Summary
Vi beskriver en metod för att rikta läkemedel till det centrala nervsystemet genom att antingen implantera en kateter eller utför en bolusinjektion in i den högra laterala ventrikeln hos möss. Vi fokuserar särskilt på leverans av antisensoligonukleotider. Denna teknik är lätt att anpassa till andra droger och till råttor.
Abstract
På grund av en oförmåga att korsa blod-hjärnbarriären, vissa läkemedel måste levereras direkt in i det centrala nervsystemet (CNS). Vårt labb fokuserar specifikt på antisensoligonukleotider (ASO), men de tekniker som visas i videon här kan också användas för att leverera en uppsjö av andra läkemedel till CNS. Antisensoligonukleotider (ASO) har förmågan att knockdown sekvens-specifika mål 1 samt skift nyckeltal isoformen av specifika gener 2. För att uppnå utbredd gen knockdown eller skarvning i CNS hos möss, kan de ASO levereras in i hjärnan med hjälp av två separata administreringsvägar, både som vi visar i videon.
De första användningarna Alzet osmotiska pumpar, anslutna till en kateter som opereras implanteras i den laterala ventrikeln. Detta medger att ASOs som skall kontinuerligt infunderas in i CNS för en angiven tidsperiod. Den andra innebär en bolusinjektion av en high koncentration av ASO i den högra laterala ventrikeln. Båda metoderna använder musen cerebrala ventrikulära systemet för att leverera ASO till hela hjärnan och ryggmärgen, men beroende på behoven av studien, kan en metod vara att föredra framför den andra.
Introduction
Vissa läkemedel är oförmögna att korsa blod-hjärnbarriären (BBB), som kräver direkt centrala nervsystemet (CNS) leverans. För att kringgå BBB kan läkemedel levereras direkt in i hjärnan med hjälp av de beskrivna metoderna. Medan vårt labb och papperet detaljerade häri fokus på antisensoligonukleotider (ASO), kan andra läkemedel, såsom små molekyler, antikroppar, genvektorer terapi osv., Också tillföras genom exakt samma tillvägagångssätt.
Vissa proteiner spelar en avgörande roll i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar. Sådana proteiner bildar ofta giftiga arter och ackumuleras i aggregat sikt kan leda till nervcellsdöd och efterföljande neurologisk sjukdom 3-4. I ett försök att bromsa eller stoppa utvecklingen av dessa sjukdomar, kan ett terapeutiskt alternativ vara att direkt rikta och minska det orsakande proteinet. Emellertid är dessa proteiner ofta ubiquitously genom CNS, gör det svårt att e ffectively inrikta dem på en global skala.
För att rikta gener i hela CNS, administrera vi ASO i mus cerebrospinalvätska (CSF) via den laterala ventrikeln att kringgå BBB. Denna specifika metod utnyttjar musen ventrikulära systemet som badar hela hjärnan och ryggmärgen, så bred distribution av ASOs. Vi använder ASOs som är 18 till 20-mer RNA-liknande molekyler som direkt binder sekvensen mål-mRNA och, beroende på ASO kemiska modifikationer, antingen A) rekrytera RNas-H för att bryta ned mRNA leder till knockdown eller B) skifta alternativ splitsning en , 2,16,17. Det bör noteras att multipla molekyler finns för att taga isär en specifikt protein in vivo, inklusive shRNA. Eftersom dessa molekyler är inte i fokus för denna artikel, hänvisar vi läsaren att granska artiklar som bättre detalj knockdown verkningsmekanismer och fördelar / nackdelar med varje 5-6.
jove_content "> I tidigare arbete har vi använt ASOs att rikta proteinet superoxiddismutas 1 (SOD1) i en transgen råtta modell av amyotrofisk lateralskleros (ALS) 7 (Figur 4). Mutationer i SOD1 förekommer hos cirka 2% av alla ALS fall 8, även om det har nyligen antagit att SOD1 kan spela en viktig roll i sporadisk ALS samt 9-10. Genom att minska de totala SOD1 nivåer i ALS transgena råttor, överlevnad efter insjuknandet var signifikant ökat 7. Dessa viktiga uppgifter var den första att visa att en ASO behandling i CNS kan ha en djupgående positiv inverkan på en neurologisk sjukdom modell. Sedan dess har ASO riktade mot mänskliga SOD1 in och framgångsrikt slutfört en fas I kliniskt försök med minimala biverkningar (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , som presenterades på 2012 64: e årliga American Academy of Neurology. planer på att flytta ASOs fram till fas II-studier pågår.I samtliga dessa studier var ASO levereras till den laterala ventrikeln för att minska de totala gen nivåer eller ändra gensplitsning genomhela CNS. Både osmotiska pumpar och en bolusinjektion kan användas för att leverera ASOs till CSF. Pumpar möjliggöra en långsam, kontinuerlig leverans, medan intracerebroventrikulära (ICV) bolus är en snabb, engångs injektion. Vi har använt båda dessa metoder med framgång, även om vi inte har rapporterat direkt jämförelse mellan pump och bolus i en enda transgen linje.
