Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Summary

Vi beskriver en metode for å målrette medikamenter til sentralnervesystemet ved enten å implantere et kateter eller utfører en bolus-injeksjon i den høyre laterale ventrikkel hos mus. Vi fokuserer spesielt på levering av antisens oligonukleotider. Denne teknikken er lett tilpasses til andre narkotiske stoffer og til rotter.

Abstract

På grunn av en manglende evne til å krysse blod-hjerne barrieren, visse medikamenter må leveres direkte inn i det sentrale nervesystemet (CNS). Laboratoriet fokuserer spesifikt på antisens oligonukleotider (Asos_hfm), selv om de teknikker som er vist i video her kan også brukes for å levere en mengde andre stoffer til CNS. Antisens oligonukleotider (Asos) har evnen til knockdown sekvens-spesifikke mål ¹ samt skift Isoform prosenter av spesifikke gener ^to. For å oppnå utbredt genet knockdown eller skjøting i CNS av mus, kan de Asos bli levert inn i hjernen ved hjelp av to separate ruter av administrasjonen, både som vi viser i videoen.

Den første bruker Alzet osmotiske pumper, koblet til et kateter som er kirurgisk implantert i den laterale ventrikkel. Dette gjør at Asos til å være kontinuerlig tilført i CNS for en angitt tidsperiode. Det andre er en enkelt bolusinjeksjon av en hiGH konsentrasjon av ASO i den høyre laterale ventrikkel. Begge metodene bruke musen cerebral ventrikkel som leverer den ASO til hele hjernen og ryggmargen, skjønt avhengig av behovene i studien, kan en metode være å foretrekke over den andre.

Introduction

Noen stoffer er i stand til å krysse blod-hjerne barrieren (BBB), som krever direkte sentralnervesystem (CNS) levering. For å omgå BBB, kan medikamenter bli levert direkte til hjernen ved hjelp av de beskrevne metoder. Mens vår lab og papiret detaljert her fokus på antisens Oligonukleotider (Asos), kan andre stoffer, for eksempel små molekyler, antistoffer, genterapi vektorer, osv.., Også leveres gjennom den eksakt samme tilnærming.

Visse proteiner spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative sykdommer. Slike proteiner ofte danne giftige arter og samle inn aggregater, som fører til eventuell neuronal død og påfølgende nevrologiske sykdommer ^3-4. I et forsøk på å forsinke eller stanse utviklingen av slike sykdommer, kan en terapeutisk alternativ for å være direkte rettet mot og redusere den utløsende protein. Imidlertid er disse proteinene ofte finnes overalt gjennom CNS, noe som gjør det vanskelig å e ffectively målrette dem på en global skala.

For å målrette gener gjennom hele CNS, administrere vi Asos inn mus cerebrospinalvæsken (CSF) via den laterale ventrikkel å omgå BBB. Denne spesifikke metode utnyttet mus ventrikulære systemet som bader hele hjernen og ryggmargen, slik utbredt fordeling av Asos_hfm. Vi bruker Asos_hfm som er 18-20 KD RNA-lignende molekyler som direkte binder mål-mRNA-sekvensen og, avhengig av ASO-kjemiske modifikasjoner, enten a) rekruttere RNase-H til å degradere det mRNA som fører til knockdown eller B) skifte ^en alternativ spleising ^{, 2,16,17.} Det bør bemerkes at flere molekyler finnes for å slå ned et bestemt protein in vivo, inkludert shRNA. Siden disse molekylene er ikke fokus for denne artikkelen, pålegger vi leser en anmeldelse av artikler som bedre detalj knockdown virkningsmekanismer og de ​​fordeler / ulemper ved hver ^5-6.

jove_content "> I tidligere arbeid, har vi brukt Asos å målrette protein superoksyddismutase 1 (SOD1) i en transgen rotte modell av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) ⁷ (figur 4). Mutasjoner i SOD1 forekommer hos ca 2% av alle ALS ⁸ tilfeller, skjønt det er nylig blitt hypotese at SOD1 kan spille en viktig rolle i sporadiske ALS samt ^9-10. Ved å redusere total SOD1 nivåer i ALS transgen rotte, overlevelse etter utbruddet var signifikant økt ^7.. Disse viktige data var de første å vise at en ASO behandling i CNS kan ha stor positiv innvirkning på en nevrologisk sykdom modell. Siden da har Asos rettet mot menneskelige SOD1 registrert og fullført en fase I kliniske studie med minimale bivirkninger (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , som presentert på 2012 64 ^th Annual American Academy of Neurology. Planer om å flytte Asos frem til fase II studier pågår.

