Summary
نحن تصف طريقة لاستهداف المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي عن طريق إما زرع القسطرة أو إجراء عملية حقن بلعة إلى البطين الجانبي الحق في الفئران. ونحن نركز بشكل خاص على إيصال أليغنوكليوتيد] العقاقير. هذه التقنية غير قابلة للتكيف بسهولة إلى الأدوية الأخرى والفئران.
Abstract
ونظرا لعدم القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ، والحاجة ليتم تسليمها مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعض الأدوية. ويركز تحديدا على مختبرنا أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، على الرغم من أن التقنيات يظهر في شريط الفيديو هنا يمكن أن تستخدم أيضا لتقديم مجموعة كبيرة من المخدرات الأخرى إلى الجهاز العصبي المركزي. أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز) لديها القدرة على أهداف ضربة قاضية تسلسل محدد 1 وكذلك نسب الإسوي التحول من جينات معينة 2. لتحقيق واسع النطاق ضربة قاضية الجينات أو الربط في الجهاز العصبي المركزي من الفئران، ويمكن أن يتم تسليم منظمات خدمات الإيدز في الدماغ باستخدام طريقين منفصلين الإدارة، وكلاهما علينا أن نظهر في شريط الفيديو.
الاستخدامات الأولى Alzet مضخات ناضح، وصله بجهاز القسطرة التي يتم زرعها جراحيا في البطين الجانبي. وهذا يسمح للمنظمات خدمات الإيدز إلى أن غرست بشكل مستمر إلى الجهاز العصبي المركزي لفترة محددة من الزمن. والثاني ينطوي على حقن بلعة واحدة من مرحباتركيز هرمون النمو من ASO إلى البطين الجانبي الأيمن. كلا أساليب استخدام نظام البطين الدماغي الماوس لتسليم ASO إلى الدماغ والحبل الشوكي بأكمله، على الرغم اعتمادا على احتياجات الدراسة، قد يكون من المفضل أسلوب واحد على الآخر.
Introduction
بعض الأدوية غير قادر على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB)، والتي تتطلب الجهاز العصبي المركزي مباشرة (CNS) التسليم. للتحايل على BBB، والمخدرات، يمكن تسليمها مباشرة الى الدماغ باستخدام أساليب وصفها. بينما مختبرنا ورقة التركيز هنا مفصلة عن أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، والمخدرات الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة، والأجسام المضادة، وناقلات العلاج الجيني، وغيرها، ويمكن أيضا أن يتم تسليمها من خلال النهج نفسه بالضبط.
بعض البروتينات تلعب دورا أساسيا في التسبب في أمراض الاعصاب. هذه البروتينات غالبا ما تشكل الأنواع السامة وتتراكم في المجاميع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الموت العصبية والأمراض العصبية اللاحقة 3-4. في محاولة لإبطاء أو حتى وقف تطور هذه الأمراض، قد يكون الخيار العلاجي واحدة لاستهداف مباشرة وتقلل من البروتين المسبب للمرض. ومع ذلك، وغالبا ما توجد هذه البروتينات بتواجد مطلق من خلال الجهاز العصبي المركزي، مما يجعل من الصعب على البريد استهداف ffectively لهم على نطاق عالمي.
من أجل استهداف الجينات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بأكمله، ونحن إدارة منظمات خدمات الإيدز في الماوس السائل النخاعي (CSF) عن طريق البطين الجانبي لتجاوز BBB. هذا أسلوب معين يستفيد من نظام البطين الماوس الذي يغمر المخ بأكمله والحبل الشوكي، مما يسمح للتوزيع على نطاق واسع من منظمات خدمات الإيدز. نحن نستخدم منظمات خدمات الإيدز التي هي 18-20 مير RNA مثل الجزيئات التي تربط مباشرة تسلسل مرنا الهدف، واعتمادا على التعديلات الكيميائية ASO، إما A) تجنيد ريبونوكلياز-H إلى تدهور مرنا تؤدي إلى ضربة قاضية أو B) تحول الربط البديل 1 ، 2،16،17. وتجدر الإشارة إلى أن وجود جزيئات متعددة لهدمت بروتين معين في الجسم الحي، بما في ذلك shRNA. منذ هذه الجزيئات ليست هي محور هذه المقالة، نوجه القارئ إلى مراجعة المقالات التي أفضل آليات ضربة قاضية التفاصيل من العمل والمزايا / عيوب كل منها 5-6.
