Summary
We beschrijven een werkwijze om drugs te richten op het centrale zenuwstelsel door of implanteren van een katheter of het uitvoeren van een bolus injectie in de rechter laterale ventrikel in muizen. Wij richten ons specifiek op de levering van antisense oligonucleotiden. Deze techniek gemakkelijk aanpasbaar aan andere drugs en ratten.
Abstract
Als gevolg van een onvermogen om de bloed-hersenbarrière, bepaalde geneesmiddelen rechtstreeks moet worden afgeleverd in het centrale zenuwstelsel (CNS). Ons laboratorium richt zich specifiek op antisense oligonucleotiden (ASO), hoewel het in beeld hier technieken kunnen ook worden gebruikt om een grote verscheidenheid van andere geneesmiddelen te leveren aan het CZS. Antisense oligonucleotiden (ASO's) hebben de mogelijkheid om knockdown sequentie-specifieke doelstellingen 1 en verschuiving isoform verhoudingen van specifieke genen 2. De wijdverspreide gen knockdown of splicing in het CZS van muizen te bereiken, kan de ASO's worden afgeleverd in de hersenen met behulp van twee verschillende routes van toediening, beide demonstreren we in de video.
De eerste toepassingen Alzet osmotische pompen, verbonden met een catheter die chirurgisch geïmplanteerd in de laterale ventrikel. Hierdoor kan de ASO's continu worden toegediend in het CNS gedurende een bepaalde periode van tijd. De tweede betreft een eenmalige bolusinjectie van een high concentratie van ASO in de rechter laterale ventrikel. Beide methoden de muis cerebrale ventriculaire systeem om de ASO leveren voor de hele hersenen en het ruggenmerg, maar afhankelijk van de behoeften van de studie kan een methode de voorkeur boven de andere.
Introduction
Sommige drugs zijn niet in staat om de bloed-hersenbarrière (BBB) te steken, waarbij direct het centrale zenuwstelsel (CZS) levering. Het omzeilen van de BBB, kunnen medicijnen rechtstreeks worden afgeleverd in de hersenen met behulp van de beschreven methoden. Terwijl onze lab en het papier hierin vermelde focus op antisense oligonucleotiden (ASO), andere geneesmiddelen, zoals kleine moleculen, antilichamen, gentherapie vectoren, etc. Kan ook worden geleverd door exact dezelfde benadering.
Bepaalde eiwitten spelen een belangrijke rol in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen. Dergelijke eiwitten vormen vaak giftige en opstapelen in aggregaten, waardoor uiteindelijk neuronale dood en de daaropvolgende neurologische ziekte 3-4. In een poging te vertragen of stoppen van de progressie van deze ziekten, kan een therapeutische optie om rechtstreeks ingrijpen en verminderen de veroorzakende eiwit. Echter, deze proteïnen vaak alomtegenwoordig gevonden door de CNS, waardoor het moeilijk e ze ffectively richten op een wereldwijde schaal.
Om genen in het hele CZS richten, te beheren we ASOs in muis cerebrospinale vloeistof (CSF) via de laterale ventrikel aan de BBB omzeilen. Deze specifieke methode maakt gebruik van de muis ventriculaire systeem dat de hele hersenen en het ruggenmerg baden, waardoor brede verspreiding van de ASO. We gebruiken ASOs die 18-20 mer RNA-moleculen die binden rechtstreeks het doelwit mRNA-sequentie en, afhankelijk van de ASO chemische modificaties, hetzij A) werven RNase-H van de mRNA die tot knockdown degraderen of B) verschuiven alternatieve splicing 1 , 2,16,17. Opgemerkt wordt dat meerdere moleculen aanwezig voor neerhalen een specifiek eiwit in vivo, waaronder shRNA. Omdat deze moleculen zijn niet de focus van dit artikel, verwijzen we de lezer om artikelen die beter detail knockdown werkingsmechanismen en de voordelen / nadelen van elke 5-6.