11,12. Disse skjøting ASOS er nå i fase I kliniske studier hos barn med SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). I tillegg ble det nylig vist at forbigående administrasjon av Asos rettet mot huntingtin genet var i stand til å dramatisk redde Huntingtons mus modell, selv etter at huntingtin protein nivåer tilbake til baseline ^13.

I alle disse studiene ble Asos_hfm levert til den laterale ventrikkel for å redusere den totale genet nivåer eller alter-genet gjennom spleisinghele CNS. Både osmotiske pumper og en enkelt bolusinjeksjon kan brukes til å levere Asos_hfm til CSF. Pumper gi en treg, kontinuerlig levering, mens intracerebroventrikulær (ICV) bolus er en rask, engangs injeksjon. Vi har benyttet begge disse metoder med suksess, selv om vi ikke har rapportert det direkte sammenligning mellom pumpen og bolus i en enkelt transgene linje.

Ved hjelp av Asos i CNS er en effektiv måte å redusere mengden av totalt protein og / eller endring sammensying av flere proteiner. Mens vi bruker Asos utelukkende som en behandling for nevrologiske lidelser, erkjenner vi at andre felt kan også dra nytte av denne teknikken. Så lenge protein av interesse er uttrykt i CNS og det endelige målet er å oppnå CNS-wide endringer i genuttrykk, ved hjelp av Asos i den påviste teknikker kan være svært nyttig.

Protocol

Protokollen nedenfor er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer ved Washington University i St. Louis og er i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for bruk av forsøksdyr. Hvis dette er første gang du utfører operasjoner, anbefaler vi å se på Jove artikkel om gnager operasjoner som en introduksjon før du begynner ^14.

Asos kan leveres til musen CNS gjennom både osmotisk pumpe infusjon og et enkelt ICV bolusinjeksjon. På grunn av dette, er prosedyren beskrevet nedenfor deles opp i to segmenter. Fordeler og ulemper for hver metode vil bli berørt i diskusjonen delen. Koordinatene som brukes i protokollene er for voksen C57BL6 og B6C3 mus. Tilsvarende rotte koordinater kan finnes i tabell 1.

ALZET osmotisk PUMPE

En. Utarbeidelse av Alzet osmotiske pumper

1. Legge ned en steril drape og nøye slippe følgende elementer på det mens du tar vare ikke å direkte berøre noe for å opprettholde sterilitet: osmotisk pumpe (r), mengde modulator (s), 1 ml steril sprøyte (r), skalpell blad, og deler av slange (1 stykke rør = 5 pumper). For mus, er det tre alternativer for pumper: 14 dager, 28 dager og 42 dager (Figur 2A).
2. Korken og fyll sterile 50 ml koniske rør med 15-20 ml saltløsning. Opptil seks monterte pumpene kan legges per konisk tube.
3. Fyll en p60 petriskål med 100% etanol. Legg passende antall av kateter til etanolen. For mus er kateterets lengde, 2,5 mm.
4. Filtrer hver ASO i like mange 1,5 ml Eppendorf-rør etter behov. Omfatte en Eppendorf rør fylt med steril 0,9% saltoppløsning for å fylle røret med.
5. Når alt er forberedt, ta på sterile hansker. Pass på å ikke røre noe som ikke er sterile. Skift hansker som nødvendig.
6. For hver ASO som skal brukes, fylles i en 1 ml sprøyteog loadpumps ved å plassere nålen inn i den øverste hullet og sakte fylling inntil overskytende lekker ut. Fortsett inntil alle pumpene er fylt.
7. Korken flyten-modulatorer og sette inn i pumpene. Skyv flyt-modulator nesten hele veien inn, og etterlater et 3-5 mm gap.
8. Ved hjelp av skalpell blad, kutt hver slange inn i 5 like deler. Ta en slange, fyll med sterilt saltvann ved hjelp av en 1 ml sprøyte, og øvre del av flyten-modulator i en ende av slangen. Så kanyle fra etanol og koble den til den andre enden av slangen. Pumpen er nå ferdig montert.
9. Plasser ferdig montert pumpe inn i sterile 50 ml konisk tube med saltvann for grunning. Under fyllingen gjør at pumpens å suge opp væske for å initiere levering av legemidler samt komme til riktig temperatur. Priming tid: 14 dag pumper: 4-6 t, 28 dagers pumper: 40 t, 42 dagers pumper: 60 hr. Når du er ferdig montering av pumper, cap koniske rør og plasseres i en ren37 ° C vannbad inntil operasjon.

