strømningsmodulatoren og slanger mødes med den buede arterieklemmen. Sæt pumpen under huden i bunden af halsen, og skub det tilbage mod venstre bagben så langt som det vil gå uden modstand. Vær omhyggelig med ikke at lade kateteret røre noget.
- Med den buede hemostat, tag fat i kanylen ved rillen, hvor den øverste møder piedestal. Flyt kanylen driveren i position og fastgør på plads.
- Placer en enkelt dråbe superlim på bunden af kanylen. Push toppen af kanylen ind føreren og position, således at slangen peger lige tilbage.
- Tryk på kateterspidsen til bregma og nul koordinaterne på det digitale display. Hæv kateteret og flytte 1,1 mm lateralt til højre og 0,5 mm posteriort (figur 2B). Holde huden af vejen med den buede arterieklemmen.
- Kør den tynde metal kateter gennem kraniet, indtil plastikkanylen basen sikkert presses mod toppen af kraniet. Metallet kateter kan drives direkte gennem kraniet i mus på grund af den relative tynde kranium. Hvis du bruger rotter bore et hul i kraniet, før du sænker kateteret.
- Træk enhver hud, der har lim på den væk fra kraniet. Med kanylen chaufføren der holder kanylen / kateteret på plads, vent 1-2 min for limen at tørre helt.
- Når øve, for at vurdere kateteranbringelse, injicere 20-40 pi 2,5% FastGreen Dye gennem slangen (Figur 2C). Vent 2-3 min, perfuse musen med 1X PBS 0,03% heparin, og fjerne hjernen. Skær coronally på kateterstedet. Hvis kateter blev anbragt i ventriklen, vil farvestoffet perfunderet hele muse ventrikulære system (figur 2D).
- Hold kateteret på plads med den buede hemostat samtidig øge føreren. Frigiver langsomt arterieklemmen at sikre, at kanylen er korrekt fastgjort til kraniet.
- Med en vatpind, skal du trykke ned på toppen af kanylen. Monter rotte knogle Clippers ind i lunden mellem toppen og bunden af kanylen. Klip fra toppen af kanylen, mens du stadig trykker ned med vatpinden. Forsøge at holde hækkesaks niveau for ikke at frigøre kanylen fra kraniet. Hvis kanylen kommer op i sømmene, hurtigt re-lim og pres med en vatpind for yderligere 2 min.
- Brug af 5-0 suturtråd, regelmæssig hemostat og pincet, sutur langs hele åbningen, betale ekstra opmærksomhed lige over kanylen. Vi bruger en løbeturg vandret madras sutur (se figur 5) på grund af den større indsnit over kraniet.
- Påfør en klat antibiotisk salve over hoved og hals. Skru øre barer og løsn næsekeglen. Fjern musen fra stereotax og sted på en opvarmning pad til nyttiggørelse. Overvåg musene nøje for varigheden af genvinding, typisk mellem 10-30 minutter. Kontroller hver 2-3 minutter, indtil musen begynder at gå rundt og grooming sig selv.
4.. Postoperativ pleje
- Overvåg musene dagligt efter operationen for den første uge.
- Hvis en mus synes at være i smerte eller angst, anbefaler vi give mus med et 5 mg / kg subkutan injektion af carprofen gang 24 timer i op til 5 dage for at lindre smerten.
- Hvis der synes at være en infektion, generøst anvende antibiotisk salve til området dagligt og konsultere en behandlende dyrlæge for at sikre, at såret heler ordentligt.
- REFlyt 5-0 nylonsutur 7-10 dage efter operationen for at forhindre irritation fra suturtråd.
5.. Ændring eller fjernelse Alzet osmotisk pumpe
Når pumpen er gjort aktivt infusion ASO, kan det enten ændret eller helt fjernet.
- Følg samme præoperativ procedure som ovenfor med følgende ændringer: 1) vil du ikke brug for de buede saks, buet hemostat, rotte knogle kuttere, eller det digitale display, og 2) i stedet for at prepping lederen af mus, barbering og desinficere bagsiden af musen ved krydset af pumpen og slangen.
- Foretag en 1,5 cm snit på bagsiden af musen, vinkelret på pumpen / slange krydset, ved hjælp af pincet og saks. Træk forsigtigt pumpen ud af snittet uden væsentlig trække / skubbe på slangen, da det kan jar kateteret.