jove_content "> في العمل قبل، ونحن قد استخدمت منظمات خدمات الإيدز لاستهداف البروتين الفائق ديسموتاز 1 (SOD1) في نموذج الفئران المعدلة وراثيا من التصلب الجانبي الضموري (ALS) 7 (الشكل 4). الطفرات في SOD1 تحدث في حوالي 2٪ من جميع ALS 8 الحالات، على الرغم من أنه قد تم الافتراض مؤخرا أن SOD1 قد تلعب دورا هاما في ALS متفرقة فضلا 9-10. من خلال خفض مجمل مستويات SOD1 الفئران المعدلة وراثيا في ALS، البقاء على قيد الحياة بعد بداية حدثت زيادة كبيرة 7. وكانت هذه البيانات الهامة الأولى لإظهار أن العلاج ASO في الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون له أثر إيجابي عميق على نموذج مرض عصبي. ومنذ ذلك الحين، دخلت منظمات خدمات الإيدز تستهدف SOD1 الإنسان وأنجزت بنجاح المرحلة الاولى من التجارب السريرية البشرية مع آثار جانبية أقل (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ، كما قدمت في عام 2012 64 عشر الأكاديمية الأمريكية لعلم الأعصاب السنوي. خطط لتحريك منظمات خدمات الإيدز انتقل إلى المرحلة الثانية من التجارب تجري حاليا.في كل من هذه الدراسات، تم تسليم منظمات خدمات الإيدز إلى البطين الجانبي لخفض مجمل مستويات الجين أو الجينات من خلال تغيير الربطالجهاز العصبي المركزي بأكمله. كلا مضخات ناضح وحقن بلعة واحدة يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز إلى CSF. مضخات تسمح بطيئة، والتسليم مستمر، في حين أن intracerebroventricular (ICV) البلعة هو سريعة والحقن لمرة واحدة. وقد استخدمنا كل من هذه الأساليب مع النجاح، على الرغم من أننا لم تبلغ المقارنة المباشرة بين المضخة والبلعة في خط المعدلة وراثيا واحد.
استخدام منظمات خدمات الإيدز في الجهاز العصبي المركزي هو وسيلة قوية لخفض مجمل مستويات البروتين و / أو تغيير الربط من عدة بروتينات. بينما نستخدم منظمات خدمات الإيدز حصرا كعلاج لاضطرابات عصبية، ونحن ندرك أن الحقول الأخرى قد تستفيد أيضا من هذه التقنية. طالما أن البروتين من الفائدة يتم التعبير في الجهاز العصبي المركزي والهدف النهائي هو تحقيق تغييرات على مستوى الجهاز العصبي المركزي في التعبير الجيني، وذلك باستخدام منظمات خدمات الإيدز في تقنيات أثبتت قد تكون مفيدة جدا.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول أدناه من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجان استخدم في جامعة واشنطن في سانت لويس ومتوافق مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لاستخدام حيوانات التجارب. إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي يؤدون العمليات الجراحية، ونحن ننصح بالاطلاع على المقالة إن الرب على جراحات القوارض كمقدمة قبل بداية 14.
يمكن أن يتم تسليم منظمات خدمات الإيدز إلى الجهاز العصبي المركزي الماوس من خلال كل من التناضحي مضخة تسريب وICV حقن بلعة واحدة. وبسبب هذا، يتم تقسيم إجراءات مفصلة أدناه يصل إلى جزأين. وسوف يكون لمست إيجابيات وسلبيات لكل طريقة على في قسم مناقشة. الإحداثيات المستخدمة في البروتوكولات هي للبالغين C57BL6 وB6C3 الفئران. إحداثيات الفئران المقابلة يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1.
PUMP ناضح ALZET
1. إعداد مضخات التناضحي Alzet
- وضع لdrap العقيمةه وإسقاط بعناية البنود التالية على ذلك مع الحرص على عدم لمس أي شيء مباشرة من أجل الحفاظ على العقم: مضخة التناضحي (ق)، وتدفق المغير (ق)، 1 مل حقنة معقمة (ق)، شفرة مشرط، وأجزاء من أنابيب (1 قطعة من الأنابيب = 5 مضخات). بالنسبة للفئران، وهناك ثلاثة خيارات لمضخات: 14 يوما، 28 يوما، و 42 يوما (الشكل 2A).
- إرفع قبعة وملء العقيمة أنابيب مخروطية 50 مل مع 15-20 مل محلول ملحي. يمكن إضافة ما يصل إلى 6 مضخات تجميعها في أنبوب مخروطي الشكل.
- ملء طبق بتري P60 مع الإيثانول بنسبة 100٪. إضافة العدد المناسب من القسطرة إلى الإيثانول. بالنسبة للفئران، وطول القسطرة هو 2.5 مم.
- تحديد كل ASO الى ما يصل 1.5 مل إيبندورف أنابيب حسب الضرورة. وتشمل أنبوب إيبندورف مليئة العقيمة المالحة 0.9٪ لملء الأنبوب مع.
- مرة واحدة كل شيء على استعداد، وضعت على قفازات معقمة. تأكد من عدم لمس أي شيء غير معقمة. تغيير القفازات عند الضرورة.
- لكل ASO لاستخدامها، وملء حقنة 1 ملوloadpumps عن طريق وضع إبرة في ثقب أعلى وملء ببطء حتى التسريبات الزائدة. تستمر حتى يتم شغل كل من المضخات.