Använda ASOs i CNS är ett kraftfullt sätt att minska de totala protein nivåer och / eller ändra skarvning av flera proteiner. Medan vi använder ASOs uteslutande som en behandling för neurologiska sjukdomar, inser vi att andra områden också kan dra nytta av denna teknik. Så länge som proteinet av intresse uttrycks i CNS och det slutliga målet är att uppnå CNS-breda förändringar i genuttryck, använder ASOs i de påvisade tekniker kan vara mycket användbar.
Protocol
Protokollet nedan har godkänts av Institutional Animal Care och kommittéer Använd vid Washington University i St Louis och är i överensstämmelse med National Institutes of Health riktlinjer för användningen av försöksdjur. Om detta är första gången du utför operationer, rekommenderar vi att titta på JUPITER artikeln på gnagare operationer som en introduktion innan 14.
ASOs kan levereras till musen CNS genom både osmotisk pump infusion och en enda ICV bolusinjektion. På grund av detta är det förfarande som beskrivs nedan delas upp i två segment. För-och nackdelar för varje metod kommer att beröras i diskussionen avsnittet. Koordinaterna används i protokollen är för vuxna C57BL6 och B6C3 möss. Motsvarande rått-koordinater kan hittas i tabell 1.
ALZET osmotisk pump
Ett. Framställning av Alzet osmotiska pumpar
- Fastställa en steril drape och försiktigt släppa följande föremål på den samtidigt som man inte direkt röra något för att bibehålla sterilitet: osmotisk pump (ar), flödesmodulatorenhet (s), 1 ml steril spruta (s), skalpell blad och delar av slangen (1 slang = 5 pumpar). För möss, finns det tre alternativ för pumpar: 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar (Figur 2A).
- Ta bort skyddet och fylla sterila 50 ml koniska rör med 15 till 20 ml saltlösning. Upp till 6 monterade pumpar kan läggas per koniskt rör.
- Fyll en p60 petriskål med 100% etanol. Lägg lämpligt antal katetrar till etanolen. För möss är kateter längd 2,5 mm.
- Filtrera varje ASO in så många 1,5 ml Eppendorf-rör som behövs. Inkludera ett Eppendorf-rör fyllt med steril 0,9% saltlösning för att fylla slangen med.
- När allt är förberett, sätta på sterila handskar. Se till att inte röra någonting som inte är steril. Byt handskar vid behov.
- För varje ASO som ska användas, fylla en 1 ml sprutaoch loadpumps genom att placera nålen i det övre hålet och långsamt fylla tills överskott läcker ut. Fortsätt tills alla av pumparna är fyllda.
- Ta av locket från flow-modulatorer och sätt in i pumparna. Skjut flow-modulator nästan hela vägen in och lämnar en 3-5 mm mellanrum.
- Med hjälp av skalpell blad, skär varje bit av slangen i fem lika stora delar. Ta ett rörstycke, fyll med steril koksaltlösning med användning av en 1 ml spruta, och för in den övre delen av flödesmodulatom in i en ände av slangen. Ta sedan en kanyl från etanol och anslut den till den andra änden av slangen. Pumpen är nu helt monterad.
- Placera helt monterade pumpen i sterila 50 ml koniska rör med koksaltlösning för priming. Den priming tillåter pumparna att suga upp vätska att initiera tillförsel av läkemedel samt kommit till rätt temperatur. Priming tid: 14 dagars pumpar: 4-6 tim, 28 dagars pumpar: 40 tim, 42 dagars pumpar: 60 tim. När du är klar monterar pumparna, Cap de koniska rör och placera i en ren37 ° C vattenbad tills kirurgi.