2. Pre-kirurgisk prosedyre

1. Tørke alt med 70% etanol for å sterilisere område og legge ned sterile forheng på bordplaten og stereotax å skape et sterilt felt. Det er viktig å være oppmerksom på det sterile området gjennom hele operasjonen. Slå på følgende: Bead Sterilizer, Oppvarming Pad, lys, digital avlesning, og Oxygen / isofluran System (figur 1).
2. Følgende elementer vil være nødvendig hvis du gjør enten en enkelt operasjon eller en hel gruppe med operasjoner som vi rutinemessig gjør: en pinsett, en buet hemostat, 1 par små saks, en par små buede avstumpet saks, en rotte bein cutter , en rett hemostat, 5-0 nylon sting, en konisk rør med 70% etanol, en konisk tube med 95% etanol, en konisk tube med jod, en konisk tube med hydrogen peroxide, pakke av sterile bomullspinner, en flaske med super lim, en tube antibiotisk salve, en tube av øyetsmøremiddel, og en barbermaskin.
3. Plasser tuppen av begge sakser, pinsetter og buet hemostat inn i perle sterilisator for 15 sek. Ta ut og legg i 70% etanol. Når du utfører mer enn én operasjon, re-sterilisere tips av instrumentene i mellom dyr.
4. Drei isofluran til 4% og O ₂ til 0,4 l / min og direkte gasstrømmen til kammeret. Vi har vår isofluran / oksygen system kalibreres minst ett år for å sikre at vi leverer riktig mengde anestesi. Plasser musen i kammeret og vente til pusting er betydelig redusert. Ta musen og utføre en tå klype for å sikre at musen er helt bevisstløs.
5. Barbere hår fra toppen av skulderen opp til mellom øynene. Hvis musen begynner å våkne opp, plasserer du musen tilbake inn i kammeret før musen er helt bevisstløs igjen, bekreftet med en tå klype. Plasser bedøvet musen på stereotax og presse nesen membran over nesen.Vær varsom når de tenner og bein er skjøre.
6. Dirigere gassen strømme til stereotax å holde musen bedøvet. Det er viktig å av og til sjekke at musen er helt bevisstløs med en tå klype hele operasjonen. Fest hodet med øret barer. Vi foretrekker flate øre barer, men å målrette den laterale ventrikkel, er et perfekt nivå hodeskallen ikke er nødvendig på grunn av den store størrelsen på ventrikkel.
7. Snu isofluran nivå ned til 2,0% for vedlikehold. Dab øyesalve på hvert øye. Som sett i videoen, lå et sterilt hengende over en mus, slik at bare bunnen av nakke og hode er utsatt for. Deretter desinfisere den kirurgiske området ved å tørke av toppen av hodet og nakken i en sirkulær bevegelse starter på midten av barberte området og bevege den utover første med en bomullsdott dyppet i 95% etanol, etterfulgt av en bomullspinne dyppet i jod.
8. Vi anbefaler at du bruker en rektal probe tilbakemeldinger temperatur kontrollert oppvarming system som sikrertemperaturen på mus seg på et stabilt 37 ° C. Hvis temperaturen av musen minsker under operasjonen, kan den post-kirurgi utvinning ta lengre tid og den resulterende hypotermi kan føre til avvikende protein aktivitet, inkludert hyperphosphorylation av mikrotubuli assosiert protein Tau ^15.. Etter å ha satt opp varmesystemet, er du nå klar til å begynne operasjonen.