jove_content "> In eerder werk hebben we ASO gebruikt om het eiwit superoxide dismutase 1 richten (SOD1) in een transgeen ratmodel van amyotrofische laterale sclerose (ALS) 7 (Figuur 4). Mutaties in SOD1 treden bij ongeveer 2% van ALS 8 gevallen, maar het is onlangs verondersteld dat SOD1 een belangrijke rol kunnen spelen sporadische ALS en 9-10. door verlaging totaal SOD1 niveaus in de transgene ALS rat, overleving na aanvang significant gestegen 7. Deze belangrijke gegevens waren de eerste aan te tonen dat een ASO behandeling in het CZS een grote positieve impact op een neurologische ziekte model zou kunnen hebben. Sindsdien hebben ASOs gericht op de menselijke SOD1 met minimale bijwerkingen (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ingevoerd en een Fase I klinische studie met succes afgerond , zoals gepresenteerd op de 2012 64 e jaarlijkse American Academy of Neurology. Plannen om de ASO's vooruit te gaan naar Fase II studies zijn momenteel aan de gang.In al deze studies werden ASOs geleverd aan de laterale ventrikel aan totale gen te verlagen of te wijzigen gen splicing doorhet hele CNS. Zowel osmotische pompen en een enkele bolusinjectie kan worden gebruikt om ASOs leveren aan het CSF. Pompen zorgen voor een langzame, continue levering, terwijl de intracerebroventriculaire (ICV) bolus is een snelle, eenmalige injectie. Wij hebben beide werkwijzen met succes, maar we hebben gemeld de directe vergelijking tussen de pomp en bolus in een transgene lijn.
Gebruik ASOs in het CZS is een krachtige manier om de totale eiwitniveaus en / of verandering van splicing meerdere eiwitten verlagen. Terwijl we gebruiken ASOs uitsluitend als een behandeling voor neurologische aandoeningen, erkennen we dat andere gebieden ook kunnen profiteren van deze techniek. Zolang het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht in het centrale en het uiteindelijke doel is CNS-brede veranderingen in genexpressie, met ASO in de aangetoonde kennis verworven kan zeer nuttig zijn.
Protocol
Het protocol hieronder is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik comites aan de Washington University in St. Louis en is in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren. Als dit je eerste keer uitvoeren van operaties, raden we kijken naar de Jupiter artikel over knaagdieren operaties als een introductie voor het begin 14.
ASOs kan om de muis CNS worden geleverd door zowel osmotische infuuspomp en een enkele injectie ICV bolus. Hierdoor wordt de hieronder beschreven opgesplitst in twee segmenten. Voor-en nadelen van elke methode zal worden aangestipt in het hoofdstuk discussie. De coördinaten worden gebruikt in de protocollen voor volwassen C57BL6 en B6C3 muizen. Overeenkomstige rat coördinaten zijn te vinden in tabel 1.
ALZET osmotische pomp
1. Bereiding van Alzet osmotische pompen
- Voorzien in een steriele drape en zorgvuldig te laten vallen de volgende items op het, terwijl de zorg niet direct iets aan te raken om de steriliteit te behouden: osmotische pomp (en), stromingmodulator (s), 1 ml steriele spuit (s), scalpel en secties van buizen (1 stuk buis = 5 pompen). Voor muizen, zijn er drie mogelijkheden voor pompen: 14 dagen, 28 dagen en 42 dagen (Figuur 2A).
- Haal het beschermkapje en vul steriele 50 ml conische buizen met 15-20 ml zoutoplossing. Tot 6 geassembleerde pompen kunnen per conische buis worden toegevoegd.
- Vul een p60 petrischaal met 100% ethanol. Voeg juiste aantal katheters een ethanol. Voor muizen, katheterlengte is 2,5 mm.
- Filtreer elke ASO in maar 1,5 ml Eppendorf buisjes noodzakelijk. Omvatten een Eppendorf buis gevuld met een steriele 0,9% zoutoplossing om de slang te vullen met.
- Zodra alles is voorbereid, op steriele handschoenen. Zorg ervoor dat niet om iets dat is niet steriel raken. Veranderen handschoenen als nodig.
