Summary
Intracellular Ca
Abstract
Spermatozoer er mandlige kønsceller specielt designet til at nå ud til, anerkende og fusionere med ægget. For at udføre disse opgaver, skal sædceller være parat til at stå over for en konstant skiftende miljø og for at overvinde flere fysiske barrierer. At være i det væsentlige transskriptionelt og translationelt tavse, disse motile celler afhængige dybt på diverse signaleringsmekanismer at orientere sig og svømme i en rettet måde og for at kæmpe med udfordrende miljøforholdene i løbet af deres rejse for at finde ægget. Navnlig er Ca2 +-medieret signalering afgørende for flere sædceller funktioner: aktivering af motilitet, capacitation (en kompleks proces, der forbereder sæd for akrosome reaktion) og akrosome reaktion (en exocytotiske begivenhed, der giver sæd-æg fusion). Anvendelsen af fluorescerende farvestoffer til at spore intracellulære udsving i denne ion er af bemærkelsesværdig betydning på grund af deres lette anvendelse, følsomhed og alsidighed thefdeling. Ved at bruge en enkelt farvestof-loading-protokol vi udnytter fire forskellige fluorometriske teknikker til overvågning sæd Ca 2 + dynamik. Hver teknik giver forskellige oplysninger, der muliggør rumlig og / eller tidsmæssig opløsning, genererer data både på enkelt celle og celle befolkningstallet.
Introduction
Ca 2 + er et universelt anden budbringer af signaltransduktionsveje i eukaryote celler. Intracellular Ca 2 + (Ca 2 + i) deltager i reguleringen af mange fundamentale fysiologiske processer i både overgearet og ikke-overgearet celler. Betydningen og universalitet Ca 2 + som anden messenger under signaltransduktionsbegivenheder stammer fra dets spatio-temporale alsidighed i videregivelse af oplysninger i cellen. Mens Ca2 + ikke kan syntetiseres de novo eller nedbrydes inden for cellen, dets intracellulære koncentration ([Ca2 +] i) holdes inden for meget snævre grænser gennem forskellige cellulære mekanismer, der kontinuerligt puffer, udskille, inddeler og / eller akkumulere Ca2 +. Ændringer i koncentrationen af denne ion kan forekomme i stærkt lokaliserede områder i cellen 1, og tyde sådanne udsving er afgørende for at opnå en deEPER forståelse af (1) deres rolle i signalering mekanisme, (2) deres fysiologiske betydning, og (3) generelle mekanismer cellesignalering. Ca2 +-medieret signalering er af særlig betydning i sædceller fysiologi 2. Sædmotilitet er en af de vigtigste funktioner for befrugtning succes, og i virkeligheden kan flere sædens motilitet defekter forårsage sterilitet 3-5. Betydningen af Ca2 + i flagellært bevægelse har længe været erkendt 6, men er den mekanisme for, hvordan Ca 2 + styrer den specifikke form af flagellært bøjning ikke fuldt forstået.
Før fusionere med ægget, skal spermatozoer gennemgå capacitation, en kompleks proces, der afhænger sperm bopæl inde i kvindelige tarmkanalen. Under capacitation bliver sæden membranens lipid arkitektur og organisation ændres, primært som følge af kolesterol fjernelse fra plasmamembranen. Derudover adskillige proteiner er tyrosin-fosforylated 7.. Vigtigere er det, under capacitation der er en stigning i intracellulær pH (pH i) og i [Ca 2 +] i, og membranpotentialet hyperpolariserer i nogle arter 2. Capacitation kun foregår i en subpopulation af spermatozoer (20-40%), og de mekanismer, der er involveret i alle disse cellulære ændringer er langt fra klare. Det er almindeligt accepteret, at kun en subpopulation af capacitated sædceller undergår akrosome reaktion (AR), når de udsættes for fysiologiske induktionsspoler. AR er også en Ca 2 +-regulerede arrangement kræves for befrugtning i alle arter besidder en acrosome (specialiseret organel med ydre og indre membraner). Under denne proces ydre acrosomal membran sikringer med sperm plasmamembran, hvilket frigiver hydrolytiske enzymer, der tillader sædcellen at trænge ind i glyco-proteinholdig matrix, der omgiver ægget (zona pellucida, eller ZP). AR også udsætter en ny fusogent sædcelle overflade, der interagerer medægget plasmamembranen ved den endelige fusion af begge kønsceller. Der er flere cellulære ligander som inducerer AR, progesteron er et af de mest studerede blandt dem.
I dette arbejde præsenterer vi fire forskellige teknikker indebærer anvendelse af en Ca2 +-sensitive fluorescerende farvestof for at måle [Ca2 +] i ændringer i den menneskelige sædceller udløst af progesteron (undtagen flowcytometri, hvor vi målte [Ca2 + ] jeg øge induceret under in vitro capacitation proces). I dette særlige tilfælde har vi brugt Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), en membran-gennemtrængelig farvestof med en Kd = 325 nM. In vitro vi overvåges fluorescens ændringer som en funktion af tiden med tre af de metoder, og med det fjerde teknik, vi målte fluorescens værdier på et enkelt givet tidspunkt. Disse forskellige tilgange supplerer hinanden, idet de tilsammen giver rumlige og tidslige resolution på både enkelt celle og celle befolkningstallet.