2. Pre-kirurgisk Procedur
- Torka allt ned med 70% etanol för att sterilisera området och fastställa sterila dukar på bordsskivan och stereotax att skapa ett sterilt område. Det är viktigt att vara uppmärksam på det sterila fältet under hela operationen. Slå på följande: pärla autoklav, Värmedyna, ljus, digital avläsning, och syre / isofluran System (Figur 1).
- Följande punkter kommer att krävas om att göra antingen en enstaka operation eller en hel sats av operationer som vi rutinmässigt gör: 1 pincett, 1 böjd hemostat, 1 par små saxar, 1 par små böjda trubbiga saxar, 1 råtta ben cutter , 1 rakt hemostat, 5-0 nylonsuturer, 1 koniska rör med 70% etanol, 1 koniska rör med 95% etanol, 1 koniska rör med jod, 1 koniska rör med väteperoxid, förpackning av sterila bomullspinnar, 1 flaska super lim, 1 tub antibiotisk salva, en tub av ögatsmörjmedel, och en rakapparat.
- Placera spetsen på båda saxar, pincetter och böjda hemostat till pärla autoklav för 15 sek. Ta ur och sätt i 70% etanol. Man utför mer än en operation, omsterilisera spetsarna på instrument mellan djur.
- Vrid isofluran till 4% och 2 TILL 0,4 l / min och direkt gasflöde till kammaren. Vi har vår isofluran / syre-systemet kalibreras minst en gång om året för att säkerställa att vi levererar rätt mängd anestesi. Placera musen i kammaren och vänta tills andningen är betydligt långsammare. Ta musen och utföra en tå nypa för att musen är helt medvetslös.
- Raka håret från toppen av axeln upp till i mellan ögonen. Om musen börjar vakna upp, placera musen tillbaka in i kammaren förrän musen är helt medvetslös igen, bekräftar med en tå nypa. Placera sövda musen på stereotax och tryck noskonen över näsan.Var försiktig eftersom de tänder och ben är sköra.
- Rikta gasflöde till stereotax att hålla musen sövd. Det är viktigt att då och då kontrollera att musen är helt medvetslös med en tå nypa hela operationen. Fäst huvudet med örat barer. Vi föredrar utjämning örat barer, men att rikta den laterala ventrikeln, är en helt jämn skalle inte är nödvändigt på grund av den stora storleken på kammaren.
- Vrid isofluran nivå ned till 2,0% för underhåll. Dab ögonsalva på varje öga. Såsom ses i videon, låg en steril duk istället för musen så att endast basen av halsen och huvudet är exponerade. Sedan desinficera kirurgiska området genom att torka av toppen av huvudet och nacken i en cirkulär rörelse med början i mitten av det rakade området och flytta utåt först med en bomullstuss doppad i 95% etanol, följt av en bomullstuss doppad i jod.
- Vi rekommenderar att du använder en rektal sond återkoppling temperaturkontrollerad värmesystem som säkerställertemperaturen hos musen förblir vid en stabil 37 ° C. Om temperaturen av musen minskar under operation, kan den efter operationen återhämtningen tar längre tid och den resulterande hypotermi kan leda till avvikande proteinaktivitet, inklusive hyperfosforylering av mikrotubuli-associerat protein Tau 15. När du har installerat värmesystem, är du nu redo att börja operationen.
Tre. Implantation av Alzet osmotisk pump
- Innan operationen, sätta på ett par nya sterila handskar. Sedan, med hjälp av pincett och en liten sax, gör ett snitt i huden från basen av halsen ovanför djurets skallen till upp i mellan ögonen
- Ta trubbiga saxen med kurvan uppåt och skjut under huden vid basen av nacken bakåt mot vänster bakben. Det bör inte finnas något motstånd. Om det finns, ta saxen och försök igen. Detta bildar den subkutana ficka för den osmotiska pumpen.
- Wipe skallen ren med sterila bomullspinnar, följt av en bomullstuss doppad i väteperoxid för att öka bregma.
- Torka de 50 ml koniska rör som innehåller pumpar för att upprätthålla steriliteten av pumparna. Försiktigt ta en pump från koniska röret med hjälp av böjda hemostat, tar extra omsorg att pumpen inte vidrör sidorna på koniska rör. Håll basen av pumpen med pincett och tryck flödesmodulatom i resten av vägen med den krökta hemostat.
