Summary
हम या तो एक कैथेटर दाखिल या चूहों में सही पार्श्व वेंट्रिकल में एक सांस में इंजेक्शन प्रदर्शन से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए दवाओं को लक्षित करने के लिए एक विधि का वर्णन है. हम antisense oligonucleotides के वितरण पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित. इस तकनीक को अन्य दवाओं के लिए और चूहों को आसानी से अनुकूलनीय है.
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में असमर्थता के कारण, कुछ दवाओं सीधे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में वितरित किए जाने की जरूरत है. यहाँ वीडियो में दिखाया तकनीक भी सीएनएस के लिए अन्य दवाओं के ढेर सारे देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हालांकि हमारी प्रयोगशाला, antisense oligonucleotides (ASOS) पर विशेष रूप से केंद्रित है. Antisense oligonucleotides (ASOS) पछाड़ना अनुक्रम विशेष लक्ष्य 1 के साथ ही विशिष्ट जीन 2 की पारी isoform के अनुपात की क्षमता है. चूहों के सीएनएस में बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना या splicing के लक्ष्य को हासिल करने के लिए, ASOS हम वीडियो में प्रदर्शित दोनों जिनमें से प्रशासन के दो अलग मार्गों का उपयोग कर मस्तिष्क में दिया जा सकता है.
पहले का उपयोग करता शल्य चिकित्सा पार्श्व वेंट्रिकल में प्रत्यारोपित किया जाता है कि एक कैथेटर से जुड़ा आसमाटिक पंप, Alzet. इस ASOS लगातार समय की एक निर्दिष्ट अवधि के लिए सीएनएस में संचार की अनुमति देता है. दूसरा एक उच्च का एक भी सांस में इंजेक्शन शामिलसही पार्श्व वेंट्रिकल में आसो जी एच एकाग्रता. अध्ययन की जरूरतों पर निर्भर करता है, एक विधि दूसरे पर पसंद किया जा सकता है, हालांकि दोनों तरीकों, पूरे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को आसो वितरित करने के लिए माउस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर सिस्टम का उपयोग करें.
Introduction
कुछ दवाओं सीधे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) वितरण की आवश्यकता होती है, रक्त मस्तिष्क (BBB) बाधा को पार करने में असमर्थ हैं. बीबीबी को नाकाम करने के लिए, दवाओं वर्णित तरीकों का उपयोग कर मस्तिष्क में सीधे दिया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला और antisense oligonucleotides पर कागज विस्तृत यहां ध्यान केंद्रित (ASOS), इस तरह के छोटे अणुओं, एंटीबॉडी, जीन थेरेपी वैक्टर, आदि. के रूप में अन्य दवाओं,, भी सटीक एक ही दृष्टिकोण के माध्यम से दिया जा सकता है.
कुछ प्रोटीन neurodegenerative रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई भूमिका निभाते हैं. इस तरह के प्रोटीन अक्सर अंतिम neuronal मौत और बाद में स्नायविक रोग 3-4 करने के लिए अग्रणी, समुच्चय में विषाक्त प्रजातियों फार्म और संचित. इन रोगों की प्रगति धीमी या भी रोकने के प्रयास में, एक चिकित्सकीय विकल्प सीधे लक्ष्य और प्रेरणा का प्रोटीन कम करने के लिए हो सकता है. हालांकि, इन प्रोटीनों अक्सर यह मुश्किल ई करने के लिए कर रही है, सीएनएस के माध्यम से सर्वत्र पाए जाते हैं ffectively एक वैश्विक स्तर पर उन्हें निशाना.
पूरे सीएनएस भर जीन को लक्षित करने के लिए, हम बीबीबी बाईपास के लिए पार्श्व वेंट्रिकल के माध्यम से माउस मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में ASOS प्रशासन. इस विशेष विधि ASOS के व्यापक वितरण की अनुमति, पूरे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी bathes कि माउस वेंट्रिकुलर सिस्टम का फायदा उठाते हैं. हम पछाड़ना के लिए अग्रणी mRNA नीचा दिखाना या बी) वैकल्पिक splicing 1 शिफ्ट करने के लिए या तो एक) भर्ती RNase एच, आसो रासायनिक संशोधनों पर निर्भर करता है, सीधे लक्ष्य mRNA अनुक्रम कि बाँध 18-20 मेर आरएनए अणुओं की तरह कर रहे हैं कि ASOS उपयोग और , 2,16,17. यह कई अणुओं shRNA सहित, vivo में एक विशेष प्रोटीन नीचे दस्तक के लिए मौजूद है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इन अणुओं इस लेख का ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे हैं, हम लेख की समीक्षा के लिए पाठक को निर्देशित कि बेहतर विस्तार पछाड़ना कार्रवाई के तंत्र और प्रत्येक 5-6 से लाभ / हानि.