- Voor elke ASO te gebruiken vult een 1 ml injectiespuiten loadpumps door het plaatsen van de naald in de bovenste gat en langzaam vullen totdat teveel lekt. Doorgaan totdat alle pompen gevuld.
- Haal het beschermkapje van de stroom-modulatoren en invoegen in de pompen. Duw de stroom-modulator bijna alle wijze, waardoor een opening 3-5 mm.
- Met behulp van de scalpel, snijd elk stuk slang in 5 gelijke segmenten. Neem een stuk buis, vul met steriele zoutoplossing met een 1 ml injectiespuit en steek de top van de stromingmodulator in een uiteinde van de slang. Neem dan een canule van de ethanol en sluit deze aan op het andere uiteinde van de slang. De pomp is nu volledig geassembleerd.
- Plaats de volledig gemonteerde pomp in de steriele 50 ml conische buis met een zoutoplossing voor priming. De priming zorgt voor de pompen om te genieten van vocht aan de drug delivery initiëren evenals komen om de juiste temperatuur. Priming tijd: 14 dagen pompen: 4-6 uur, 28 dag pompen: 40 uur, 42 dagen pompen: 60 hr. Wanneer u klaar bent het monteren van de pomp, cap de conische buizen en plaats in een schone37 ° C waterbad tot chirurgie.
2. Pre-operatieve procedure
- Veeg alles naar beneden met 70% ethanol om het gebied te steriliseren en ging steriele doeken over het tafelblad en stereotax een steriel veld te maken. Het is belangrijk bewust van het steriele veld om de hele operatie. Zet de volgende: Bead sterilisator, Verwarming Pad, licht, digitale uitlezing, en zuurstof / isofluraan System (figuur 1).
- De volgende items is noodzakelijk wanneer het doen van een operatie of een hele batch van operaties zoals we routinematig doen: 1 pincet, 1 gebogen hemostat, 1 paar kleine schaar, 1 paar kleine gebogen afgestompte schaar, 1 rat bot mes , 1 rechte hemostat, 5-0 nylon hechtingen, 1 conische buizen met 70% ethanol, 1 conische buis met 95% ethanol, 1 conische buis met jodium, 1 conische buis met waterstofperoxide, pakket van steriele wattenstaafjes, 1 fles super lijm, 1 tube antibiotische zalf, 1 tube van het oogsmeermiddel, en 1 elektrisch scheerapparaat.
- Steek de uiteinden van beide scharen, forceps, en gebogen hemostat in de kraal sterilisator gedurende 15 sec. Verwijderen en in 70% ethanol. Bij het uitvoeren van meerdere operaties, steriliseren de uiteinden van de instrumenten tussen dieren.
- Draai de isofluraan tot 4% en O 2 op 0,4 l / min en directe gasstroom naar de kamer. We hebben onze isofluraan / zuurstofsysteem gekalibreerd, eenmaal per jaar zodat we leveren de juiste hoeveelheid anesthesie. Plaats de muis in de kamer en wacht tot de ademhaling is aanzienlijk vertraagd. Verwijder de muis en het uitvoeren van een teen knijpen om te zorgen voor de muis is volledig onbewust.
- Scheer de haren vanaf de bovenkant van de schouder tot tussen de ogen. Als de muis begint te ontwaken, plaatst u de muis terug in de kamer totdat de muis is weer helemaal onbewust, bevestigen met een teen knijpen. Plaats de verdoofde muis op de stereotax en duw de neuskegel over de neus.Wees voorzichtig als de tanden en botten zijn broos.
- Richt de gasstroom naar de stereotax de muis verdoofd houden. Het is belangrijk om af en toe te controleren om ervoor te zorgen dat de muis is volledig onbewust met een teen knijpen de hele operatie. Beveilig het hoofd met het oor bars. We verkiezen nivellering oor bars, maar de laterale ventrikel gericht, een volledig vlakke schedel is niet nodig omdat de grootte van de ventrikel.
- Draai de isofluraan niveau omlaag tot 2,0% voor onderhoud. Schar oogzalf op elk oog. Zoals gezien in de video, leggen een steriele doek via muis zodat alleen de basis van de nek en het hoofd worden blootgesteld. Te ontsmetten het chirurgische gebied schoon door de bovenkant van het hoofd en de nek in een cirkelvormige beweging vanaf het midden van het geschoren gebied en bewegen naar buiten eerst met een wattenstaafje gedrenkt in 95% ethanol, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in jodium.