- Håll pumpen där flödesmodulatom och slang träffa krökta hemostat. Sätt pumpen under huden vid basen av nacken och skjut den tillbaka mot vänster bakben så långt det går utan motstånd. Var noga med att inte låta någonting kateter touch.
- Med böjda hemostat, greppa kanylen på spåret där toppen möter sockeln. Flytta kanylen föraren på plats och säkra på plats.
- Placera en enda droppe superlim på basen av kanylen. Push toppen av kanylen in i drivsteget och position för att röret riktas rakt tillbaka.
- Tryck kateterspetsen till bregma och noll koordinaterna på den digitala displayen. Höj katetern och flytta 1,1 mm i sidled åt höger och 0,5 mm posteriort (Figur 2B). Håll huden ur vägen med den krökta hemostat.
- Kör den tunna metallfilmen katetern genom skallen tills plasten kanylen basen är ordentligt tryckt mot toppen av skallen. Metallen katetern kan drivas direkt genom skallen i möss på grund av den relativa tunna skallen. Om du använder råttor, borra ett hål i skallen innan du sänker katetern.
- Dra någon hud som har lim på den bort från skallen. Med kanylen föraren håller kanylen / katetern på plats, vänta 1-2 minuter för limmet torka helt.
- När du tränar, för att bedöma kateterplacering, injicera 20-40 il 2,5% FastGreen Dye genom slangen (figur 2C). Vänta 2-3 min, perfuse musen med 1X PBS 0,03% heparin, och ta bort hjärnan. Skär koronalt vid kateterstället. Om katetern placerades i ventrikeln kommer färgämnet perfuseras hela mus ventrikulära systemet (Figur 2D).
- Håll katetern på plats med den krökta hemostat samtidigt höja föraren. Släpp långsamt hemostat att kanylen sitter ordentligt fast i skallen.
- Med en bomullstopp, tryck nedåt på toppen av kanylen. Montera Clippers råtta ben i skåran mellan toppen och botten av kanylen. Klipp av toppen av kanylen samtidigt trycker ner med bomullspinne. Försök att hålla den Clippers nivå för att inte att lösgöra kanylen från skallen. Om kanylen Kommer Olimmad, snabbt re-lim och pressa med en bomullspinne i ytterligare 2 minuter.
- Använda 5-0 sutur tråd, regelbunden hemostat och pincett, sutur längs hela öppningen, betala extra uppmärksamhet rätt över kanylen. Vi använder en running horisontell madrass sutur (se figur 5) på grund av den större snitt över skallen.
- Applicera en klick antibiotisk salva över huvudet och nacken. Skruva av örat barer och lossa noskonen. Ta bort musen från stereotax och placera på en värmande dyna för återhämtning. Övervaka mössen noggrant under hela återhämtningen, vanligen mellan 10-30 minuter. Kontrollera var 2-3 minuter tills musen börjar gå runt och grooming själv.
4. Postoperativ vård
- Övervaka mössen dagligen efter operationen för den första veckan.
- Om en mus verkar vara i smärta eller ångest, rekommenderar vi att ge musen med en 5 mg / kg subkutan injektion av Carprofen gång varje 24 timmar för upp till 5 dagar för att lindra smärtan.
- Om det verkar vara en infektion, generöst tillämpa antibiotisk salva till området dagligen och rådfråga en Delta Veterinär för att säkerställa att såret ordentligt läker.
- REFlytta 5-0 nylonsutur 7-10 dagar efter operation för att förhindra irritation från suturtråd.
Fem. Ändra eller ta bort Alzet osmotisk pump
Efter pumpen görs aktivt infusing ASO, kan den antingen ändras eller fullständigt avlägsnas.
- Följ samma pre-kirurgi förfarande som ovan med följande ändringar: 1) Du behöver inte de böjda sax, böjd hemostat, råtta fräsar ben, eller den digitala displayen, och 2) i stället för prepping huvudet av musen, rakning och desinficera baksidan av musen vid korsningen av pumpen och slangen.
- Gör en 1,5 cm snitt på baksidan av musen, vinkelrätt till pumpen / slangen korsningen, med hjälp av pincett och sax. Dra försiktigt ut pumpen ur snittet utan att signifikant dra / trycka på slangen eftersom det kan jar katetern.