पहले काम में jove_content ">, हम Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) 7 (चित्रा 4) के एक ट्रांसजेनिक चूहे मॉडल में प्रोटीन superoxide dismutase 1 (SOD1) को लक्षित करने के लिए ASOS का इस्तेमाल किया है. SOD1 में उत्परिवर्तन होते सभी ए एल एस के लगभग 2% में मामलों 8, यह हाल ही में SOD1 शुरुआत काफी 7 बढ़ा दिया गया था के बाद ए एल एस ट्रांसजेनिक चूहे, अस्तित्व में कुल SOD1 के स्तर को कम करके के रूप में अच्छी तरह से 9-10. छिटपुट ए एल एस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं धारणा रही है कि यद्यपि. ये महत्वपूर्ण डेटा पहले थे सीएनएस में एक आसो उपचार एक स्नायविक रोग मॉडल पर एक गहरा सकारात्मक प्रभाव हो सकता है दिखाने के लिए. तब से, मानव SOD1 को निशाना बनाया ASOS न्यूनतम दुष्प्रभाव (Clnicaltrails.gov NCT01041222) के साथ प्रवेश किया और सफलतापूर्वक मैं मानव नैदानिक परीक्षण एक चरण पूरा कर लिया है , के रूप में तंत्रिका विज्ञान के 2012 64 वीं वार्षिक अमेरिकन अकादमी में प्रस्तुत किया. परीक्षण द्वितीय चरण के लिए आगे ASOS स्थानांतरित करने की योजना वर्तमान में चल रहे हैं.इन अध्ययनों के सभी में, ASOS के माध्यम से कुल जीन का स्तर कम या जीन splicing को बदलने के लिए पार्श्व वेंट्रिकल के लिए दिया गयापूरे सीएनएस. आसमाटिक पंप और एक ही सांस में इंजेक्शन दोनों सीएसएफ को ASOS देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Intracerebroventricular (ICV) सांस में एक तेजी से, एक बार इंजेक्शन है जबकि पंप्स, एक धीमी, सतत प्रसव के लिए अनुमति देते हैं. हम एक भी ट्रांसजेनिक लाइन में पंप और सांस के बीच सीधी तुलना की सूचना नहीं है हालांकि हम सफलता के साथ इन तरीकों के दोनों का इस्तेमाल किया है.
सीएनएस में ASOS का प्रयोग कुल प्रोटीन का स्तर और / या कई प्रोटीन के परिवर्तन splicing के कम करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. हम मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए एक इलाज के रूप में विशेष रूप से ASOS उपयोग करते हुए, हम अन्य क्षेत्रों में भी इस तकनीक से लाभ उठा सकती हैं. ब्याज की प्रोटीन के रूप में लंबे समय तक सीएनएस में व्यक्त की है और अंतिम लक्ष्य का प्रदर्शन तकनीक में ASOS उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति में सीएनएस में व्यापक परिवर्तन, प्राप्त करने के लिए है के रूप में बहुत उपयोगी हो सकता है.
Protocol
नीचे प्रोटोकॉल सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित और प्रायोगिक पशुओं के इस्तेमाल के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुपालन में किया गया है. इस सर्जरी प्रदर्शन आपकी पहली बार है, तो हम 14 की शुरुआत से पहले एक परिचय के रूप कृंतक सर्जरी पर जौव लेख देखने की सलाह देते.
ASOS आसमाटिक पंप लगाने और एक भी ICV सांस में इंजेक्शन के माध्यम से दोनों माउस सीएनएस के लिए दिया जा सकता है. इस वजह से, नीचे विस्तृत प्रक्रिया दो खंडों में टूट गया है. प्रत्येक विधि के लिए पेशेवरों और विपक्ष चर्चा अनुभाग में पर छुआ जाएगा. प्रोटोकॉल में इस्तेमाल निर्देशांक वयस्क C57BL6 और B6C3 चूहों के लिए कर रहे हैं. इसी चूहा निर्देशांक तालिका 1 में पाया जा सकता है.
ALZET आसमाटिक पंप
1. Alzet आसमाटिक पंप्स की तैयारी
- एक बाँझ ड्रॉप नीचे लेटाओई और सीधे बाँझपन बनाए रखने के लिए कुछ भी छू नहीं ख्याल रख रही है, जबकि इसे ध्यान पर निम्न आइटम ड्रॉप: आसमाटिक पंप (एस), प्रवाह न्यूनाधिक (एस), 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज (एस), स्केलपेल ब्लेड, और टयूबिंग के वर्गों (ट्यूबिंग = 5 पंप के 1 टुकड़ा). 14 दिन, 28 दिन और 42 दिन (2A चित्रा): चूहों के लिए, पंपों के लिए तीन विकल्प हैं.
- खुलना और 15-20 मिलीलीटर खारा समाधान के साथ बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब भरना. ऊपर 6 इकट्ठे पंप शंक्वाकार ट्यूब प्रति जोड़ा जा सकता है.
- 100% इथेनॉल के साथ एक P60 पेट्री डिश भरें. इथेनॉल के लिए कैथेटर की उपयुक्त संख्या में जोड़ें. चूहों के लिए, कैथेटर लंबाई 2.5 मिमी है.
- आवश्यक के रूप में 1.5 के रूप में कई मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में प्रत्येक आसो फ़िल्टर. साथ ट्यूबिंग भरने के लिए बाँझ 0.9% खारा से भरा एक Eppendorf ट्यूब में शामिल हैं.
- सब कुछ तैयार हो जाने के बाद, बाँझ दस्ताने पर डाल दिया. बाँझ नहीं है कि कुछ भी स्पर्श नहीं करना सुनिश्चित करें. आवश्यक के रूप में दस्ताने बदलें.
- प्रत्येक आसो इस्तेमाल किया जा करने के लिए, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरेंऔर ऊपर छेद में सुई रखने और धीरे धीरे जब तक अतिरिक्त लीक भरकर loadpumps. पंप के सभी भर रहे हैं जब तक जारी रखें.
- प्रवाह modulators के खुलना और पंपों में डालें. एक 3-5 मिमी के अंतर को छोड़ रहा है, लगभग सभी में जिस तरह का प्रवाह न्यूनाधिक पुश.