3. Implantasjon av Alzet Osmotisk Pump

1. Før du begynner operasjonen, sette på et par nye sterile hansker. Deretter, ved å anvende pinsett og en liten saks, gjør et innsnitt i huden fra undersiden av halsen over dyrets hode for å opp mellom øynene
2. Ta avstumpet saks med kurven vendt opp og gli under huden på bunnen av halsen tilbake mot venstre bakben. Det skal ikke være noen motstand. Hvis det er, ta saksen og prøv igjen. Dette danner subkutan lomme for den osmotiske pumpen.
3. Wipe skallen rent med sterile bomullspinner, etterfulgt av en bomullspinne dyppet i hydrogen peroxide å forbedre bregma.
4. Tørk de 50 ml koniske rør som inneholder pumper for å opprettholde sterilitet av pumpene. Tas en pumpe fra det koniske røret ved hjelp av den buede hemostat, idet det ekstra omsorg for at pumpen ikke berører sidene av det koniske rør. Hold i bunnen av pumpen med pinsett og skyver strømning modulator i resten av veien med den buede hemostat.
5. Hold pumpen der flyten modulator og rør møte med den buede pinsetten. Sett pumpen under huden på undersiden av halsen og skyv den tilbake mot venstre bakben så langt det går uten motstand. Vær nøye med å ikke la kateteret røre noe.
6. Med den buede hemostat, ta kanylen på sporet der toppen møter pidestall. Beveg kanylen driveren på plass og sikres på plass.
7. Plasser en eneste dråpe av super lim på undersiden av kanylen. Push toppen av kanylen inn i fører-og posisjon, slik at slangen er rettet rett bakover.
8. Trykk på katetertuppen til bregma og null koordinatene på det digitale displayet. Hev kateteret og bevege 1,1 mm lateralt til høyre og 0,5 mm posterior (figur 2B). Hold i huden ut av veien med den buede hemostat.
9. Drive den tynne metall kateteret gjennom skallen inntil plasten kanyle basen er trykket helt mot toppen av skallen. Metallet kateter kan drives direkte gjennom skallen hos mus som følge av den relative tynn skallen. Hvis du bruker rotter, bore et hull i skallen før du senker kateteret.
10. Trekk alle hud som har lim på den bort fra skallen. Med kanylen sjåfør som holder kanylen / kateteret på plass, vente 1-2 min for limet tørke fullstendig.
11. Når du trener, for å vurdere plassering av kateter, injisere 20-40 mL av 2,5% FastGreen Dye gjennom slangen (figur 2C). Vent 2-3 min, perfuse musen med 1X PBS 0,03% heparin, og fjern hjernen. Kutt coronally på kateteret nettstedet. Hvis kateteret ble plassert i ventrikkelen, vil fargestoffet være perfundert gjennom hele mus ventrikulære systemet (figur 2D).
12. Hold kateteret på plass med den buede hemostat når man løfter føreren. Sakte slipper hemostat å sikre at kanylen er sikkert festet til skallen.
13. Med en bomullspinne, trykk ned på toppen av kanylen. Monter rotte bein clippers inn i lunden mellom toppen og bunnen av kanyle. Klipp av toppen av kanylen mens du fremdeles trykke ned med en bomullspinne. Prøve og holde clippers nivå slik at det ikke løsner kanylen fra skallen. Dersom kanylen kommer unglued, raskt re-lim og press med en bomullspinne for ytterligere 2 min.
14. Bruke 5-0 sutur tråden, vanlig hemostat og tang, sutur langs hele åpningen, betaler ekstra oppmerksomhet rett over kanylen. Vi bruker en Running horisontal madrass sutur (se figur 5) på grunn av den større snitt over skallen.
15. Påfør en skvett av antibiotisk salve over hodet og nakken. Skru øret barer og løsne nesen membran. Ta musen fra stereotax og plassere på en varmepute for utvinning. Overvåke musene tett for varigheten av utvinning, vanligvis fra 10-30 minutter. Sjekk hver 2-3 minutter før musen begynner å gå rundt og stelle seg selv.