- För att ta bort pumpen, klippa slangen ca 0,5 cm ovanför flödesmodulatom och röra superlim för att slangen to tätning det stängs. Vänta 1-2 minuter för limmet att torka. Placera slangen tillbaka in i snittet och sutur avstängning. Dab antibiotisk salva på sys huden och placera muspekaren över en uppvärmd återhämtning pad.
- Byte av pump, har nyligen gjort pumpar redo tillsammans med en 10 cm skål fylld med 95% etanol. Katetrar behövs inte med de nya pumparna.
- Skaffa en ny pump med pincett. Doppa fingrarna i etanolen, ta tag i pumpen, och kassera flödet-modulator. Sedan, försiktigt och långsamt dra bort den gamla pumpen från flödesmodulatom fäst slangen och kanylen. Så snart den är avstängd, sakta glida den nya pumpen, se till att flödesmodulatom aldrig nuddar utsidan av musen.
- Sätt tillbaka den nya pumpen genom snittet tillbaka i den subkutana paketet och sutur i huden. Dab antibiotisk salva på såret och placera musen på återvinning pad.
- Precis som med pumpen implantation, övervaka mössen dagligen efter operationen för att kontrollera för pain / obehag och infektioner. Behandla med Carprofen och antibiotika som anses nödvändiga.
ICV BOLUS
6. Pre-kirurgisk Procedur
- Följ samma pre-kirurgi förfarande som i avsnitt 2 ovan med följande ändringar: 1) Du behöver inte böjd sax, böjd hemostat eller råtta fräsar ben, 2) Rengör en 10 pl Hamilton spruta och nål med steriliserat vatten och belastning med ASO, och 3) fästa sprutan och nålen till stereotaktisk apparat där kanylen föraren var belägen.
7. Bolusinjektion av ASO
- Använd pincett och en liten sax, gör ett snitt från basen av halsen upp i mellan ögonen.
- Torka skallen ren med sterila bomullspinnar, följt av en bomullstuss doppad i väteperoxid för att öka bregma.
- Flytta sprutan / nålen på plats och säkra. Se till att det avfasade delen av nålen vänd bakre. Lägrenålen tills den rör bregma. Nollställ alla av koordinaterna. Flytta nålen lateralt åt höger 1,0 mm och främre 0,3 mm (figur 3A).
- Kör sedan nålen genom skallen bara tills nålen hålet är i jämnhöjd med toppen av skallen. Återigen kan detta göras på grund av den tunnhet av musen skallen. Nollställ z-koordinat och sänka nålen till -3,0 mm med en hastighet av 1 mm / sek (fig 3B). Vänta 2-3 min för hjärnan att täta runt nålen.
- Leverera hela 10 pl av ASO med en hastighet av 1 | il per sekund. Vänta 2-3 minuter. Vi använder en 1 pl infusionshastighet för ASOs in i kammaren, även om denna andel kan variera mellan olika läkemedel. När du tränar, kontrollera korrekt placering av nålen genom att leverera 10-20 il 2,5% FastGreen Dye. BEGJUTA mus med 1X PBS 0,03% heparin snart efter färgämne infusion och göra koronala delar av hjärnan för att kontrollera att färgämnet är i det ventrikulära systemet (fig 3C). <li> Håll en bomullstuss mot skallen vid basen av nålen. Höj nålen med en hastighet av 1 mm per sekund. Så snart nålen är ur skallen, rulla bomullstuss över nålen hålet och håll i 1 minut för att förhindra ASO från att läcka ut.
- Sutur huden stängd, tillämpa antibiotisk salva, och placera muspekaren på uppvärmda återhämtning pad. Beroende på ASO-koncentrationen, kan det ta 20 minuter till ett par timmar att återhämta sig helt.
- Precis som med pumpen implantation, övervaka mössen dagligen efter operationen för att kontrollera smärta / obehag och infektioner. Behandla med Carprofen och antibiotika som anses nödvändiga.
Representative Results
Efter pumpinfusion eller en bestämd tid efter ICV bolusinjektion (vi rutinmässigt använder fyra veckor), är det viktigt att testa effekten av ASOs. Vi rekommenderar att olika regioner av hjärnan och ryggmärgen att mäta nivåer / isoformer av målgenen, såväl på mRNA-nivå med hjälp av kvantitativ realtids-PCR samt proteinnivå med hjälp av antingen Western Blot eller ELISA (Figur 4 för en publicerad exempel ). Detta kommer att bidra till att avgöra ASO effektiviteten i de olika CNS-regioner. Om halveringstiden för den riktade proteinet är lång, råder vi väntar längre efter ASO infusion för att bedöma maximal protein knockdown eller skarvning.