- إرفع قبعة للجهري تدفق وإدراجه في المضخات. دفع تدفق المغير كلها تقريبا من الطريقة، وترك فجوة ملم 3-5.
- باستخدام شفرة مشرط، وقطع كل قطعة من الأنابيب إلى 5 شرائح متساوية. خذ قطعة واحدة من الأنابيب، وملء مع ملحي معقم باستخدام حقنة 1 مل، وإدراج الجزء العلوي من المغير تدفق في واحدة من نهاية الأنبوب. ثم نلقي قنية من الإيثانول وتوصيله إلى الطرف الآخر من الأنبوب. يتم الآن تجميعها بشكل كامل للمضخة.
- وضع مضخة تجميعها بالكامل في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي مع المياه المالحة لفتيلة. وفتيلة يسمح للمضخات لامتصاص السوائل للشروع في تسليم المخدرات وكذلك وصلنا إلى درجة حرارة مناسبة. الوقت فتيلة: 14 مضخات اليوم: 4-6 الموارد البشرية، مضخات 28 يوم: 40 ساعة و 42 مضخات اليوم: 60 ساعة. عند الانتهاء من تجميع المضخات، وكأب الأنابيب المخروطية ومكان في بيئة نظيفة37 ° C حمام الماء حتى الجراحة.
2. إجراءات ما قبل العمليات الجراحية
- مسح كل شيء إلى أسفل مع الايثانول 70٪ لتعقيم المنطقة ووضع الستائر العقيمة على رأس الطاولة وstereotax لإنشاء حقل معقمة. من المهم أن تضع في اعتبارها حقل معقمة طوال الجراحة بأكمله. بدوره على ما يلي: معقمة الخرزة، سادة التدفئة، ضوء، قراءات رقمية، والأوكسجين / نظام isoflurane و(الشكل 1).
- سيكون مطلوبا من العناصر التالية إذا فعل إما عملية جراحية واحدة أو مجموعة كاملة من العمليات الجراحية كما نفعل عادة: 1 زوج من ملقط، 1 مرقئ المنحني، 1 زوج من مقص صغير، 1 زوج من مقص منحني صغير اضعافها، 1 الفئران القاطع العظام ، 1 مرقئ مستقيم، 5-0 خيوط النايلون، 1 أنابيب مخروطية مع الايثانول 70٪، 1 أنبوب مخروطي مع الايثانول 95٪، 1 أنبوب مخروطي مع اليود، 1 أنبوب مخروطي مع بيروكسيد الهيدروجين، حزمة من مسحات القطن المعقم، 1 زجاجة من السوبر الغراء، 1 أنبوب مرهم مضاد حيوي، 1 أنبوب من العينزيوت التشحيم، و1 ماكينة حلاقة كهربائية.
- ضع نصائح من كلا الزوجين من مقص، ملقط، ومرقئ المنحني في جهاز التعقيم حبة لمدة 15 ثانية. إزالة ووضعه في الايثانول 70٪. عند تنفيذ عملية جراحية أكثر من واحدة، وإعادة تعقيم نصائح من الصكوك في ما بين الحيوانات.
- تحويل isoflurane وإلى 4٪ وO 2-0،4 لتر / دقيقة وتدفق الغاز مباشرة إلى الدائرة. لدينا نظام isoflurane و/ الأكسجين لدينا معايرة واحدة على الأقل في السنة لضمان أننا توفير كمية مناسبة من التخدير. وتباطأ بشكل ملحوظ مكان الماوس في غرفة وانتظر حتى التنفس. إزالة الماوس وإجراء قرصة أخمص القدمين إلى ضمان الفأر هو فاقد الوعي تماما.
- حلاقة الشعر من أعلى الكتف حتى في ما بين العينين. إذا يبدأ الماوس ليستيقظ، ضع الماوس مرة أخرى إلى غرفة حتى الفأر هو فاقد الوعي تماما مرة أخرى، مؤكدا مع قرصة أخمص قدميه. ضع الماوس تخدير على stereotax ودفع مخروط الأنف على الأنف.أن يكون لطيف والأسنان والعظام هشة.
- توجيه تدفق الغاز إلى stereotax للحفاظ على الماوس تخدير. فمن المهم للتحقق أحيانا للتأكد من أن الفأر هو فاقد الوعي تماما مع قرصة أخمص قدميه في جميع أنحاء عملية جراحية. تأمين الرأس مع قضبان الأذن. ونحن نفضل تسوية القضبان الأذن، على الرغم من استهداف بطين الوحشي، جمجمة مستوى تماما ليس من الضروري نظرا لحجم كبير من البطين.
- بدوره مستوى isoflurane وصولا الى 2.0٪ للصيانة. الداب مرهم العين على كل عين. كما رأينا في الفيديو، وضع ثنى العقيمة على الماوس بحيث تتعرض فقط قاعدة العنق والرأس. ثم تطهير المنطقة الجراحية بواسطة مسح الجزء العلوي من الرأس والرقبة في حركة دائرية بدءا من وسط منطقة حلق والانتقال إلى الخارج الأولى مع قطعة من القطن مغموسة في الايثانول 95٪، تليها قطعة من القطن مغموسة في اليود.