4. Post-operative omsorg

1. Overvåke musene daglig etter operasjonen for den første uken.
2. Hvis en mus ser ut til å være i smerte eller ubehag, anbefaler vi gi musen med en 5 mg / kg subkutan injeksjon av Carprofen gang hver 24 time for opptil fem dager for å lindre smerten.
3. Hvis det ser ut til å være en infeksjon, sjenerøst gjelder antibiotika salve til området daglig, og ta kontakt med en veterinær for å sikre at såret skal leges.
4. REDra 5-0 nylon sutur 7-10 dager etter operasjonen for å forhindre irritasjon fra sutur tråden.

5. Endre eller fjerne Alzet Osmotisk Pump

Etter at pumpen er gjort aktivt infusjonen ASO, kan den enten endres eller helt fjernet.

1. Følg samme pre-kirurgi prosedyre som ovenfor med følgende endringer: 1) du ikke trenger de buede saks, buet hemostat, rotte bein kuttere, og heller ikke det digitale displayet, og 2) i stedet for prepping hodet av musen, barbering og desinfisere baksiden av musen ved krysset mellom pumpen og slangen.
2. Gjør en 1,5 cm innsnitt på baksiden av musen, vinkelrett på pumpen / slange knutepunkt, ved hjelp av tenger og sakser. Nøye dra pumpen ut av snittet uten vesentlig å trekke / skyve på slangen som det kan jar kateteret.
3. For å fjerne pumpen, klippe slangen ca 0,5 cm over flyten modulator og berøre superlim til slangen to segl det stengt. Vent 1-2 min for limet tørke. Plasser røret tilbake inn i snittet og sutur-avslutning. Dab antibiotisk salve på sutured hud og sted muspekeren over en oppvarmet utvinning pad.
4. For å endre pumpe, har rykende pumper klar sammen med en 10 cm plate fylt med 95% etanol. Kateteret er ikke nødvendig med de nye pumpene.
5. Ta tak i en ny pumpe med tang. Dypp fingrene inn i etanol, ta tak i pumpen, og kast flow-modulator. Deretter forsiktig og langsomt trekke av det gamle pumpen fra flyten modulator festet til kateter og nål. Så snart den er slått av, sakte skyv den nye pumpen på, slik at flyten modulator aldri berører utsiden av musen.
6. Sett av pumpe ved snittstedet tilbake inn i det subkutane pakke og sutur huden. Dab antibiotisk salve på såret og sted musen på utvinning pad.
7. På samme måte som med pumpen implantering, overvåke musene daglig etter operasjonen for å sjekke for pain / ubehag og infeksjoner. Unn med Carprofen og antibiotika som anses nødvendig.

ICV BOLUS

6. Pre-kirurgisk prosedyre

1. Følg samme pre-kirurgi prosedyre som i punkt 2 ovenfor med følgende endringer: 1) Du trenger ikke buet saks, buet hemostat eller rotte bein kuttere, 2) rydde en 10 mL Hamilton sprøyte og kanyle med sterilisert vann og last med ASO, og 3) Fest sprøyten og nålen til stereotaxic apparat der kanylen driveren ble plassert.

7. Bolusinjeksjon av ASO

1. Ved å anvende pinsett og en liten saks, gjør et snitt fra undersiden av halsen opp til mellom øynene.
2. Tørk av skallen ren med sterile bomullspinner, etterfulgt av en bomullspinne dyppet i hydrogen peroxide å forbedre bregma.
3. Flytt sprøyte / nål på plass og fest. Pass på at den skrå delen av nålen vender posterior. Senknålen til den berører bregma. Nullstille alle av koordinatene. Bevege nålen sideveis til høyre 1.0 mm og anterior 0,3 mm (figur 3A).
4. Sakte drive nålen gjennom skallen bare til nålen hull er i flukt med toppen av skallen. Igjen, kan dette gjøres på grunn av den tynne musen skallen. Nulle z-koordinat og senke nålen til -3,0 mm ved en hastighet på 1 mm / sek (figur 3B). Vent i 2-3 minutter for hjernen for å forsegle rundt nålen.
5. Leverer hele 10 pl av ASO med en hastighet på 1 mL per sek. Vent 2-3 min. Vi bruker en en ul infusjonshastighet for Asos inn i ventrikkel, men denne prisen kan variere mellom ulike medikamenter. Når du trener, sjekk for riktig plassering av nålen ved å levere 10-20 mL av 2,5% FastGreen Dye. Perfuse musen med 1X PBS 0,03% heparin snart etter fargestoff infusjon og foreta koronale seksjoner av hjernen for å verifisere at fargestoffet er i den ventrikulære system (figur 3C).
<li> Hold en bomullsdott mot hodeskallen i bunnen av kanylen. Hev nålen med en hastighet på 1 mm per sekund. Så snart kanylen er ute av skallen, ruller bomullsdott over nålen hullet og holdes i 1 min for å hindre enhver ASO fra å lekke ut.
6. Sy huden lukket, gjelder antibiotika salve, og sted musen på oppvarmet utvinning pad. Avhengig av ASO konsentrasjon, kan det ta 20 min til et par timer til fullt igjen.
7. På samme måte som med pumpen implantering, overvåke musene daglig etter operasjonen for å kontrollere smerte / ubehag og infeksjoner. Unn med Carprofen og antibiotika som anses nødvendig.