Det är också viktigt att testa oligo distribution. Pump infusioner resultera i distribution via både ipsilateral och kontralateral halvklotet, även om en högre ASO koncentration ses ofta i områden närmare ventrikulära systemet 16. ICV bolus injektioner ge en mer uniformrm distribution av oligo genom CNS 16, även om effekterna inte kan pågå så länge. Vi styra läsaren till Southwell et al. Att se en direkt jämförelse av pump kontra bolus oligo fördelning 16.
Vi rekommenderar även testa flera doser samt duration av ASOs eftersom varje ASO beter något annorlunda i vivo. ASOs har normalt en relativt lång verkningstid, med målet knockdown eller skarvning varar flera månader efter ASO leverans. Dessutom kommer vissa ASO fungerar bättre än andra och vissa genmål blir lättare att knockdown än andra. På grund av detta, när screening ASO att bestämma den bly-kandidaten, rekommenderar vi testa åtminstone 3-5 ASOs in vivo med en n = 4-6 vuxna möss per ASO som en första passage.
Om du använder ett läkemedel än ASOs, blir det också viktigt att lotsa den perfekta drogen koncentrationen, drog verkningstid, och CNS-läkemedelfördelningen för den specifika föreningen.
Tabell 1. Kirurgi Koordinater. Koordinaterna används för att träffa rätt laterala ventrikeln hos både möss och råttor vid implantation osmotiska pumpar samt utför en intracerebroventrikulär (ICV) bolus. Både koordinater, för pumpar och ICV bolus, rikta rätt laterala ventrikeln. Vi använder två olika uppsättningar eftersom dessa är vad vi har mest erfarenhet och vet ger utmärkt fördelning av ASO.
Figur 1. Stereotaxic Setup. (A) Den nödvändiga stereotaktisk utrustning för Alzet pump och Bolus operationer injektion. I) glaspärla Steriliserar.. ii) digital avläsning. iii) Stereotaxic bas med rörliga armar. iv) temperaturstyrd värmedyna. v) isofluran / Oxygen System. VI) isofluran kammare. (B) Närbild av noskonen och barer örat. (C) Två bilagor som krävs. Vänster: Spruta / nål hållare för ICV bolusinjektioner. Höger: Kanyl Driver för osmotisk pump implantation.
Figur 2. Alzet osmotisk pump implantation. (A) Alzet osmotisk pump alternativ för möss. . 14 dagars pumpar (0,25 l / h), 28 dagars pumpar (0,25 l / h), 42 dagars pumpar (0.15 l / tim) (B) Koordinater för pump implantation från bregma: -0.5 mm posteriort, -1.1 mm Lateral ( höger), och -2,5 mm Ventrala (längd kateter). (C) Efter körning katetern genomskalle och limning kanylen, är färgämnet spolas genom katetern för att bedöma korrekt placering av katetern i den laterala ventrikeln. (D) perfuserade hjärnan omedelbart efter färgämne administreras som i (C). Om katetern är framgångsrikt placerad i kammaren, kommer färgen att distribueras över hela musen ventrikulära systemet.
Figur 3. Intracerebroventrikulär bolusinjektion. (A) Koordinater för bolusinjektion från bregma: +0.3 mm Anterior, -1.0 mm Lateral (höger), och -3,0 mm Ventral (B) Efter att ha kört nålen genom skallen -3,0 mm ventralt, är färgämnet drev igenom sprutan. att bedöma korrekt placering av nålen i den senare kammaren. (C) perfuserade hjärna kort efter färgämne administreras som i (B). Om nålen har placerats i kammaren, denfärgämnet kommer att distribueras över hela musen ventrikulära systemet.