- ونحن نوصي باستخدام ردود الفعل مسبار المستقيم درجة حرارة نظام التدفئة للرقابة التي تضمندرجة حرارة الماوس يبقى مستقرا عند 37 درجة مئوية. إذا كانت درجة حرارة الماوس يقلل أثناء الجراحة، قد الانتعاش بعد عملية جراحية تستغرق وقتا أطول وانخفاض حرارة الجسم الناتجة يمكن أن يؤدي إلى نشاط البروتين الشاذة، بما في ذلك hyperphosphorylation من أنيبيب المرتبطة بروتين تاو 15. بعد إعداد نظام التدفئة، وأنت الآن على استعداد لبدء الجراحة.
3. زرع مضخة التناضحي Alzet
- قبل البدء في عملية جراحية، ووضع على زوج جديد من القفازات المعقمة. ثم، باستخدام ملقط وزوج من مقص صغير، وجعل شق في الجلد من قاعدة العنق فوق جمجمة الحيوان إلى ما يصل في بين العينين
- خذ مقص اضعافها مع منحنى مواجهة والانزلاق تحت الجلد في قاعدة الجزء الخلفي العنق نحو hindlimb اليسار. ينبغي أن يكون هناك أي مقاومة. إذا كان هناك، إزالة مقص وحاول مرة أخرى. وهذا يشكل جيب تحت الجلد لمضخة التناضحي.
- وايPE الجمجمة نظيفة مع مسحات القطن المعقم، تليها مسحة القطن مغموسة في بيروكسيد الهيدروجين لتعزيز bregma.
- مسح أسفل 50 مل أنابيب مخروطية التي تحتوي على مضخات للحفاظ على العقم من المضخات. بعناية تأخذ المضخة من الأنبوب المخروطية باستخدام مرقئ المنحني، مع الحذر أن المضخة لا تلمس الجانبين من أنبوب مخروطي الشكل. الاستمرار على قاعدة مضخة مع ملقط ودفع تدفق المغير في بقية الطريق مع مرقئ المنحني.
- عقد المضخة حيث تدفق المغير وأنابيب يجتمع مع مرقئ المنحني. إدراج مضخة تحت الجلد عند قاعدة العنق ويدفع به الى الوراء في اتجاه hindlimb اليسار بقدر ما سوف تذهب دون مقاومة. كن حذرا لعدم السماح لمسة القسطرة أي شيء.
- مع مرقئ المنحني، والاستيلاء على قنية في الأخدود حيث الجزء العلوي يلتقي قاعدة التمثال. نقل سائق قنية في الموقف وتأمين في مكانه.
- وضع قطرة واحدة من الغراء عظمى على قاعدة من قنية. صديدح الجزء العلوي من قنية إلى السائق وموقف بحيث أنابيب وأشار مستقيم الظهر.
- تلمس طرف القسطرة لو bregma صفر الإحداثيات على الشاشة الرقمية. رفع القسطرة ونقل 1.1 ملم أفقيا إلى اليمين و 0.5 مم الخلفي (الشكل 2B). عقد الجلد للخروج من الطريق مع مرقئ المنحني.
- دفع القسطرة معدنية رقيقة من خلال الجمجمة حتى يتم ضغط قاعدة قنية البلاستيك آمن ضد الجزء العلوي من الجمجمة. القسطرة المعادن يمكن أن تكون مدفوعة مباشرة من خلال الجمجمة في الفئران بسبب الجمجمة رقيقة نسبيا. إذا باستخدام الفئران، حفر حفرة في الجمجمة قبل خفض القسطرة.
- سحب أي الجلد الذي يحتوي على الغراء بعيدا عن الجمجمة. مع السائق قنية عقد قنية / القسطرة في مكانها، والانتظار 1-2 دقائق للالغراء لتجف تماما.
- عند ممارسة، لتقييم وضع القسطرة، حقن ميكرولتر من 20-40 2.5٪ FastGreen صبغ من خلال أنابيب (الشكل 2C). الانتظار 2-3 دقائق، perfusه الماوس مع 1X PBS 0.03٪ الهيبارين، وإزالة الدماغ. قطع coronally في موقع القسطرة. إذا تم وضع القسطرة في البطين، سيتم perfused الصبغة في جميع أنحاء منظومة البطين الماوس (الشكل 2D).
- عقد القسطرة في مكان مع مرقئ المنحني في حين رفع السائق. الافراج عن ببطء مرقئ لضمان أن يتم تأمين قنية بشكل صحيح في الجمجمة.