- स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, 5 बराबर खंडों में ट्यूबिंग का एक टुकड़ा काट. ट्यूबिंग का एक टुकड़ा ले लो, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर बाँझ खारा के साथ भरने, और टयूबिंग के एक छोर में प्रवाह न्यूनाधिक के ऊपर डालें. फिर इथेनॉल से एक प्रवेशनी ले और टयूबिंग के दूसरे छोर से कनेक्ट. पंप अब पूरी तरह से इकट्ठा किया है.
- भड़काना के लिए नमक के साथ बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूरी तरह से इकट्ठे पंप रखें. भड़काना दवा वितरण आरंभ करने के लिए तरल पदार्थ को सोख लेते हैं और साथ ही उचित तापमान पर आने के लिए पंपों के लिए अनुमति देता है. भड़काना समय: 14 दिन पंपों: 4-6 घंटा, 28 दिन पंपों: 40 घंटा, 42 दिन पंपों: 60 घंटा. पंप संयोजन समाप्त होने पर, एक साफ में शंक्वाकार ट्यूबों और जगह टोपी37 डिग्री सर्जरी तक सेल्सियस पानी के स्नान.
2. पूर्व शल्य प्रक्रिया
- क्षेत्र बाँझ और एक बाँझ क्षेत्र बनाने के लिए तालिका के शीर्ष और stereotax पर बाँझ पर्दे डालने के लिए 70% इथेनॉल के साथ नीचे सब कुछ साफ कर लें. यह पूरी सर्जरी भर बाँझ क्षेत्र के प्रति जागरूक होना जरूरी है. निम्नलिखित चालू करें: मनका अजीवाणु, हीटिंग पैड, लाइट, डिजिटल readout, और ऑक्सीजन / Isoflurane प्रणाली (चित्रा 1).
- संदंश का 1 जोड़ी, 1 घुमावदार hemostat, छोटी कैंची की 1 जोड़ी, छोटे घुमावदार पा कैंची की 1 जोड़ी, 1 चूहा हड्डी कटर: एक भी सर्जरी या एक पूरी बैच सर्जरी से हम नियमित तौर पर कर के रूप में या तो कर रही हैं निम्नलिखित मदों की आवश्यकता होगी , 1 सीधे hemostat, 5-0 नायलॉन सीवन, 70% इथेनॉल के साथ 1 शंक्वाकार ट्यूबों, 95% इथेनॉल के साथ 1 शंक्वाकार ट्यूब, आयोडीन के साथ 1 शंक्वाकार ट्यूब, हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ 1 शंक्वाकार ट्यूब, बाँझ कपास swabs का पैकेज, सुपर की 1 बोतल गोंद, 1 ट्यूब एंटीबायोटिक मलहम, आंख की 1 ट्यूबस्नेहक, और 1 इलेक्ट्रिक शेवर.
- 15 सेकंड के लिए मनका अजीवाणु में कैंची, संदंश, और घुमावदार hemostat के दोनों जोड़े के सुझावों रखें. निकालें और 70% इथेनॉल में जगह है. एक से अधिक सर्जरी प्रदर्शन करते हैं, जानवरों के बीच में उपकरणों के सुझावों को फिर से बाँझ.
- 4% से isoflurane और हे 2-0.4 एल / मिनट और चैम्बर के लिए प्रत्यक्ष गैस प्रवाह कर दें. हम संज्ञाहरण की उचित मात्रा में वितरित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक वर्ष में कम से कम एक calibrated हमारे isoflurane / ऑक्सीजन सिस्टम है. जगह चैम्बर में माउस और सांस लेने तक इंतजार काफी धीमा है. माउस निकालें और माउस को पूरी तरह से बेहोश है यह सुनिश्चित करने के लिए एक पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन करते हैं.
- ऊपर आंखों के बीच में कंधे के ऊपर से बाल दाढ़ी. माउस को जगाने के लिए शुरू होता है, तो माउस एक पैर के अंगूठे चुटकी के साथ की पुष्टि, फिर पूरी तरह से बेहोश है, जब तक चेंबर में वापस माउस जगह. Stereotax पर anesthetized माउस प्लेस और नाक पर नाक शंकु धक्का.दांत और हड्डियों को कमजोर कर रहे हैं के रूप में कोमल.
- माउस संवेदनाहृत रखने के लिए stereotax को गैस प्रवाह प्रत्यक्ष. यह कभी कभी माउस सर्जरी के दौरान एक पैर के अंगूठे चुटकी के साथ पूरी तरह से बेहोश है सुनिश्चित करने के लिए जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. कान सलाखों के साथ सिर सुरक्षित. हम पार्श्व वेंट्रिकल लक्षित करने के लिए हालांकि, कान सलाखों समतल पसंद करते हैं, एक पूरी तरह से स्तर खोपड़ी कारण निलय के बड़े आकार के लिए आवश्यक नहीं है.
- रखरखाव के लिए 2.0% के isoflurane के स्तर से नीचे बारी. हर आंख पर थपका आँख मरहम. वीडियो में देखा के रूप में गर्दन और सिर के ही आधार उजागर कर रहे हैं, ताकि माउस पर एक बाँझ कपड़ा रखना. फिर मुंडा क्षेत्र के केंद्र में शुरू करने और झाड़ू झाड़ू आयोडीन में डूबा एक कपास, जिसके बाद 95% इथेनॉल में डूबा एक कपास के साथ पहली बार बाहर की तरफ बढ़ रहा है एक परिपत्र गति में सिर और गर्दन के ऊपर पोंछते द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित.