Representative Results

Etter pumpen infusjon eller et angitt tidspunkt etter den ICV bolusinjeksjon (vi rutinemessig brukes fire uker), er det viktig å teste effektiviteten til de Asos_hfm. Det anbefales å ta forskjellige regioner av hjernen og ryggmargen til å måle nivåer / isoformer av målgenet, både på mRNA-nivå ved hjelp av kvantitativ real-time PCR samt proteinnivået ved hjelp av enten Western Blot eller ELISA (figur 4 for en publisert f.eks ). Dette vil bidra til å fastsette ASO effekt gjennom de forskjellige CNS regioner. Hvis halveringstiden av målrettet protein er lang, anbefaler vi å vente lenger etter ASO infusjon for å vurdere maksimal protein knockdown eller spleising.

Det er også viktig å teste oligo fordeling. Pumpe infusjoner resultere i distribusjon gjennom både ipsilaterale og kontralaterale halvkule, men en høyere ASO konsentrasjon er ofte sett i områder nærmere ventrikkel system ^16. ICV bolus injeksjoner gi en mer uniforrm fordeling av oligo gjennom CNS ^16, selv om virkningene ikke kan vare like lenge. Vi lede leseren til Southwell et al. Å se en direkte sammenligning av pumpe versus bolus oligo distribusjon ^16.

Vi anbefaler også testing av flere doser samt varigheten av handlingen av Asos siden hver ASO vil oppføre seg litt annerledes in vivo. ASOS vanligvis har en relativt lang virkningstid, med target knockdown eller spleising som varer flere måneder etter ASO levering. I tillegg vil noen Asos fungerer bedre enn andre, og noen genet mål vil være lettere å knockdown enn andre. På grunn av dette, når screening Asos å bestemme ledelsen kandidat, anbefaler vi at du tester minst 3-5 Asos in vivo med en n = 4-6 voksne mus per ASO som et første pass.

Hvis du bruker et legemiddel annet enn Asos, vil det også være viktig å pilot den ideelle medikamentkonsentrasjonen, narkotika virkningstid, og CNS narkotikadistribusjon for at spesifikke forbindelsen.

Tabell 1. Kirurgi Koordinater. Koordinatene brukes til å treffe den rette lateral ventrikkel i både mus og rotter når implantere osmotiske pumper samt utføre en intracerebroventrikulær (ICV) bolus. Både koordinater, for pumper og ICV bolus, målrette den riktige lateral ventrikkel. Vi bruker to ulike sett fordi disse er det vi har mest erfaring med, og vet gir utmerket fordeling av ASO.

Figur 1. Stereotaksisk Setup. (A) Det nødvendige stereotaxic utstyr for Alzet pumpe og bolusinjeksjon operasjoner. I) Glassperlespillet Steriliserr. ii) digital avlesning. iii) stereotaxic base med bevegelige armer. iv) temperaturstyrt Oppvarming Pad. v) isofluran / Oksygen System. vi) isofluran Chamber. (B) Nærbilde av nesen membran og øre barer. (C) To vedlegg som kreves. Venstre: Sprøyte / nåleholderen for ICV bolusinjeksjoner. Høyre: kanyle Driver for osmotisk pumpe implantasjon.