- Wij raden het gebruik van een rectale sonde feedback temperatuur verwarmingssysteem dat zorgtde temperatuur van de muis blijft een stabiele 37 ° C. Als de temperatuur van de muis daalt tijdens de operatie kan de postoperatieve herstel langer en de resulterende onderkoeling kan leiden tot afwijkende eiwit activiteit, met inbegrip hyperfosforylering van de microtubule geassocieerd proteïne tau 15. Na het opzetten van het verwarmingssysteem, u bent nu klaar om de operatie te beginnen.
3. Implantatie van Alzet osmotische pomp
- Voor het begin van de operatie, op een nieuw paar steriele handschoenen. Vervolgens, met behulp van een pincet en schaartje, een insnijding in de huid van de basis van de hals boven de schedel van het dier om tussen de ogen
- Neem de stompe schaar met de curve naar boven en schuift onder de huid aan de basis van de nek naar de linker achterpoot. Er zou geen weerstand zijn. Als er, verwijder de schaar en probeer het opnieuw. Dit vormt de subcutane pocket voor de osmotische pomp.
- Wipe de schedel schoon met steriele wattenstaafjes, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide te bregma verbeteren.
- Veeg de 50 ml conische buizen die pompen bevatten om de steriliteit van de pompen te onderhouden. Haal voorzichtig een pomp uit de conische buis met de gebogen hemostaat, waarbij extra zorg dat de pomp niet de zijkanten van de conische buis raakt. Houd de basis van de pomp met een tang en druk de stromingmodulator in de rest van de weg met de gebogen hemostaat.
- Houd de pomp, waar de stroming modulator en slangen ontmoeting met de gebogen hemostaat. Plaats de pomp onder de huid aan de basis van de nek en duw hem terug naar de linker achterbeen zo ver mogelijk naar binnen zonder weerstand. Wees voorzichtig om niet laten de katheter iets aanraakten.
- Met de gebogen hemostaat, pak de canule in de gleuf waar de top aan de sokkel. Verplaats de canule bestuurder op zijn plaats en veilig op zijn plaats.
- Breng een druppel superlijm op basis van de canule. Push de top van de canule in de driver en de positie zodat de buis wijst direct terug.
- Raak de catheter tip om bregma en de coördinaten op het digitale display op nul. Breng de katheter en verplaats 1,1 mm lateraal naar rechts en 0,5 mm posterior (Figuur 2B). Houd de huid uit de weg met de gebogen hemostaat.
- Rij de dunne metalen catheter door de schedel tot de plastic canule voet stevig tegen de bovenkant van de schedel wordt gedrukt. De metalen catheter kan direct door de schedel worden aangedreven in muizen door de relatieve dunne schedel. Bij gebruik van ratten, boor een gat in de schedel vóór het verlagen van de katheter.
- Trek elke huid die lijm op het heeft weg van de schedel. Met de canule bestuurder, houder van de canule / katheter op zijn plaats, wacht 1-2 min. tot de lijm volledig droog.
- Bij het beoefenen, tot plaatsing van de katheter te beoordelen, injecteer 20-40 ul van 2,5% FastGreen Dye door de buis (figuur 2C). Wacht 2-3 min, perfuse de muis met 1X PBS 0,03% heparine, en verwijder de hersenen. Snijd coronaalwaarts op de katheter ter plaatse. Wanneer de katheter in het ventrikel is geplaatst, zal de kleurstof in de muis ventriculaire systeem (figuur 2D) worden geperfundeerd.
- Houd de katheter op zijn plaats met de gebogen hemostaat terwijl het verhogen van de bestuurder. Langzaam los de hemostaat zodat de canule correct aan de schedel wordt bevestigd.