- For at fjerne pumpen, klip slangen omkring 0,5 cm over flow modulator og røre superlim på slangen to sæl det lukker. Vent 1-2 min for limen tørre. Placer slangen tilbage ind i indsnittet og sutur lukket. Dup antibiotisk salve på sutureres hud og sted musen på en opvarmet opsving pad.
- At ændre pumpen, har frisk gjort pumper klar sammen med en 10 cm skål fyldt med 95% ethanol. Katetre er ikke nødvendigt med de nye pumper.
- Snup en ny pumpe med pincet. Dyp fingrene ind i ethanol, tage fat i pumpen, og kassér flow-modulator. Derefter forsigtigt og langsomt trække den gamle pumpe fra strømmen modulator knyttet til slanger og kanyle. Så snart den er slukket, langsomt skubbe nye pumpe på, der sikrer, at strømmen modulator aldrig rører ydersiden af musen.
- Genindsætte den nye pumpe gennem snittet tilbage ind i det subkutane pakken og sutur i huden. Dup antibiotisk salve på såret og sted musen på inddrivelse pad.
- Ligesom med pumpen implantation, overvåge musene dagligt efter operationen for at kontrollere for pain / ubehag og infektioner. Behandl med carprofen og antibiotika som det skønnes nødvendigt.
ICV BOLUS
6.. Pre-kirurgiske procedure
- Følg samme præoperativ procedure som i afsnit 2 ovenfor med følgende ændringer: 1) du behøver ikke krum saks, buet hemostat eller rotte knogle skærestål; 2) Rengør en 10 pi Hamilton sprøjte og kanyle med steriliseret vand og belastning med ASO og 3) lægger sprøjten og nålen til stereotaxic apparat, hvor kanylen driveren blev placeret.
7.. Bolusinjektion af ASO
- Ved hjælp af pincet og en lille saks, lave et snit fra bunden af halsen og op til i mellem øjnene.
- Tør kraniet rene med sterile vatpinde, efterfulgt af en vatpind dyppet i brintoverilte til at forbedre bregma.
- Flyt sprøjten / nålen ind plads og fastgør. Sørg for, at det afskårne del af nålen vender posterior. Laverenålen, indtil den rører bregma. Nul alle koordinater. Flytte nålen sideværts til højre 1,0 mm og forreste 0,3 mm (figur 3A).
- Langsomt drive nålen gennem kraniet lige indtil nålen hul flugter med toppen af kraniet. Igen kan dette gøres på grund af tyndhed mus kraniet. Nul z-koordinat og sænke nålen til -3,0 mm ved en hastighed på 1 mm / sek (figur 3B). Vent 2-3 min for hjernen at tætne omkring nålen.
- Levere den fulde 10 pi ASO med en hastighed på 1 pi per sek. Vent 2-3 min. Vi bruger en 1 pi infusionshastighed for Asos ind i hjertekammeret, selvom denne sats kan variere mellem forskellige lægemidler. Når øve, kontrollere for korrekt placering af kanylen ved at levere 10-20 pi 2,5% FastGreen Dye. Perfundere musen med 1X PBS 0,03% heparin snart efter farvestof infusion og gøre kronafsnit af hjernen for at kontrollere, at farvestoffet i det ventrikulære system (figur 3C). <li> Hold en vatpind mod kraniet ved foden af nålen. Hæv nålen med en hastighed på 1 mm per sekund. Så snart nålen er ude af kraniet, rulle vatpinden over kanylen hullet og holdes i 1 min for at forhindre enhver ASO lække ud.
- Sy lukket hud, anvende antibiotisk salve, og sted musen på opvarmede recovery pad. Afhængig af ASO koncentrationen, kan det tage 20 min til et par timer at komme sig helt.
- Ligesom med pumpen implantation, overvåge musene dagligt efter operationen for at kontrollere smerte / ubehag og infektioner. Behandl med carprofen og antibiotika som det skønnes nødvendigt.
Representative Results
Efter pumpen infusion eller en udpeget tid efter ICV bolusinjektion (vi anvender rutinemæssigt fire uger), er det vigtigt at teste effektiviteten af ASOS. Vi anbefaler, at tage forskellige regioner af hjernen og rygmarven for at måle niveauer / isoformer af målgenet, både på mRNA niveau ved hjælp af kvantitativ real-time PCR samt proteinniveauet med enten Western Blot eller ELISA (figur 4 for en offentliggjort eksempel ). Dette vil hjælpe med at bestemme ASO effektivitet i de forskellige CNS-regioner. Hvis halveringstiden af målrettet protein er lang, anbefaler vi at vente længere efter ASO infusion for at vurdere maksimal protein knockdown eller splejsning.