Figur 2. Alzet Osmotisk Pump implantasjon. (A) Alzet osmotiske pumpe alternativer for mus. . Fjorten dagers pumper (0,25 mL / t), 28 dagers pumper (0,25 mL / t), 42 dagers pumper (0,15 pl / t) (B) Koordinater for pumpe implantasjon fra bregma: -0.5 mm posterior, lateral -1.1 mm ( høyre), og -2,5 mm Ventral (lengden av kateter). (C) Etter å ha kjørt kateteret gjennomskalle og liming kanylen, blir fargestoff spyles gjennom kateteret for å vurdere riktig plassering av kateteret i den laterale ventrikkel. (D) perfundert hjerne umiddelbart etter fargestoff administrert som i (C). Hvis kateteret er korrekt plassert i ventrikkelen, blir fargestoff bli distribuert over hele mus ventrikulære systemet.

Figur 3. Intracerebroventrikulær bolusinjeksjon. (A) Koordinater for bolusinjeksjon fra bregma: 0,3 mm Fremre, -1,0 mm Lateral (Høyre), og -3,0 mm ventral (B) Etter å ha kjørt nålen gjennom skallen -3,0 mm ventral, er fargestoff presset gjennom sprøyten. for å vurdere riktig plassering av nålen i den senere ventrikkel. (C) perfundert hjerne kort tid etter fargestoff administrert som i (B). Hvis nålen er korrekt plassert i ventrikkel, denfargestoff vil bli distribuert over hele musen ventrikkel system.

Figur 4. Antisense Oligonucleotides redusere SOD1 rotte in vivo (figur tatt direkte fra Smith et al. ^7). (AD), antisens oligonukleotider SOD1 ^r146192 SOD eller SOD ^kryptert ble infundert 28 dager inn i den høyre laterale ventrikkel i normale rotter ved doser på 100 pg / dag. (A) Endogene SOD1 mRNA-nivåer fra hjerne-og ryggmarg målt ved QRT-PCR. ( B) SOD1 og a-tubulin protein nivåer etter ASO infusjon. (C og D) Protein nivåer for tubulin og SOD1 kvantifisert for ulike regioner av hjernen etter infusjon. (E) Asos mot presenilin en eller GSK-3 og beta; Ble tilført for to uker inn i høyre lateral ventrikkel nontransgenic mus og mRNA nivåer vurderes i høyre frontal / temporal cortex. Gjengitt med tillatelse fra American Society for Clinical Investigation. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Kjører Horisontal madrass Sutur. 5-0 nylon sutur tråden er flettet inn og ut av huden, som starter anterior og arbeider posterior, konsentrere seg mer over kanylen. Etter å ha nådd den bakre punktet, er suturen tråden deretter brakt tilbake opp og tres over kanylen igjen. Dette sikrer riktig lukking av sår og forhindrer kanylen / slange fra arbeidslivet gjennom huden.

Discussion

Evnen til å levere medikamenter globalt i CNS slik som vist i videoen er et ekstremt kraftig teknikk som er lett både å lære og bruke. Med praksis, kan en enkelt pumpe implantering eller en ICV bolus være ferdig i 10 min, slik at for store cohorts av mus som skal behandles samtidig. Dette er spesielt nyttig for studier med et atferdsmessig avlesning, som større tall for mus atferd er avgjørende for å hjelpe se betydelige forskjeller.

Basert på våre erfaringer levere Asos via pumper og bolusinjeksjoner, har vi observert noen fordeler og ulemper til hver metode. Det bør bemerkes at dette er de meninger i vårt laboratorium, og kan ikke være sant for alle mus og rotter modeller.