- Met een wattenstaafje, drukt u op de bovenkant van de canule. Monteer de rat bot tondeuse in het bos tussen de boven-en onderkant van de canule. Knip de bovenkant van de canule terwijl nog steeds naar beneden te drukken met het wattenstaafje. Probeer en houd de tondeuse niveau, om zo niet de canule los te maken van de schedel. Als de canule komt unglued, snel re-lijm en druk uit te oefenen met een wattenstaafje voor een extra 2 minuten.
- Met behulp van de met 5-0 hechtdraad, regelmatige hemostaat en tangen, hechtdraad langs de volledige opening, extra aandacht rechts over de canule. We gebruiken een Running horizontale matras hechtdraad (zie figuur 5) door het grotere incisie over de schedel.
- Breng een schar van antibiotische zalf over het hoofd en de nek. Schroef het oor bars en draai de neuskegel. Verwijder de muis uit de stereotax en plaats op een warming pad voor herstel. Controleer de muizen nauwkeurig gedurende de duur van herstel, gewoonlijk tussen 10-30 minuten. Controleer elke 2-3 minuten totdat de muis begint rond te wandelen en verzorgen zelf.
4. Post-operatieve Zorg
- Controleer de muizen dagelijks na de operatie voor de eerste week.
- Als een muis lijkt pijn of angst, aanbevolen die de muis met een 5 mg / kg subcutane injectie van Carprofen eenmaal per 24 uur tot 5 dagen om de pijn te verlichten.
- Indien er sprake is van een infectie, ruim antibiotische zalf op het gebied dagelijks consulteren bijwonen dierenarts dat de wond goed geneest.
- Rchrap het 5-0 nylon hechtdraad 7-10 dagen na de ingreep om irritatie te voorkomen dat de hechtdraad.
5. Aanpassen of Verwijderen Alzet osmotische pomp
Nadat de pomp is gedaan actief infusie ASO, kan evenmin worden veranderd of volledig verwijderd.
- Volg dezelfde pre-chirurgische procedure als hierboven met de volgende wijzigingen: 1) je zal niet de gebogen schaar, gebogen hemostat, rattenbeenmerg cutters, noch de digitale display nodig, en 2) in plaats van prepping de kop van de muis, scheren en desinfecteren de achterkant van de muis op de kruising van de pomp en leidingen.
- Voeg een 1,5 cm insnijding op de rug van de muis, loodrecht op de pomp / buizen knooppunt met tang en schaar. Trek de pomp uit de incisie zonder aanzienlijk te trekken / duwen op de buis als het kan de katheter kan jar.
- Om de pomp te verwijderen, knip de buis ongeveer 0,5 cm boven de stromingmodulator en raak de superlijm om de slang to seal hem dicht. Wacht 1-2 min voor de lijm te drogen. Leg de slang terug in de incisie en hechtdraad gesloten. Schar antibiotische zalf op de huid gehecht en plaats de muis op een verwarmde herstel pad.
- Om de pomp te veranderen, hebben versgemaakte pompen klaar samen met een 10 cm schotel gevuld met 95% ethanol. Katheters zijn niet noodzakelijk de nieuwe pompen.
- Pak een nieuwe pomp met de tang. Dompel je vingers in de ethanol, neemt bezit van de pomp, en gooi de stroom-modulator. Dan, voorzichtig en langzaam trek de oude pomp van de stroom modulator verbonden aan de slang en canule. Zodra het uit langzaam schuif de nieuwe pomp, zodat de stromingmodulator de buitenkant van de muis nooit raakt.
- Plaats de nieuwe pomp door de incisie terug in de onderhuidse pakket en hechtdraad de huid. Schar antibiotische zalf op de wond en plaats muis op herstel pad.
- Net als bij de pomp implantatie bewaken de muizen dagelijks na de operatie te controleren pain / ongemak en infecties. Behandelen met Carprofen en antibiotica als noodzakelijk wordt geacht.
ICV BOLUS
6. Pre-operatieve procedure
- Volg dezelfde pre-chirurgie procedure als bedoeld in sectie 2 hierboven met de volgende wijzigingen: 1) u zult niet gebogen schaar, gebogen hemostaat of rattenbeenmerg frezen nodig; 2) schoon een 10 pi Hamilton spuit en naald met gesteriliseerd water en belasting met ASO, en 3) bevestig de spuit en naald om de stereotaxische apparaat waar de canule chauffeur was gevestigd.