- مع مسحة القطن، اضغط لأسفل على الجزء العلوي من قنية. تناسب كليبرز العظام في الفئران في بستان بين أعلى وقاعدة للقنية. مقطع من الجزء العلوي من قنية في حين لا يزال الضغط إلى أسفل مع مسحة القطن. محاولة الحفاظ على مستوى كليبرز حتى لا فصل قنية من الجمجمة. إذا قنية لا تأتي غير إلتصق، بسرعة إعادة الغراء وتطبيق الضغط مع مسحة القطن ل2 دقيقة إضافية.
- باستخدام خيط 5-0 خياطة، مرقئ العادية، وملقط، خياطة على طول الانفتاح الكامل، مع إيلاء اهتمام إضافي اليمنى على قنية. ونحن نستخدم رونينز الأفقي خياطة فراش (انظر الشكل 5) ويرجع ذلك إلى شق أكبر عبر الجمجمة.
- تطبيق لمسة من مرهم مضاد حيوي على الرأس والرقبة. فك قضبان الأذن وتخفيف مخروط الأنف. إزالة الماوس من stereotax ووضعت على لوحة ظاهرة الاحتباس للانتعاش. رصد الفئران عن كثب لمدة الانتعاش، تتراوح عادة بين 10-30 دقيقة. تحقق كل 2-3 دقائق حتى يبدأ الماوس يتجول والاستمالة نفسها.
4. العناية اللاحقة للعمليات الجراحية
- رصد الفئران يوميا بعد الجراحة للأسبوع الأول.
- إذا كان الماوس يبدو أن في الألم أو الضيق، ونحن نوصي توفير الفأرة مع 5 ملغ / كغ من الحقن تحت الجلد مرة واحدة كل ساعة كاربروفين 24 لمدة تصل إلى 5 أيام من أجل تخفيف الألم.
- إذا يبدو أن هناك عدوى، وتطبيق بسخاء مرهم مضاد حيوي على المنطقة يوميا واستشارة البيطري حضور للتأكد من أن الجرح يشفى بشكل صحيح.
- Remove الخيط النايلون 5-0 7-10 أيام بعد الجراحة لمنع تهيج من خيوط الجروح.
5. تغيير أو إزالة مضخة التناضحي Alzet
بعد الانتهاء من مضخة غرس بنشاط ASO، فإنه يمكن أن يكون إما تغييرها أو إزالتها تماما.
- اتبع نفس الإجراء قبل الجراحة على النحو الوارد أعلاه مع التغييرات التالية: 1) لن تحتاج إلى مقص منحني، مرقئ المنحني وتقطيعها العظام في الفئران، ولا العرض الرقمية، و2) بدلا من الإستعداد الرأس من الفأرة، ويحلق تطهير الجزء الخلفي من الماوس عند تقاطع للمضخة وأنابيب.
- جعل شق 1.5 سم على ظهر الماوس، عمودي على تقاطع مضخة / أنابيب، وذلك باستخدام ملقط ومقص. سحب بعناية المضخة من شق دون سحب كبير / دفع على الأنابيب لأنها قد جرة القسطرة.
- لإزالة مضخة، مقطع الأنبوب حوالي 0.5 سم فوق المغير تدفق وتلمس superglue إلى T أنابيبيا ختم انها اغلقت. الانتظار 1-2 دقائق للالغراء لتجف. وضع أنابيب مرة أخرى إلى شق وخياطة مغلقة. الداب مرهم مضاد حيوي على الجلد وخياطة ضع الماوس على وسادة ساخنة الانتعاش.
- لتغيير مضخة، وتقدم طازجة مضخات استعداد جنبا إلى جنب مع صحن 10 سم مليئة الايثانول 95٪. ليست هناك حاجة القسطرة مع مضخات جديدة.
- الاستيلاء على مضخة جديدة مع ملقط. تراجع أصابعك في الإيثانول، ويترسخ من المضخة، وتجاهل التدفق من المغير. ثم، بعناية وببطء سحب قبالة المضخة القديمة من المغير تدفق تعلق على أنابيب وقنية. بمجرد إيقاف تشغيله، حرك ببطء مضخة جديدة على، وضمان أن المغير تدفق أبدا يمس خارج من الفأرة.
- معاودة مضخة جديدة من خلال شق مرة أخرى في حزم تحت الجلد وخياطة الجلد. الداب مرهم مضاد حيوي على الماوس الجرح ووضعت على وسادة الانتعاش.
- فقط كما هو الحال مع زرع مضخة، ومراقبة الفئران يوميا بعد الجراحة للتأكد من عالعين / عدم الراحة والالتهابات. علاج مع كاربروفين والمضادات الحيوية حسبما تراه ضروريا.
ICV البلعة
6. إجراءات ما قبل العمليات الجراحية
- اتبع نفس الإجراء قبل الجراحة كما هو الحال في القسم 2 أعلاه مع التغييرات التالية: 1) لن تحتاج مقص منحني، مرقئ المنحني، أو قطع العظام في الفئران؛ 2) تنظيف حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر وإبرة مع الماء المعقم وتحميل مع ASO، و 3) إرفاق المحقنة والإبرة إلى جهاز التجسيمي حيث يقع سائق قنية.