Figur 4. Antisensoligonukleotider minska råtta SOD1 in vivo (figur tas direkt från Smith et al. 7). (AD) Antisense SOD1 oligonukleotider SOD r146192 eller SOD scrambled infunderades under 28 dagar in i den högra laterala ventrikeln hos normala råttor vid 100 | ig / dag. Mätt med QRT-PCR (A) Endogenous SOD1 mRNA-nivåer från hjärnan och ryggmärgen. ( B) SOD1 och a-tubulin-proteinnivåer efter ASO infusion. (C och D) Proteinnivå för tubulin och SOD1 kvantifieras för olika regioner av hjärnan efter infusionen. (E) ASOs mot presenilin 1 eller GSK-3 & beta; Infunderades under 2 veckor i den högra laterala ventrikeln av icke-transgena möss och mRNA-nivåer utvärderade i höger frontal / temporal cortex. Reproducerad med tillstånd från American Society for Clinical Investigation. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Running Horisontell Madrass Suture. 5-0 nylonsutur tråden är vävt in och ut ur huden, med början anterior och arbetar posterior, koncentrera mer över kanylen. När väl har nått den mest bakre punkt, är suturtråden sedan tagit tillbaka upp och gängas över kanylen en gång till. Detta säkerställer korrekt sårtillslutning och förhindrar kanylen / slangen från att arbeta genom huden.
Discussion
Förmågan att leverera läkemedel globalt i CNS som visas i videon är en extremt kraftfull teknik som är lätt att både lära sig och använda. Med lite övning kan en enda pump implantation eller ICV bolus fyllas i 10 min, vilket möjliggör stora kohorter av möss som behandlas samtidigt. Detta är särskilt användbart för studier med en beteendevetenskaplig avläsning, som större siffror för musen beteende är avgörande för att hjälpa se betydande skillnader.
Baserat på våra erfarenheter levererar ASOs via pumpar och bolusinjektioner, har vi observerat några fördelar och nackdelar med varje metod. Det bör noteras att dessa yttranden i vårt labb och kan inte vara sant för alla mus och råtta modeller.
Vi finner en fördel med användning av pumparna är deras förmåga att leverera en stor mängd av ASO eftersom ASO fördelas över en mycket längre tidsperiod. Detta motsvarar vanligtvis längre ihållande knockdown eller skarvning efter aktivASO infusion, även om detta inte alltid vara fallet. Pumparna tillåter också för en exakt tidsram för ASO leverans (14 dagar, 28 dagar, eller 42 dagar) och pumparna kan ändras en gång för att möjliggöra ännu längre aktiv ASO infusion. Men vi har märkt att byta pumpar mer än en gång ökar variationen på grund av bildandet av fibrösa fickor runt pumpen som hindrar pumpen från korrekt absorbera vätska. En nackdel av pumparna är att vissa möss inte tolerera pumpen såväl som andra. Om transgen linje du arbetar med är mer bräcklig, kan en pump vara alltför betungande. Pumparna måste också tas bort efter den slutliga infusionen, utsätta mössen till en annan operation och tillsatta anestesi. Om att göra beteendet arbete, är det särskilt viktigt att ta bort pumpen och låt minst 1-2 veckors återhämtning eftersom närvaron av pumpen kommer att påverka vissa beteenden i mössen.
Med ICV bolus injektioner, är en fördel kostnad. Det finns eninitial investering att köpa sprutor och nålar, men med tiden, Bolusinjektioner är mer kostnadseffektivt eftersom det inte finns några pumpar / slangar / katetrar att köpa. Sammantaget finns det mindre upp-hålla med ICV bolusinjektioner på grund av bristen av kanylerna och pumpar. Vi finner också att ICV bolus kan användas för att leverera ASOs till yngre och / eller mer ömtåliga möss. En nackdel med ICV bolus är att det är en enda injektion. Inte så mycket övergripande ASO kan levereras via denna väg, och om varaktigheten av verkan av ASO som används är korta, kommer knockdown / skarvning effekter också vara kortlivad.
Både osmotiska pumpar samt ICV bolus har förmågan att leverera ASOs som kan knockdown proteiner eller ändra skarvning av gener i hela gnagare CNS, en teknik som har breda tillämpningar inom flera neurovetenskap-relaterade områden. Vi föreslår att lotsa båda metoderna för leverans om du är osäker på vilken administreringsväg som passar bäst för din specifika studie.
Disclosures
Författarna får sina Antisensoligonukleotider från Isis Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Vi vill tacka Curt Mazer från Isis Pharmaceuticals för rådgivning avseende ICV bolus kirurgi, liksom Isis Pharmaceuticals som en helhet för att förse vårt labb med ASOs. Vidare skulle vi vilja tacka Carey Shaner för att granska den här artikeln. TMM och SLD stöds av NIH bidrag P50AG005681, K08NS074194 och R01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F.
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