- हम यह सुनिश्चित करता है कि एक गुदा जांच प्रतिक्रिया तापमान नियंत्रित हीटिंग सिस्टम का उपयोग करना चाहियेमाउस का तापमान एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस पर बना हुआ है माउस का तापमान सर्जरी के दौरान कम हो जाती है, के बाद सर्जरी वसूली समय लग सकता है और जिसके परिणामस्वरूप हाइपोथर्मिया प्रोटीन ताउ 15 संबद्ध microtubule के hyperphosphorylation सहित, न्यायपालिका प्रोटीन गतिविधि हो सकती है. हीटिंग सिस्टम स्थापित करने के बाद, आप अब सर्जरी शुरू करने के लिए तैयार हैं.
3. Alzet परासरणी पम्प का आरोपण
- सर्जरी शुरू करने से पहले, बाँझ दस्ताने की एक नई जोड़ी पर डाल दिया. फिर, संदंश और कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग कर, आँखों के बीच में अप करने के लिए जानवर की खोपड़ी के ऊपर गर्दन के आधार से त्वचा में एक चीरा बनाने
- ऊपर का सामना करना पड़ अवस्था के साथ पा कैंची ले लो और छोड़ दिया hindlimb की ओर गर्दन पीठ के आधार पर त्वचा के नीचे स्लाइड. कोई विरोध नहीं होना चाहिए. अगर वहाँ है, कैंची हटाने और पुन: प्रयास करें. इस आसमाटिक पंप के लिए चमड़े के नीचे जेब रूपों.
- वाईपे एक कपास झाड़ू द्वारा पीछा बाँझ कपास swabs के साथ साफ खोपड़ी, पर्वबिन्दु बढ़ाने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड में डूबा हुआ है.
- पंप के बाँझपन बनाए रखने के लिए पंप होते हैं कि 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब नीचे साफ कर लें. ध्यान पंप शंक्वाकार ट्यूब के पक्ष स्पर्श नहीं करता कि अतिरिक्त ध्यान रखने, घुमावदार hemostat का उपयोग कर शंक्वाकार ट्यूब से एक पंप ले. संदंश के साथ पंप के आधार पकड़ो और घुमावदार hemostat के साथ जिस तरह के बाकी हिस्सों में प्रवाह न्यूनाधिक धक्का.
- प्रवाह न्यूनाधिक और ट्यूबिंग घुमावदार hemostat के साथ मिलने जहां पंप पकड़ो. गर्दन के आधार पर त्वचा के तहत पंप डालें और जहाँ तक यह प्रतिरोध के बिना जाना होगा के रूप में छोड़ दिया hindlimb की ओर वापस धक्का. कैथेटर स्पर्श कुछ भी नहीं जाने के लिए सावधान रहें.
- घुमावदार hemostat के साथ, शीर्ष कुरसी से मिलता है, जहां नाली में प्रवेशनी हड़पने. स्थिति में प्रवेशनी ड्राइवर ले जाएँ और जगह में सुरक्षित है.
- प्रवेशनी के आधार पर सुपर गोंद की एक बूंद रखें. मवादज ड्राइवर और ट्यूबिंग सीधे वापस ओर इशारा किया जाता है तो उस स्थिति में प्रवेशनी के ऊपर.
- पर्वबिन्दु को कैथेटर टिप टच और डिजिटल डिस्प्ले पर निर्देशांक शून्य. कैथेटर उठाएँ और सही और पीछे 0.5 मिमी (चित्रा 2 बी) को पार्श्वतः 1.1 मिमी चाल. घुमावदार hemostat के साथ रास्ते से बाहर त्वचा पकड़ो.
- प्लास्टिक प्रवेशनी आधार सुरक्षित रूप से खोपड़ी के शीर्ष के खिलाफ दबाया जाता है जब तक खोपड़ी के माध्यम से पतली धातु कैथेटर ड्राइव. धातु कैथेटर रिश्तेदार पतली खोपड़ी के कारण चूहों में खोपड़ी के माध्यम से सीधे प्रेरित किया जा सकता है. चूहों का उपयोग करते हैं, कैथेटर को कम करने से पहले खोपड़ी में एक छेद ड्रिल.
- दूर खोपड़ी से उस पर गोंद है कि किसी भी त्वचा खींचो. जगह में प्रवेशनी / कैथेटर पकड़े प्रवेशनी चालक के साथ, पूरी तरह से सूखे के लिए गोंद के लिए 1-2 मिनट रुको.
- कैथेटर प्लेसमेंट का आकलन करने के लिए, जब अभ्यास, ट्यूबिंग (चित्रा -2) के माध्यम से 2.5% FastGreen डाई की 20-40 μl इंजेक्षन. 2-3 मिनट, perfus रुको1X पीबीएस 0.03% हेपरिन के साथ ई माउस, और मस्तिष्क को हटा दें. कैथेटर साइट पर coronally काटें. कैथेटर निलय में रखा गया था, तो डाई माउस वेंट्रिकुलर सिस्टम (चित्रा 2 डी) भर perfused जाएगा.
- ड्राइवर को ऊपर उठाने, जबकि घुमावदार hemostat के साथ जगह में कैथेटर पकड़ो. धीरे धीरे प्रवेशनी ठीक से खोपड़ी के लिए सुरक्षित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए hemostat के रिलीज.