7. حقن بلعة من ASO
- باستخدام ملقط وزوج من مقص صغير، وجعل شق من قاعدة العنق حتى في ما بين العينين.
- مسح الجمجمة نظيفة مع مسحات القطن المعقم، تليها قطعة من القطن مغموسة في بيروكسيد الهيدروجين لتعزيز bregma.
- نقل حقنة / إبرة في مكانها وتأمين. تأكد من أن جزء مشطوف من الإبرة تواجه الخلفي. انخفاضالإبرة حتى يلمس bregma. الصفر كل من الإحداثيات. تحريك الإبرة أفقيا إلى اليمين 1.0 ملم والأمامية 0.3 ملم (الشكل 3A).
- دفع ببطء الإبرة من خلال الجمجمة حتى مجرد ثقب إبرة هو مطاردة مع الجزء العلوي من الجمجمة. مرة أخرى، وهذا يمكن القيام به نظرا لركاكة من الجمجمة الماوس. صفر Z-تنسيق وخفض الإبرة إلى -3.0 ملم بمعدل 1 ملم / ثانية (الشكل 3B). الانتظار 2-3 دقائق للدماغ لختم حول الإبرة.
- تسليم كامل 10 ميكرولتر من ASO بمعدل 1 ميكرولتر لكل ثانية. الانتظار 2-3 دقائق. ونحن نستخدم 1 معدل ضخ ميكرولتر لمنظمات خدمات الإيدز إلى البطين، على الرغم من هذه النسبة قد تختلف بين الأدوية المختلفة. عند ممارسة، تحقق من تحديد المكان المناسب للإبرة من خلال تقديم 10-20 ميكرولتر من 2.5٪ FastGreen صبغ. يروي الماوس مع 1X PBS 0.03٪ الهيبارين قريبا بعد ضخ صبغة وجعل المقاطع الاكليلية من الدماغ للتحقق من أن الصبغة هي في النظام البطيني (الشكل 3C). <لى> عقد مسحة القطن ضد الجمجمة في قاعدة الإبرة. رفع إبرة بمعدل 1 ملم لكل ثانية. حالما الإبرة خارج الجمجمة، ولفة مسحة القطن خلال ثقب إبرة وعقد لمدة 1 دقيقة لمنع أي ASO من تسرب.
- خياطة الجلد مغلقة، وتطبيق مرهم مضاد حيوي، ومكان الماوس على وسادة ساخنة الانتعاش. اعتمادا على تركيز ASO، قد يستغرق 20 دقيقة إلى بضع ساعات حتى يتعافى تماما.
- فقط كما هو الحال مع زرع مضخة، ومراقبة الفئران يوميا بعد الجراحة للتأكد من الألم / الانزعاج والالتهابات. علاج مع كاربروفين والمضادات الحيوية حسبما تراه ضروريا.
Representative Results
بعد ضخ المضخة أو وقت معين بعد البلعة حقن ICV (نستخدم بشكل روتيني أربعة أسابيع)، من المهم لاختبار فعالية منظمات خدمات الإيدز. ونحن نوصي بأخذ مناطق مختلفة من الدماغ والحبل الشوكي لقياس مستويات / الإسوية من الجين المستهدف، سواء على المستوى الكمي باستخدام مرنا في الوقت الحقيقي PCR وكذلك مستوى البروتين باستخدام إما لطخة غربية أو ELISA (الشكل 4 لسبيل المثال نشرت ). وهذا سوف يساعد تحديد ASO فعالية في جميع أنحاء المناطق CNS مختلفة. إذا كان نصف عمر البروتين المستهدف هو طويل، ونحن ننصح الانتظار لفترة أطول بعد ASO التسريب من أجل تقييم أقصى ضربة قاضية البروتين أو الربط.
ومن المهم أيضا لاختبار التوزيع بنسبة ضئيلة. ضخ مضخة يؤدي في التوزيع من خلال نصفي الكرة الأرضية على حد سواء المماثل والمقابل، على الرغم من تركيز ASO أعلى وغالبا ما ينظر في مناطق أقرب إلى نظام البطين 16. ICV بلعة حقن تسفر عن مزيد من unifoتوزيع RM من خلال الجهاز العصبي المركزي بنسبة ضئيلة 16، على الرغم من أن الآثار قد لا تستمر طويلا. نوجه القارئ إلى ساوثويل وآخرون. لرؤية مقارنة مباشرة لمضخة مقابل بلعة التوزيع بنسبة ضئيلة 16.