Det er også vigtigt at teste oligo distribution. Pumpe infusioner resultere i distribution gennem både ipsilaterale og kontralaterale halvkugler, selvom en højere ASO koncentration ofte ses i områder tættere på ventrikulære system 16. ICV bolusinjektioner give en mere uniform fordeling af oligo gennem CNS 16, selvom effekten ikke kan vare så længe. Vi lede læseren til Southwell et al. At se en direkte sammenligning af pumpe versus bolus oligo fordeling 16.
Vi anbefaler også at teste flere doser samt varigheden af virkningen af Asos da hver ASO vil opføre lidt forskelligt in vivo. ASOS har typisk en relativ lang virkningsvarighed, med target knockdown eller splejsning varer flere måneder efter ASO levering. Derudover vil nogle ASOS fungerer bedre end andre, og nogle genmål vil være lettere at knockdown end andre. På grund af dette, når screening ASOS at bestemme den ledende kandidat vi anbefaler at teste mindst 3-5 ASOS in vivo med en n = 4-6 voksne mus pr ASO som en første passage.
Hvis du bruger et lægemiddel bortset Asos, vil det også være vigtigt at piloten den ideelle medikamentkoncentration, narkotika virkningsvarighed, og CNS-medicinfordeling for den specifikke forbindelse.
Tabel 1. Kirurgi Koordinater. Koordinaterne bruges til at ramme højre laterale ventrikel i både mus og rotter, når implanterer osmotiske pumper samt udfører en intracerebroventrikulær (ICV) bolus. Begge koordinater, til pumper og ICV bolus, målrette den højre laterale ventrikel. Vi bruger to forskellige sæt, fordi disse er, hvad vi har mest erfaring med og kender giver fremragende fordeling af ASO.
Figur 1. Stereotaktisk Setup. (A) Den nødvendige stereotaktisk udstyr til Alzet pumpe og bolusinjektion operationer. I) Glass Bead Steriliseresr.. ii) Digital udlæsning. iii) stereotaktisk base med bevægelige arme. iv) temperaturstyret varmepude. v) Isofluran / Oxygen System. vi) Isofluran Chamber. (B) Nærbillede af næsen kegle og øre barer. (C) To vedhæftede påkrævet. Venstre: Syringe / nåleholder til ICV bolusinjektioner. Right: tungeholder Driver til osmotisk pumpe implantation.
Figur 2. ALZET osmotisk pumpe implantation. (A) Alzet osmotisk pumpe muligheder for mus. . 14 dage pumper (0,25 gl / time), 28 dage pumper (0,25 gl / time), 42 dage pumper (0,15 gl / time) (B) Koordinater for pumpe implantation fra bregma: -0.5 mm posterior, -1.1 mm Lateral ( højre), og -2.5 mm Ventral (længde kateter). (C) Efter at have kørt kateteret gennemkranium og limning kanylen, er farvestof skyllet gennem kateteret for at vurdere korrekt placering af kateteret i den laterale ventrikel. (D) perfunderede hjerne umiddelbart efter farvestof administreret som i (C). Hvis kateteret held placeres i ventrikel, vil farvestoffet fordelt i hele mus ventrikulære system.
Figur 3. Intracerebroventrikulær bolusinjektion. (A) Koordinater til bolusinjektion fra bregma: +0.3 mm Forreste, -1.0 mm Lateral (højre) og -3,0 mm ventrale (B) Efter at have kørt nålen gennem kraniet -3.0 mm ventrale er farvestof skubbet gennem sprøjten. at vurdere korrekt placering af nålen i den senere ventrikel. (C) perfunderede hjerne kort efter farvestof administreret som i (B). Hvis nålen held placeres i ventrikel, denfarvestof vil blive fordelt i hele mus ventrikulære system.
Figur 4.. Antisense-oligonukleotider reducere rotte SOD1 in vivo (figur taget direkte fra Smith et al. 7). (AD) Antisense SOD1 oligonukleotider SOD r146192 eller SOD scrambled blev infunderet i 28 dage i den højre laterale ventrikel af normale rotter ved 100 ug / dag. (A) endogene SOD1 mRNA-niveauer fra hjernen og rygmarven, som målt ved QRT-PCR. ( B) SOD1 og A-tubulin protein niveauer efter ASO infusion. (C og D) Protein niveauer for tubulin og SOD1 kvantificeres for de forskellige områder af hjernen efter infusion. (E) ASOS mod presenilin 1 eller GSK-3 & beta; Blev infunderet i 2 uger ind i højre laterale ventrikel non-transgene mus og mRNA niveauer vurderes i højre frontal / temporale cortex. Gengivet med tilladelse fra American Society for Clinical Investigation. Klik her for at se større figur .