- एक कपास झाड़ू के साथ, प्रवेशनी के शीर्ष पर नीचे प्रेस. प्रवेशनी के शीर्ष और आधार के बीच ग्रोव में चूहे हड्डी कतरनी फ़िट. अभी कपास झाड़ू के साथ नीचे दबाने जबकि प्रवेशनी के ऊपर से क्लिप. कतरनी स्तर की कोशिश करो और रखने के लिए इतनी के रूप में खोपड़ी से प्रवेशनी अलग करने के लिए नहीं. प्रवेशनी unglued आ पाता है, तो जल्दी से फिर से गोंद और एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए एक कपास झाड़ू के साथ दबाव लागू होते हैं.
- सही प्रवेशनी पर अतिरिक्त ध्यान दे, 5-0 सीवन धागे, नियमित hemostat, और संदंश, पूर्ण उद्घाटन के साथ सीवन का उपयोग करना. हम एक भाग रहा उपयोगखोपड़ी के ऊपर बड़ा चीरा के कारण छ क्षैतिज गद्दा सिवनी (चित्रा 5).
- सिर और गर्दन पर एंटीबायोटिक मलहम का एक थपका लागू करें. खोल देना कान सलाखों और नाक शंकु ढीला. वसूली के लिए एक वार्मिंग पैड पर stereotax और जगह से माउस निकालें. आम तौर पर 10-30 मिनट से लेकर वसूली की अवधि के लिए बारीकी से चूहों की निगरानी करें. माउस के चारों ओर घूमना और खुद को संवारने शुरू होता है जब तक हर 2-3 मिनट की जाँच करें.
4. पोस्ट ऑपरेटिव केयर
- पहले सप्ताह के लिए सर्जरी के बाद दैनिक चूहों मॉनिटर.
- एक चूहे दर्द या संकट में प्रतीत होता है, तो हम दर्द को दूर करने के लिए आदेश में करने के लिए 5 दिनों के लिए हर 24 घंटे में एक बार Carprofen की 5 मिलीग्राम / किग्रा उपचर्म इंजेक्शन के साथ माउस को उपलब्ध कराने की सलाह देते हैं.
- एक संक्रमण प्रतीत होता है, उदारता से दैनिक क्षेत्र के लिए एंटीबायोटिक मलहम लागू करते हैं और घाव ठीक से भर देता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक भाग लेने के पशु चिकित्सक से परामर्श.
- आर5-0 नायलॉन सीवन सीवन धागे से जलन रोकने के लिए सर्जरी के बाद 7-10 दिनों emove.
5. Alzet परासरणी पम्प बदलने या निकाल रहा है
पंप सक्रिय आसो infusing बाद किया जाता है, यह या तो बदल गया है या पूरी तरह से हटाया जा सकता है.
- निम्न बदलावों के साथ ऊपर के रूप में ही पूर्व शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का पालन करें: 1) आप घुमावदार कैंची, घुमावदार hemostat, चूहे हड्डी कटर, न ही डिजिटल प्रदर्शन की जरूरत नहीं होगी, और बजाय माउस का सिर prepping के 2), दाढ़ी और पंप और टयूबिंग के जंक्शन पर माउस की पीठ कीटाणुरहित.
- संदंश और कैंची का उपयोग, सीधा पंप / ट्यूबिंग जंक्शन के लिए, माउस की पीठ पर एक 1.5 सेमी चीरा. ध्यान से काफी खींच / यह कैथेटर जार सकता है ट्यूबिंग पर भेजे बिना चीरा के बाहर पंप खींच.
- पंप निकालने के लिए, के बारे में 0.5 सेमी प्रवाह न्यूनाधिक ऊपर ट्यूबिंग क्लिप और टयूबिंग के लिए टी superglue छूनेओ सील इसे बंद. सूखे के लिए गोंद के लिए 1-2 मिनट रुको. ट्यूबिंग वापस चीरा और सिवनी बंद में रखें. Sutured त्वचा और जगह एक गर्म वसूली पैड पर माउस पर थपका एंटीबायोटिक मलहम.
- पंप बदलने के लिए, हौसले से 95% इथेनॉल के साथ भरा एक 10 सेमी पकवान के साथ पंप के लिए तैयार किया है. कैथेटर्स नए पंपों के साथ की जरूरत नहीं हैं.
- संदंश के साथ एक नया पंप पकड़ो. इथेनॉल में अपनी उंगलियों डुबकी, पंप को पकड़ लेते हैं, और प्रवाह न्यूनाधिक त्यागें. फिर, ध्यान से और धीरे धीरे टयूबिंग और प्रवेशनी से जुड़ी प्रवाह न्यूनाधिक से पुराने पंप बंद खींच. जैसे ही यह बंद है, के रूप में धीरे धीरे प्रवाह न्यूनाधिक माउस के बाहर कभी नहीं छू सुनिश्चित करना है कि, पर नए पंप स्लाइड.
- चमड़े के नीचे पैकेट और सिवनी त्वचा में वापस चीरा के माध्यम से नए पंप डालें. वसूली पैड पर घाव और जगह माउस पर थपका एंटीबायोटिक मलहम.
- बस पंप आरोपण के साथ के रूप में, पी के लिए जाँच करने के लिए सर्जरी के बाद दैनिक चूहों की निगरानीऐन / बेचैनी और संक्रमण. आवश्यक समझा रूप Carprofen और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज.
ICV सांस
6. पूर्व शल्य प्रक्रिया
- , 2) के साथ निष्फल पानी और भार के साथ एक 10 μl हैमिल्टन सिरिंज और सुई साफ 1) आप घुमावदार कैंची, घुमावदार hemostat, या चूहा हड्डी कटर की जरूरत नहीं होगी: निम्न परिवर्तन के साथ ऊपर धारा 2 के रूप में ही पूर्व सर्जरी प्रक्रिया का पालन करें आसो, और 3) प्रवेशनी चालक स्थित था जहां stereotaxic तंत्र को सिरिंज और सुई देते हैं.