Vi finner en fordel med bruk av pumpene er deres evne til å levere en høy mengde av ASO siden ASO er fordelt over et mye lengre tidsrom. Dette tilsvarer vanligvis til lengre vedvarende knockdown eller skjøting etter aktivASO infusjon, selv om dette ikke alltid er tilfelle. Pumpene også gi rom for en presis tidsramme på ASO levering (14 dager, 28 dager, eller 42 dager) og pumpene kan endres en gang for å gi rom for enda lenger aktiv ASO infusjon. Vi har imidlertid lagt merke til at skifte pumper mer enn en gang øker variasjonen på grunn av dannelsen av fibrøse lommer rundt pumpen som forhindrer at pumpen ordentlig absorberende fluidet. En ulempe ved pumper er at enkelte mus ikke tåler pumpen, så vel som andre. Hvis den transgene linjen du jobber med er mer skjøre, kan en pumpe være for tungvint. Pumpene må også bli fjernet etter den endelige tilførsel, å utsette musene til en annen operasjon og tilsatt anestesi. Ved å gjøre virkemåten arbeid, er det spesielt viktig å fjerne pumpen og tillate i minst 1-2 uker for utvinning ettersom tilstedeværelsen av pumpen vil påvirke noen oppførsel i mus.

Med ICV bolus injeksjoner, er en fordel kostnad. Det er etinvesteringskostnad for å kjøpe sprøyter og nåler, men over tid, bolusinjeksjoner er mer kostnadseffektiv fordi det er ingen pumper / rør / katetre å kjøpe. Samlet sett er det mindre opp-holder med ICV bolusinjeksjoner på grunn av mangel på kanyler og pumper. Vi finner også at ICV bolus kan brukes til å levere Asos til yngre og / eller mer skjøre mus. En ulempe ved ICV bolus er at det er en enkelt injeksjon. Ikke så mye generell ASO kan leveres via denne ruten, og hvis varigheten av handlingen i ASO som brukes er kort, vil de knockdown / skjøting effekter også være kortvarig.

Både osmotiske pumper samt ICV bolus ha evne til å levere Asos som kan knockdown proteiner eller endre skjøting av gener i hele gnager CNS, en teknikk som har brede programmer i flere nevrovitenskap-relaterte felt. Vi foreslår pilotering begge metoder for levering hvis du er usikker på hvilken tilførselsvei er best egnet for s dinpecific studien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS
Alzet Osmotic Pump 14 days	DURECT	Model 1002
Alzet Osmotic Pump 28 days	DURECT	Model 2004
Alzet Osmotic Pump 42 days	DURECT	Model 2006
2.5 mm Catheters	PlasticsOne	3280PM/SPC	Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length
Vinyl Catheter Tubing	DURECT	7760	ID: 0.027", OD: 0.045"
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP	Baxter	2F7124	NOT to be used in pumps or tubing
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP	Hospira	NDC 0409-4888-10
p60 Petri Dish (Sterilized)	TRP	93060
Surgical Blades (Sterile)	Butler Schein	#007319
Latex Surgical Gloves (Sterile)	Micro-Touch		CatNo will depend on size of the gloves needed
Sterile Towel Drape	Dynarex	4410
.2um Syringe Filters	PALL	4192
1 ml Syringe (Sterile)	BD	309625
50 ml Conical Tubes
100% Ethanol
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS
Curved Forceps	Fine Science Tools	11001-12
Curved Hemostat	Fine Science Tools	13009-12
Fine Sharp Scissors	Fine Science Tools	14060-09
Curved Blunt Scissors	Fine Science Tools	14029-10
Bone Cutter	Fine Science Tools	16104-14
Straight Hemostat	Fine Science Tools	12002-12
Syringe	Hamilton	7653-01	10 μl gas-tight with removable needles
Needles	Hamilton	7758-04	26 gauge, Point Style: 2
5-0 Nylon Suture Thread	Covidient	SN-871
Alcohol Pads	Select	#521
Cotton Swabs (sterile)	Puritan	REF 806-WC
Super Glue	Loctite		Longneck Bottles
CAUTION: FastGreen Dye	Sigma	F7252-5G	Wear Eyeshields and Gloves when handling this product
Antibiotic Cream
Eye Ointment
Electric Shaver
70% Ethanol
10% Provadone Iodine
3% Hydogen Peroxide
Warming Pad
Bead Sterilizer	SouthPointe Surgical	GRM5-1450
Small Animal Stereotaxic	Kopf	Model 940
Nose Cone	Kopf	Model 923-B
Ear Bars	Kopf	Model 921	This model is optional
Cannula Driver	Kopf	Model 1966
Syringe Holder	Kopf	Model 1972
Temperature Control System	Kopf	Model TCAT-2LV	Optional
Oxygen/Isoflurane System