Figur 5. Løb Vandret Madras Sutur. 5-0 nylonsutur tråd er vævet ind og ud af huden, begyndende forreste og arbejder posterior koncentrere sig mere over kanylen. Når man først har nået det mest posteriore punkt, er suturtråd derefter bragt tilbage op og skruet over kanylen igen. Dette sikrer korrekt sårlukning og forhindrer kanylen / slangen fra arbejde gennem huden.
Discussion
Evnen til at levere lægemidler globalt i CNS som vist i videoen er en ekstremt kraftfuld teknik, der er let at både lære og bruge. Med praksis, kan en enkelt pumpe implantation eller ICV bolus være afsluttet i 10 minutter, der giver mulighed for store grupper af mus behandles på samme tid. Dette er især nyttigt for studier med en adfærdsmæssig udlæsning, da et større antal for musefunktionsmåde er afgørende for at hjælpe se væsentlige forskelle.
Baseret på vores erfaringer leverer ASOS via pumper og bolus injektioner, har vi observeret nogle fordele og ulemper til hver metode. Det skal bemærkes, at disse er de udtalelser i vores laboratorium og kan ikke være sandt for alle mus og rotte-modeller.
Vi finder en fordel for brug af pumperne er deres evne til at levere en stor mængde ASO siden ASO fordeles over en meget længere periode. Denne regel svarer til længere vedvarende knockdown eller splejsning efter aktivASO infusion, selvom det måske ikke altid er tilfældet. Pumperne også mulighed for en præcis tidsramme på ASO levering (14 dage, 28 dage eller 42 dage), og pumperne kan blive ændret en gang for at tillade endnu længere aktiv ASO infusion. Imidlertid har vi bemærket, at skiftende pumper mere end én gang, forøges variabilitet på grund af dannelsen af fibrøse lommer omkring pumpe, der forhindre pumpen korrekt absorberende væske. En ulempe ved pumperne er, at nogle mus ikke tolererer pumpen samt andre. Hvis den transgene linje, du arbejder med, er mere skrøbelig, kan en pumpe være for besværligt. Pumperne skal også fjernes efter den sidste infusion udsætte musene til en anden kirurgi og tilsatte anæstesi. Hvis gør adfærd arbejde, er det især vigtigt at fjerne pumpen og tillade mindst 1-2 uger for nyttiggørelse eftersom tilstedeværelsen af pumpen vil påvirke nogle adfærd hos mus.
Med ICV bolusinjektioner, er en fordel omkostninger. Der er enupfront investering at købe sprøjter og kanyler, men over tid, er bolusinjektioner mere omkostningseffektive, da der ikke er nogen pumper / slanger / katetre til at købe. Samlet set er der mindre op-holde med ICV bolusinjektioner på grund af mangel på kanyler og pumper. Vi finder også, at ICV bolus kan bruges til at levere ASOS til yngre og / eller mere skrøbelige mus. En ulempe ved ICV bolus er, at det er en enkelt injektion. Ikke så meget samlet ASO kan leveres via denne rute, og hvis varigheden af virkningen af ASO, der anvendes, er kort, vil Knockdown / splejsning virkninger også være kortvarig.
Både de osmotiske pumper samt ICV bolus har kapacitet til at levere ASOS der kan knockdown proteiner eller ændre splejsning af gener i hele gnaver CNS, en teknik, der har bred anvendelse i flere neurovidenskabsbaseret relaterede områder. Vi foreslår lodsning begge metoder levering, hvis du er usikker på hvilken administrationsvej er bedst egnet til din sPECIFIKKE undersøgelse.
Disclosures
Forfatterne modtager deres antisense-oligonukleotider fra Isis Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Curt Mazer fra Isis Pharmaceuticals for at yde rådgivning vedrørende ICV bolus kirurgi, samt Isis Pharmaceuticals som en helhed for at levere vores laboratorium med Asos. Desuden vil vi gerne takke Carey Shaner for at gennemgå denne artikel. TMM og SLD understøttes af NIH Tilskud P50AG005681, K08NS074194 og R01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F.
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