7. आसो की सांस में इंजेक्शन
- संदंश और कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग, आंखों के बीच में अप करने के लिए गर्दन के आधार से एक चीरा बनाने.
- झाड़ू पर्वबिन्दु बढ़ाने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड में डूबा एक कपास द्वारा पीछा बाँझ कपास swabs, साथ स्वच्छ खोपड़ी साफ कर लें.
- जगह में सिरिंज / सुई ले जाएँ और सुरक्षित. सुई के beveled भाग पीछे का सामना कर रहा है सुनिश्चित करें. लोअरसुई पर्वबिन्दु इसे छू तक. निर्देशांक के सभी शून्य. सही 1.0 मिमी और पूर्वकाल 0.3 मिमी (चित्रा 3) के लिए पार्श्वतः सुई ले जाएँ.
- सुई के छेद खोपड़ी के ऊपर से भरा है अभी तक धीरे धीरे खोपड़ी के माध्यम से सुई ड्राइव. फिर, यह माउस खोपड़ी के पतलेपन की वजह से किया जा सकता है. Z-समन्वय शून्य और 1 मिमी / सेक (3B चित्रा) की दर से -3.0 मिमी सुई कम है. सुई के आसपास सील करने के लिए मस्तिष्क के लिए 2-3 मिनट रुको.
- प्रति सेकंड 1 μl की दर से आसो के पूरे 10 μl उद्धार. 2-3 मिनट रुको. यह दर अलग अलग दवाओं के बीच भिन्न हो सकती है, हालांकि हम वेंट्रिकल में ASOS के लिए एक 1 μl अर्क दर का उपयोग करें. जब अभ्यास, 2.5% FastGreen डाई की 10-20 μl देने से सुई के उचित स्थान के लिए जाँच करें. डाई निषेचन के बाद जल्द ही 1X पीबीएस 0.03% हेपरिन के साथ माउस छिड़कना और डाई वेंट्रिकुलर सिस्टम (चित्रा -3 सी) में है कि यह पुष्टि करने के लिए मस्तिष्क के राज्याभिषेक वर्गों बनाने. <ली> सुई के आधार पर खोपड़ी के खिलाफ एक कपास झाड़ू पकड़ो. प्रति सेकंड 1 मिमी की दर से सुई उठाएँ. जैसे ही सुई खोपड़ी से बाहर है, के रूप में सुई के छेद पर कपास झाड़ू रोल और बाहर लीक से किसी भी आसो को रोकने के लिए 1 मिनट के लिए पकड़.
- , बंद त्वचा सिवनी एंटीबायोटिक मलहम लागू होते हैं, और गर्म वसूली पैड पर जगह माउस. आसो एकाग्रता पर निर्भर करता है, यह पूरी तरह से ठीक करने के लिए एक दो घंटे के लिए 20 मिनट लग सकते हैं.
- बस पंप आरोपण के साथ के रूप में, दर्द / असुविधा और संक्रमण के लिए जाँच करने के लिए सर्जरी के बाद दैनिक चूहों की निगरानी. आवश्यक समझा रूप Carprofen और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज.
Representative Results
पंप अर्क या ICV सांस में इंजेक्शन के बाद एक निर्दिष्ट समय के बाद (हम नियमित तौर पर चार सप्ताह का उपयोग करें), यह ASOS की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम दोनों या तो वेस्टर्न ब्लाट या एलिसा का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन के स्तर के रूप में मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग mRNA के स्तर (एक प्रकाशित उदाहरण के लिए चित्रा 4 में, लक्ष्य जीन के स्तर / isoforms के उपाय करने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों और रीढ़ की हड्डी में लेने की सिफारिश ). यह अलग सीएनएस क्षेत्रों में आसो प्रभावकारिता निर्धारित करने में मदद करेगा. लक्षित प्रोटीन का आधा जीवन है, तब तक हम अधिक से अधिक प्रोटीन पछाड़ना या splicing के आकलन के क्रम में आसो निषेचन के बाद अब इंतजार की सलाह.
यह oligo वितरण का परीक्षण करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. एक उच्च आसो एकाग्रता अक्सर करीब वेंट्रिकुलर सिस्टम 16 से क्षेत्रों में देखा जाता है, हालांकि पम्प सुई लेनी, ipsilateral और contralateral दोनों गोलार्द्धों के माध्यम से वितरण में परिणाम. ICV सांस में इंजेक्शन के एक अधिक unifo उपजसीएनएस 16 के माध्यम से oligo के आरएम वितरण, प्रभाव लंबे समय के रूप में पिछले नहीं हो सकता है. हम Southwell एट अल पाठक निर्देशित. सांस oligo वितरण 16 बनाम पंप के एक प्रत्यक्ष तुलना देखने के लिए.
हम भी प्रत्येक आसो विवो में थोड़ा अलग ढंग से व्यवहार करेंगे के बाद से कई खुराक के साथ ही ASOS की कार्रवाई की अवधि का परीक्षण करने की सलाह देते हैं. ASOS आमतौर पर कई महीने बाद आसो वितरण स्थायी लक्ष्य पछाड़ना या splicing के साथ कार्रवाई की एक अपेक्षाकृत लंबी अवधि है. इसके अलावा, कुछ ASOS दूसरों की तुलना में बेहतर काम करेंगे और कुछ जीन लक्ष्य दूसरों की तुलना में पछाड़ना आसान हो जाएगा. इस वजह से, स्क्रीनिंग नेतृत्व उम्मीदवार निर्धारित करने के लिए ASOS, जब हम एक n के साथ vivo में कम से कम 3-5 ASOS परीक्षण की सिफारिश = एक पहले से गुजारें के रूप में आसो प्रति 4-6 वयस्क चूहों.