7. Bolus injectie van ASO
- Behulp van een tang en een kleine schaar, een insnijding van de basis van de nek tot tussen de ogen.
- Veeg de schedel schoon met steriele wattenstaafjes, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide te bregma verbeteren.
- Beweeg de spuit / naald op zijn plaats en veilig. Zorg ervoor dat de afgeschuinde gedeelte van de naald geconfronteerd posterior. Verlagende naald totdat deze bregma. Nul al van de coördinaten. Verplaats de naald zijdelings naar rechts 1,0 mm en anterior 0,3 mm (Figuur 3A).
- Langzaam rijdt de naald door de schedel net totdat de naald in een lijn staat met de bovenkant van de schedel. Opnieuw kan dit worden gedaan door de dunheid van de muis schedel. Zero de z-coördinaat en laat de naald tot -3,0 mm met een snelheid van 1 mm / sec (Figuur 3B). Wacht 2-3 min voor de hersenen te dichten rond de naald.
- Lever de volle 10 ul van ASO met een snelheid van 1 pl per sec. Wacht 2-3 min. We maken gebruik van een 1 ui infusiesnelheid voor ASO's in het ventrikel, hoewel dit percentage kan verschillen tussen de verschillende geneesmiddelen. Bij het beoefenen van, controleren op juiste plaatsing van de naald door het leveren van 10-20 ul van 2,5% FastGreen Dye. Perfuseren de muis met 1X PBS 0,03% heparine kort na infusie kleurstof en maak coronale secties van de hersenen te verifiëren dat de kleurstof in het ventriculaire systeem (Figuur 3C). <li> Houd een wattenstaafje tegen de schedel aan de basis van de naald. Zet de naald met een snelheid van 1 mm per seconde. Zodra de naald uit de schedel, rol het wattenstaafje over de naald gat en houd gedurende 1 minuut om te voorkomen dat ASO naar buiten lekken.
- Hechtdraad de huid gesloten, gelden antibiotische zalf, en plaats de muis op verwarmde herstel pad. Afhankelijk van ASO concentratie, kan het 20 minuten duren om een paar uur om volledig te herstellen.
- Net als bij de pomp implantatie bewaken de muizen dagelijks na de operatie om te controleren of pijn / ongemak en infecties. Behandelen met Carprofen en antibiotica als noodzakelijk wordt geacht.
Representative Results
Na infusiepomp of een aangewezen tijd na de bolus injectie ICV (we routinematig vier weken), is het belangrijk om de effectiviteit van de ASO testen. We raden u verschillende gebieden van de hersenen en het ruggenmerg niveaus / isovormen van het doelgen te meten, zowel op het mRNA-niveau met kwantitatieve real-time PCR en het eiwitniveau met behulp van Western blots of ELISA (figuur 4 een voorbeeld gepubliceerd ). Dit zal helpen bij het bepalen ASO effectiviteit in de verschillende CNS regio. Als de halfwaardetijd van het eiwit gericht is lang, adviseren we langer wachten na infusie ASO om maximale proteïne knockdown of splicing beoordelen.
Het is ook belangrijk om oligo distributie te proberen. Pomp infusies leiden tot distributie via zowel de ipsilaterale en contralaterale hemisferen, hoewel een hogere ASO concentratie wordt vaak gezien in gebieden die dichter bij het ventriculaire systeem 16. ICV bolus injecties geven een meer uniform distributie van oligo via de CNS 16, hoewel de effecten kunnen niet zo lang. Wij leiden de lezer naar Southwell et al.. Om een directe vergelijking van de pomp versus bolus oligo distributie 16 zien.
Wij bevelen ook het testen van meerdere doses, evenals de duur van de werking van de ASO's omdat elke ASO iets anders zal gedragen in vivo. ASOs hebben meestal een relatief lange werkingsduur, met doel knockdown of splicing van enkele maanden na ASO levering. Daarnaast zullen sommige ASOs beter werken dan anderen en sommige gendoelstellingen zal makkelijker te knockdown dan anderen. Hierdoor bij screening ASOS de belangrijkste kandidaat bepalen raadzaam proef ten minste 3-5 ASO in vivo met n = 4-6 volwassen muizen per ASO als eerste pass.