نوصي أيضا اختبار جرعات متعددة فضلا عن مدة العمل لمنظمات خدمات الإيدز لأن كل ASO سوف تتصرف بشكل مختلف قليلا في الجسم الحي. منظمات خدمات الإيدز وعادة ما يكون مدة طويلة نسبيا من العمل، مع ضربة قاضية الهدف أو الربط استمرت عدة أشهر بعد التسليم ASO. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بعض منظمات خدمات الإيدز تعمل على نحو أفضل من غيرها، وسوف بعض الأهداف الجين يكون من الأسهل ضربة قاضية من غيرها. وبسبب هذا، عندما ASOS فحص لتحديد مرشح الرصاص، نوصي اختبار لا يقل عن 3-5 منظمات خدمات الإيدز في الجسم الحي مع ن = 4-6 الكبار الفئران في ASO كما تمريرة الأول.
في حالة استخدام المخدرات الأخرى من منظمات خدمات الإيدز، فإنه سيكون من المهم أيضا أن الطيار تركيز المثالي المخدرات، ومدة المخدرات من العمل، والجهاز العصبي المركزي المخدراتتوزيع لهذا المركب محددة.
الجدول 1. جراحة الإحداثيات. الإحداثيات المستخدمة لتصل إلى البطين الجانبي الحق في كل من الفئران والجرذان عندما زرع مضخات ناضح وكذلك إجراء عملية intracerebroventricular (ICV) البلعة. كلا إحداثيات، لمضخات والبلعة ICV، استهداف البطين الجانبي الأيمن. نحن نستخدم مجموعتين مختلفتين لأن هذه هي ما لدينا الأكثر خبرة ومعرفة مع توفير توزيع ممتازة من ASO.
الشكل 1. إعداد التجسيمي. (A) المعدات اللازمة لمضخة التجسيمي Alzet والعمليات الجراحية حقن بولس الأول) حبة الزجاج تعقيمص. الثاني) رقمية عبر الاقمار الصناعية. الثالث) قاعدة التجسيمي بأذرع متحركة. الرابع) درجة الحرارة التي تسيطر عليها سادة التدفئة. V) isoflurane و/ نظام الأوكسجين. السادس) غرفة isoflurane و. (B) عن قرب من مخروط الأنف والأذن القضبان. (C) اثنين من إرفاق المستندات المطلوبة. اليسار: الحقنة / حامل إبرة لحقن ICV البلعة. الحق: سائق قنية لالأسموزي زرع المضخة.
الشكل 2. Alzet الأسموزي زرع مضخة. (A) Alzet خيارات مضخة الاسموزي للفئران. مضخات 14 يوم (0.25 ميكرولتر / ساعة)، ومضخات يوم 28 (0.25 ميكرولتر / ساعة)، و 42 مضخات اليوم (0.15 ميكرولتر / ساعة) (B) إحداثيات لزرع مضخة من bregma: -0.5 مم مؤخره، -1.1 مم الجانبي ( اليمين)، و-2.5 ملم بطني (طول القسطرة). (C) بعد القيادة القسطرة من خلالالجمجمة والإلتصاق قنية، يتم مسح الصبغة عن طريق القسطرة لتقييم التنسيب المناسب للقسطرة في البطين الجانبي. (D) الدماغ Perfused مباشرة بعد صبغ تدار كما في (C). إذا تم وضع القسطرة بنجاح في البطين، وسيتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء منظومة البطين الماوس.
الشكل (3). Intracerebroventricular حقن بولس. (A) المتوافق مع حقن بلعة من bregma: +0.3 ملم الأمامي، -1.0 مم الجانبي (على اليمين)، و-3.0 ملم بطني (B) بعد القيادة الإبرة من خلال الجمجمة -3.0 ملم بطني، يتم الضغط صبغ من خلال حقنة. لتقييم التنسيب المناسب من الإبرة في البطين في وقت لاحق. (C) الدماغ Perfused بعد فترة وجيزة صبغ تدار كما في (B). إذا وضعت إبرة بنجاح في البطين، علىوسيتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء منظومة البطين الماوس.
الشكل 4. أليغنوكليوتيد] العقاقير تقلل SOD1 الفئران في الجسم الحي (الشكل مأخوذة مباشرة من سميث وآخرون. 7). (AD) بواسطة العقاقير SOD1 [أليغنوكليوتيد الهيئة العامة للسدود r146192 أو الهيئة العامة للسدود سارعت وغرست لمدة 28 يوما في البطين الجانبي الأيمن من الفئران العادية بمعدل 100 ميكروغرام / يوم (A) الذاتية مستويات مرنا SOD1 من الدماغ والحبل الشوكي مقاسا QRT-PCR. ( B) SOD1 وA-تويولين مستويات البروتين بعد ASO التسريب. (C و D) مستويات البروتين لتويولين وSOD1 كميا لمناطق مختلفة من الدماغ التالي التسريب. (E) منظمات خدمات الإيدز ضد presenilin 1 أو GSK-3 وبيتا؛ وقد غرست لمدة 2 أسابيع في البطين الجانبي الأيمن من الفئران nontransgenic ومستويات مرنا المقررة في حق أمامي / الزمانية اللحاء. مستنسخة بإذن من الجمعية الأمريكية للالتحقيقات السريرية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 5. تشغيل خياطة مفرش أفقي. وخيوطها 5-0 النايلون خيوط الجروح داخل وخارج الجلد، بدءا الأمامي والخلفي العمل، مع التركيز أكثر على قنية. مرة واحدة بعد أن وصلت إلى النقطة الأكثر الخلفي، ثم يتم جلب خيوط الجروح النسخ الاحتياطي ومترابطة على مدى قنية مرة أخرى. وهذا يضمن إغلاق الجرح السليم ويمنع قنية / أنابيب من العمل من خلال الجلد.