ASOS के अलावा किसी अन्य दवा का उपयोग करते हैं, यह भी पायलट के लिए महत्वपूर्ण होगा आदर्श दवा एकाग्रता, कार्रवाई की दवा अवधि, और सीएनएस दवाकि विशिष्ट परिसर के लिए वितरण.
तालिका 1. सर्जरी निर्देशांक. निर्देशांक एक intracerebroventricular (ICV) सांस में प्रदर्शन करने के साथ ही आसमाटिक पंप दाखिल जब चूहों और चूहों दोनों में सही पार्श्व वेंट्रिकल हिट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. दोनों निर्देशांक, पंप और ICV सांस के लिए, सही पार्श्व वेंट्रिकल लक्ष्य. ये हम साथ सबसे अधिक अनुभव है और आसो के उत्कृष्ट वितरण प्रदान पता है क्या कर रहे हैं क्योंकि हम दो अलग अलग सेट का उपयोग करें.
चित्रा 1. Stereotaxic सेटअप. Alzet पंप और सांस में इंजेक्शन सर्जरी के लिए (ए) आवश्यक stereotaxic उपकरण. मैं) ग्लास मनका जीवाणुरहितआर. दो) डिजिटल readout. तीन) आगे बढ़ हथियारों के साथ Stereotaxic आधार. चार) तापमान नियंत्रित हीटिंग पैड. v) के ऑक्सीजन प्रणाली / Isoflurane. छह) Isoflurane चैंबर. (बी) नाक शंकु और कान सलाखों के ऊपर बंद करें. (सी) दो संलग्नक जरूरी है. वाम: सिरिंज / ICV सांस में इंजेक्शन के लिए सुई धारक. अधिकार: आसमाटिक पंप आरोपण के लिए प्रवेशनी चालक.
चित्रा 2. आसमाटिक पम्प आरोपण Alzet. चूहों के लिए (ए) Alzet आसमाटिक पंप विकल्प. . 14 दिन पंपों (0.25 μl / घंटा), 28 दिन पंपों (0.25 μl / घंटा), दिन 42 पंप (0.15 μl / घंटा) (बी) पर्वबिन्दु से पंप आरोपण के लिए निर्देशांक: पोस्टीरियर -0.5 मिमी, पार्श्व -1.1 मिमी ( ठीक है), और वेंट्रल -2.5 मिमी (कैथेटर की लंबाई). (सी) के माध्यम से कैथेटर ड्राइविंग के बादखोपड़ी और gluing प्रवेशनी, डाई पार्श्व वेंट्रिकल में कैथेटर के उचित स्थान का आकलन करने के लिए कैथेटर के माध्यम से प्लावित है. डाई (सी) में के रूप में प्रशासित तुरंत बाद (डी) perfused मस्तिष्क. कैथेटर सफलतापूर्वक निलय में रखा गया है, डाई माउस वेंट्रिकुलर सिस्टम में वितरित किया जाएगा.
चित्रा 3. Intracerebroventricular सांस में इंजेक्शन. (ए) पर्वबिन्दु से सांस में इंजेक्शन के लिए निर्देशांक: 0.3 मिमी पूर्वकाल, पार्श्व -1.0 मिमी (सही), और वेंट्रल -3.0 मिमी (बी) उदर खोपड़ी -3.0 मिमी के माध्यम से सुई ड्राइविंग के बाद, डाई सिरिंज के माध्यम से धक्का दिया है. शीघ्र ही (बी) के रूप में प्रशासित डाई के बाद बाद में निलय. (सी) perfused मस्तिष्क में सुई के उचित स्थान का आकलन करने के लिए. सुई सफलतापूर्वक निलय, में रखा गया हैडाई माउस वेंट्रिकुलर सिस्टम में वितरित किया जाएगा.
4 चित्रा. Antisense oligonucleotides (स्मिथ एट अल. 7 से सीधे लिया आंकड़ा) vivo में चूहे SOD1 कम. (ई.) प्रतिसंवेदी SOD1 oligonucleotides के r146192 वतन या वतन 100 ग्राम / दिन में सामान्य चूहों की सही पार्श्व वेंट्रिकल में 28 दिनों के लिए संचार थे तले. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से (ए) अंतर्जात SOD1 mRNA स्तर QRT-पीसीआर द्वारा मापा के रूप में. ( बी) SOD1 और एक ट्यूबिलिन प्रोटीन का स्तर आसो निषेचन के बाद. ट्यूबिलिन और SOD1 के लिए (सी और डी) प्रोटीन का स्तर मस्तिष्क निम्नलिखित निषेचन के विभिन्न क्षेत्रों के लिए मात्रा. presenilin 1 या जीएसके -3 और बीटा के खिलाफ (ई) ASOS; सही अस्थायी / ललाट प्रांतस्था में मूल्यांकन nontransgenic चूहों और mRNA स्तर की सही पार्श्व वेंट्रिकल में 2 सप्ताह के लिए संचार कर रहे थे. चिकित्सीय जांच के लिए अमेरिकन सोसायटी से अनुमति के साथ Reproduced. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. क्षैतिज गद्दे सिवनी चल रहा है. 5-0 नायलॉन सीवन धागे त्वचा की में बुने और बाहर है, पूर्वकाल शुरू करने और पीछे काम कर रहे हैं, प्रवेशनी पर अधिक ध्यान दे. एक बार सबसे पीछे बिंदु तक पहुँच रहा है, सीवन धागे तो वापस लाया जाता है और एक बार फिर प्रवेशनी अधिक पिरोया है. यह उचित घाव बंद सुनिश्चित करता है और त्वचा के माध्यम से काम करने से प्रवेशनी / ट्यूबिंग रोकता है.