Bij gebruik van een andere dan ASOs drug, zal het ook van belang om piloot te zijn de ideale concentratie drug, drug werkingsduur, en CNS drugsdistributie voor die specifieke verbinding.
Tabel 1. Chirurgie Coördinaten. De coördinaten worden gebruikt om de juiste laterale ventrikel hit in zowel muizen en ratten bij het implanteren van osmotische pompen alsmede het uitvoeren van een intracerebroventriculaire (ICV) bolus. Beide coördinaten, voor pompen en ICV bolus, richten de rechter laterale ventrikel. We maken gebruik van twee verschillende sets omdat deze zijn wat we hebben de meeste ervaring met en kennis zorgen voor een uitstekende verdeling van de ASO.
Figuur 1. Stereotaxisch Setup. (A) De nodige stereotaxisch apparatuur voor Alzet pomp en Bolus injectie operaties. I) Glass Bead steriliserenii. r) digitale uitlezing. iii) Stereotaxische basis met bewegende armen. iv) Temperature Controlled verwarming pad. v) Isoflurane / zuurstofsysteem. vi) Isoflurane Kamer. (B) Close-up van de neuskegel en oor bars. (C) Twee bijlagen vereist. Links: Spuit / naald houder voor ICV bolus injecties. Rechts: Canule Driver voor osmotische pomp implantatie.
Figuur 2. Alzet osmotische pomp Implantatie. (A) Alzet osmotische pomp opties voor muizen. . 14 daagse pompen (0,25 pl / uur), 28 dag pompen (0,25 pl / uur), 42 dag pompen (0,15 pl / uur) (B) Coördinaten voor pomp implantatie van bregma: -0.5 mm posterior, -1,1 mm Laterale ( rechts) en -2,5 mm ventrale (lengte van katheter). (C) na het aandrijven van de katheter door deschedel en lijmen van de canule, wordt kleurstof doorgespoeld katheter juiste plaatsing van de katheter in de laterale ventrikel te beoordelen. (D) geperfuseerd hersenen onmiddellijk na kleurstof toegediend als in (C). Als katheter correct is geplaatst ventrikel, zal de kleurstof in de muis ventrikelsysteem verdeeld.
Figuur 3. Intracerebroventriculaire Bolus injectie. (A) Coördinaten voor bolus injectie van bregma: 0,3 mm Anterior, -1,0 mm zijdelings (rechts), en -3,0 mm ventrale (B) Na het rijden van de naald door de schedel -3,0 mm ventrale, wordt kleurstof geduwd door de spuit. om juiste plaatsing van de naald beoordelen de latere ventrikel. (C) geperfuseerd hersenen kort na kleurstof toegediend als in (B). Als de naald met succes is geplaatst in ventrikel, dekleurstof in de muis ventrikelsysteem verdeeld.
Figuur 4. Antisense oligonucleotiden verminderen rat SOD1 in vivo (figuur direct van Smith et al.. 7). (AD) Antisense oligonucleotiden SOD1 SOD r146192 of SOD gecodeerd werden toegediend gedurende 28 dagen in de rechter laterale ventrikel van normale ratten bij 100 ug / dag. (A) Endogene SOD1 mRNA niveaus van hersenen en ruggenmerg gemeten met qRT-PCR. ( B) SOD1 en a-tubuline eiwit niveaus na infusie ASO. (C en D) Eiwitgehalte voor tubuline en SOD1 gekwantificeerd voor verschillende gebieden van de hersenen na infusie. (E) ASO tegen preseniline 1 of GSK-3 beta en, Werden toegediend gedurende 2 weken in het rechter laterale ventrikel van niet-transgene muizen en mRNA beoordeeld in de rechter frontale / temporale cortex. Overgenomen met toestemming van de American Society for Clinical Investigation. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Hardlopen Horizontale Matras Hechtingen. 5-0 nylon hechtdraad wordt geweven in en uit de huid, beginnend anterieure en posterieure werken, concentreert zich meer op de canule. Zodra de meest achterste punt te hebben bereikt, wordt de hechtdraad dan terug gebracht en schroefdraad over de canule eens meer. Dit zorgt voor een goede wondsluiting en voorkomt de canule / slang van werken via de huid.