Discussion
القدرة على توصيل الأدوية عالميا في الجهاز العصبي المركزي كما هو موضح في الفيديو هي تقنية قوية للغاية التي هي سهلة التعلم والاستخدام على حد سواء. مع الممارسة، وزرع مضخة واحدة أو ICV بلعة يمكن أن تكتمل في 10 دقيقة، والسماح لأفواج كبيرة من الفئران لتلقي العلاج في نفس الوقت. هذا هو مفيدة بشكل خاص للدراسات مع قراءات السلوكية، كما بأعداد أكبر لسلوك الماوس حاسمة للمساعدة في رؤية اختلافات كبيرة.
وبناء على تجاربنا تقديم خدمات الإيدز عن طريق المضخات وحقن بلعة، لاحظنا بعض الايجابيات والسلبيات لكل طريقة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه هي آراء في مختبرنا، وربما لا يكون صحيحا لجميع الموديلات الماوس والفئران.
نجد الاستفادة من استخدام مضخات هو قدرتها على تقديم كمية عالية من ASO منذ يتم توزيع ASO على مدى فترة أطول بكثير من الوقت. هذا عادة ما يعادل ضربة قاضية يعد المستمر أو الربط بعد نشطASO التسريب، على الرغم من أن هذا قد لا يكون الحال دائما. السماح للمضخات أيضا لوضع جدول زمني دقيق لتسليم ASO (14 يوما، 28 يوما، أو 42 يوما) ويمكن تغيير مضخات مرة واحدة للسماح للتسريب ASO حتى تعد نشطة. ومع ذلك، لاحظنا أن تغيير تضخ أكثر من مرة يزيد من تقلب بسبب تشكيل جيوب ليفية حول المضخة التي تمنع من امتصاص السوائل مضخة بشكل صحيح. والعيب من المضخات هو أن بعض الفئران لا يتسامح مع مضخة، فضلا عن غيرهم. إذا كان خط المعدلة وراثيا كنت تعمل مع أكثر هشاشة، قد يكون مضخة مرهق للغاية. تحتاج إلى مضخات أيضا إلى إزالتها بعد ضخ النهائي، إخضاع الفئران لعملية جراحية أخرى والتخدير المضافة. إذا تقوم بعمل السلوك، من المهم بصفة خاصة لإزالة مضخة والسماح لمدة 1-2 أسابيع على الأقل من الانتعاش منذ وجود المضخة سوف تؤثر على بعض السلوكيات في الفئران.
مع ICV بلعة حقن، ميزة واحدة من حيث التكلفة. هناكالاستثمار مقدما لشراء المحاقن والإبر، ولكن مع مرور الوقت، والحقن البلعة هي فعالة من حيث التكلفة أكثر حيث لا توجد مضخات / أنابيب / أنابيب القسطرة لشراء. وعموما، هناك أقل تصل بين الحفاظ على مع حقن بلعة ICV نظرا لعدم وجود قنية والمضخات. نجد أيضا أن بلعة ICV يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز على الفئران الأصغر سنا الهشة و / أو أكثر. والعيب من ICV بلعة هو أنه في حقنة واحدة. لا قدر ASO العام يمكن تسليمها من خلال هذا الطريق، وإذا كانت مدة عمل ASO المستخدمة قصيرة، فإن الآثار ضربة قاضية / الربط أيضا أن تكون قصيرة الأجل.
كل من مضخات التناضحي فضلا عن البلعة ICV لديها القدرة على تقديم خدمات الإيدز التي يمكن أن البروتينات ضربة قاضية أو تغيير الربط من الجينات في الجهاز العصبي المركزي بأكمله القوارض، وهي تقنية لها تطبيقات واسعة في مجالات متعددة ذات صلة علم الأعصاب. نقترح تجريب كل أساليب التسليم إذا كنت غير متأكد من طريقة التعاطي هو الانسب لبلدكمدراسة pecific.
Disclosures
تلقي الكتاب أليغنوكليوتيد] العقاقير الخاصة بهم من إيزيس الصيدلة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر كيرت ميزر من إيزيس الصيدلة لتقديم المشورة المتعلقة جراحة بلعة ICV، وكذلك إيزيس الصيدلة ككل لتوريد مختبرنا مع منظمات خدمات الإيدز. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر كاري Shaner لمراجعة هذه المادة. معتمدة TMM وSLD بواسطة المعاهد الوطنية للصحة منح P50AG005681، K08NS074194، وR01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