Discussion
वीडियो में दिखाया गया है सीएनएस में विश्व स्तर पर दवाएं वितरित करने की क्षमता दोनों जानने के लिए और प्रयोग करने में आसान है कि एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक है. अभ्यास के साथ, एक ही पंप आरोपण या एक ICV सांस में एक ही समय में इलाज किया जा चूहों की बड़ी साथियों के लिए अनुमति देता है, 10 मिनट में पूरा किया जा सकता है. माउस व्यवहार के लिए बड़ी संख्या में काफी अंतर देखने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि यह एक व्यवहार readout के साथ पढ़ाई के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
पंपों और सांस में इंजेक्शन के माध्यम से ASOS पहुंचाने के अपने अनुभवों के आधार पर हम हर विधि को कुछ भला और बुरा है मनाया. यह इन हमारी प्रयोगशाला में विचार कर रहे हैं और सभी माउस और चूहा मॉडल के लिए सच नहीं हो सकता है ध्यान दिया जाना चाहिए.
हम पंपों का उपयोग करने का एक फायदा आसो समय की एक बहुत लंबी अवधि में वितरित किया जाता है के बाद से आसो के एक उच्च राशि प्रदान करने की क्षमता है लगता है. यह आम तौर पर सक्रिय होने के बाद लंबे समय तक निरंतर पछाड़ना या splicing के लिए equatesआसो अर्क, हालांकि यह हमेशा मामला नहीं हो सकता. पंप भी आसो वितरण का एक सटीक समय सीमा (14 दिन, 28 दिन या 42 दिन) के लिए अनुमति देते हैं और पंप भी अब सक्रिय आसो निषेचन के लिए अनुमति देने के लिए एक बार बदला जा सकता है. हालांकि, हम एक बार से अधिक पंप बदल रहा है ठीक से तरल पदार्थ को अवशोषित से पंप को रोकने कि पंप के आसपास रेशेदार जेब के गठन के कारण परिवर्तनशीलता बढ़ जाती है देखा है. पंप का एक नुकसान यह कुछ चूहों के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के रूप में पंप बर्दाश्त नहीं है. आप के साथ काम कर रहे हैं ट्रांसजेनिक लाइन अधिक नाजुक है, एक पंप भी बोझिल हो सकता है. पंप भी एक और सर्जरी की और कहा कि संज्ञाहरण के लिए चूहों को subjecting, अंतिम निषेचन के बाद हटा दिया जाना चाहिए. व्यवहार का काम कर रही है, यह पंप को हटाने और पंप की उपस्थिति चूहों में कुछ व्यवहार को प्रभावित करेगा के बाद वसूली के कम से कम 1-2 सप्ताह के लिए अनुमति देने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
ICV सांस में इंजेक्शन के साथ, एक लाभ लागत है. एक हैअग्रिम निवेश सीरिंज और सुई खरीद करने के लिए, लेकिन खरीद करने के लिए पंप / ट्यूबिंग / कैथेटर नहीं कर रहे हैं के बाद से समय के साथ, सांस में इंजेक्शन अधिक लागत प्रभावी रहे हैं. कुल मिलाकर, cannulas और पंपों की कमी के कारण ICV सांस में इंजेक्शन के साथ ऊपर रखना भी कम नहीं है. हम भी ICV सांस में युवा और / या अधिक नाजुक चूहों को ASOS देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लगता है. ICV सांस का एक नुकसान यह है कि यह एक इंजेक्शन है. के रूप में ज्यादा समग्र आसो इस मार्ग के माध्यम से दिया जा सकता है, और प्रयोग किया जा रहा आसो की कार्रवाई की अवधि कम है, पछाड़ना / splicing के प्रभाव को भी कम रहता हो जाएगा.
आसमाटिक पंप के साथ ही ICV सांस दोनों ASOS देने की क्षमता है कि यह कर सकते हैं पछाड़ना प्रोटीन या पूरे कृंतक सीएनएस में जीन के splicing, कई तंत्रिका विज्ञान से संबंधित क्षेत्रों में व्यापक आवेदन किया है कि एक तकनीक में परिवर्तन. आप सबसे अच्छा अपनी एस के लिए अनुकूल है, प्रशासन का जो मार्ग अनिश्चित हैं अगर हम प्रसव के दोनों तरीकों विमान का संचालन का सुझावpecific अध्ययन.
Disclosures
लेखकों Isis औषधि से उनके antisense oligonucleotides प्राप्त करते हैं.
Acknowledgments
हम ASOS साथ हमारी प्रयोगशाला की आपूर्ति के लिए एक पूरे के रूप में ICV सांस में सर्जरी से संबंधित है, साथ ही आइसिस फार्मास्यूटिकल्स सलाह प्रदान करने के लिए Isis औषधि से रूखा काष्ठपात्र धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, हम इस अनुच्छेद की समीक्षा करने के लिए केरी Shaner धन्यवाद देना चाहूंगा. TMM और SLD एनआईएच अनुदान P50AG005681, K08NS074194, और R01NS078398 द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027", OD: 0.045" |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System | |||
References
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