Discussion
De mogelijkheid om geneesmiddelen wereldwijd leveren in het CZS zoals in beeld is een zeer krachtige techniek die zowel makkelijk te leren en te gebruiken. Met de praktijk kan een enkele pomp of een implantatie ICV bolus worden afgerond in 10 min, waardoor grote cohorten van muizen tegelijkertijd te behandelen. Dit is vooral nuttig voor studies met gedrags uitlezing, als grotere aantallen voor muisgedrag cruciaal om significante verschillen zien.
Op basis van onze ervaringen leveren ASOs via pompen en bolus injecties, hebben we een aantal voor-en nadelen waargenomen aan elke methode. Opgemerkt moet worden dat dit de mening in ons lab en niet waar voor alle muis en rat modellen.
Wij vinden een voordeel van de pompen is hun vermogen om een grote hoeveelheid ASO leveren omdat de ASO wordt verdeeld over een veel langere periode. Dit komt neer meestal om langer aanhoudende knockdown of splicing na actieveASO infusie, hoewel dit niet altijd het geval. De pompen ook zorgen voor een precieze tijdsbestek van ASO levering (14 dagen, 28 dagen, of 42 dagen) en de pompen kan een keer worden gewijzigd om rekening te houden nog langer actief infusie ASO. Wij hebben echter gemerkt dat het veranderen pompen meer dan eens vergroot de variabiliteit door de vorming van vezelig zakken rond de pomp voorkomen dat de pomp goed absorberen vloeistof. Een nadeel van de pompen is dat sommige muizen niet de pomp verdragen en anderen. Als de transgene lijn waarmee u werkt is kwetsbaarder, kan een pomp zijn te omslachtig. De pompen moeten ook na de laatste infusie te verwijderen, het onderwerpen van de muizen een operatie en extra narcose. Als dit gedrag werk, is het vooral belangrijk om de pomp te verwijderen en wacht ten minste 1-2 weken van herstel omdat de aanwezigheid van de pomp beïnvloeden bepaalde gedragingen in muizen.
Met ICV bolus injecties, een voordeel is de kosten. Er is eeninvesteringen vooraf aan het spuiten en naalden te kopen, maar na verloop van tijd, bolus injecties zijn meer rendabel omdat er geen pompen / slangen / katheters aan te schaffen. Kortom, er minder up-houden met de ICV bolusinjecties door het ontbreken van canules en pompen. We vinden dat ICV bolus kan worden gebruikt om ASOs leveren jonger en / of kwetsbaarder muizen. Een nadeel van de ICV bolus is dat het een enkele injectie. Niet zo veel algemene ASO kan worden geleverd via deze route, en als de werkingsduur van de ASO in gebruik is kort, zal de knock-down / splicing effecten ook van korte duur zijn.
Zowel de osmotische pompen en de ICV bolus hebben de mogelijkheid om ASOs leveren die kan knockdown eiwitten of wijzigen splicing van genen in het gehele CNS knaagdier, een techniek die brede toepassing in verschillende neurologie-gerelateerde gebieden heeft. We raden loodsen beide methoden voor de levering als u niet zeker weet welke route van toediening is het meest geschikt voor uw sijzondere studie.
Disclosures
De auteurs ontvangen hun antisense oligonucleotiden van Isis Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Wij willen Curt Mazer bedanken van Isis Pharmaceuticals voor het verstrekken van advies met betrekking tot de ICV bolus operatie, evenals Isis Pharmaceuticals als geheel voor het leveren van onze lab met ASO. Verder willen we Carey Shaner bedanken voor het beoordelen van dit artikel. TMM en SLD worden ondersteund door NIH Grants P50AG005681, K08NS074194 en R01NS078398.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