Cell Befolkning eller Bulk Eksperimenter
Bulk teknikker er flittigt brugt ikke kun fordi de instrumenter kræver er let tilgængelige, men også fordi de er enkle, veletablerede, og tillader gennemsnitsberegning af oplysninger fra målinger foretaget på millioner af celler i et enkelt eksperiment.
Teknik # 1. Konventionel fluorometri
Denne teknik overvåger ændringer i fluorescens som funktion af tiden, forsøgene udføres i glaskuvetter med prøvevolumener fra 200 til 1.000 pi. Korrekt blanding af tilsatte reagenser kræver magnetisk omrøring, og derfor den tidsmæssige opnåede opløsning er i størrelsesordenen sekunder. Den typiske cellekoncentration række af de analyserede prøver er 10 5 -10 8 celler / ml.
Teknik # 2. Stoppet Flow fluorometri
Thans teknik overvåger også ændringer i fluorescens som funktion af tiden, men reagenserne blandes hurtigt sammen (ved hjælp af tryk) i en optagelse kuvette indeholdende en meget lille prøvemængde (spænder fra 25 til 100 pi). Derfor, homogenisering af reagenser er øjeblikkelig, muliggør en høj tidslig opløsning i størrelsesordenen millisekunder. Analyse af de resulterende fluorescens vs tid spor er egnet til bestemmelse af reaktionshastigheder, belyse kompleksiteten af reaktionsmekanisme, indhentning af oplysninger om kortvarige reaktion mellemprodukter mv Den fælles celle koncentrationsinterval af de analyserede prøver er 10 5 -10 7 celler / ml.
Single Cell Eksperimenter
Bulk eksperimenter rapporterer den gennemsnitlige opførsel af et stort antal celler, men kan en population ofte udviser heterogene egenskaber, der er overset i denne type målinger. Enkelt celle teknikker bruges således til at supplere the indhentet med cellepopulation eksperimenter.
Teknik # 3. Flowcytometri
Trods betydningen af de oplysninger, der fremkommer encellede målinger, er det vigtigt at analysere et stort antal celler for at undgå den fejlagtige ekstrapolation af celle-specifikke egenskaber til en hel population. Af denne grund er high-throughput teknikker begunstiges og den mest populære metode er flowcytometri, hvor 10.000 celler pr betingelse konventionelt analyseres. Denne metode giver mulighed multi-parametrisk analyse af heterogene populationer, da det kategoriserer celler efter deres størrelse (Forward Scatter (FSC)), granularitet (sidespredning (SSC)), og fluorescens-intensiteten (specifik mærkning med et antistof, levedygtighed markør etc.) , hvilket giver information om de parametre 'fordeling for en gruppe af celler. Flowcytometri giver øjeblikkelig snarere end tidsafhængig oplysninger 8.. Frem og sidespredning værdier are også anvendelige til at vælge en port, der omfatter celler, men diskriminerer celleaffald, støv osv. For fluorescensmålinger, negative og positive fluorescens kontroller skal også medtages. Hvis mere end en fluorescens kanal anvendes, skal en proces kendt som kompensation udføres (for detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Erstatning giver mulighed for spektrale overlap forskelsbehandling mellem fluoroforer. Flowcytometri tillader også diskrimination af døde celler, generelt ved hjælp af propidiumiodid-farvning.
Teknik # 4.. Single Cell Imaging
Mikroskopi er en anden almindelig metode til at studere enkelt celle adfærd og er velegnet til tidsafhængige undersøgelser og det giver også rumlig opløsning. En væsentlig ulempe er, at high-throughput analyse er kun i sin spæde begyndelse på nuværende tidspunkt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne artikel rapporterer vi brug af de fire ovennævnte teknikker til at måle [Ca2 +] i ændringer i humane sædceller. Vi brugte progesteron til at udløse en Ca 2 + svar, da det er veldokumenteret, at denne steroid producerer en transient [Ca 2 +] Jeg stige i spermatozoer. Især i human sæd, progesteron direkte aktiverer en Ca2 +-kanal (nemlig CatSper) udelukkende udtrykkes i plasmamembranen af sædceller 10,11. Vi har også målt hvile [Ca 2 +] Jeg før og efter capacitation givet, at det også er almindeligt accepteret, at en stigning i [Ca 2 +] Jeg opstår under capacitation. Efter teknikker kræver en positiv kontrol brugte vi en Ca 2 + ionophor-ionomycin-at inducere maksimal Ca2 + optagelse i cellen, og dermed maksimal fluorescens reaktion, for minimal fluorescens værdi, brugte vi Mn2 + at slukke fluorescens.
1.. Sperm Prøveforberedelse ved Swim-up metode (se figur 1)
Brug kun udbrød prøver (fremstillet ved onani), hvis egenskaber opfylder de parametre fastlagt af seneste udgave af World Health Organization laboratorium manual (findes på http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) til eksamen og forarbejdning af human sæd.
- Anskaf sædprøven inde i en steril beholder og placere det (med løsnet hætte) inde i en inkubator ved 37 ° C og CO 2 5% / luft 95% i løbet af 30 min. Dette trin er for prøve fortætning.
- Place 500 pi alikvoter af flydende sædprøve på bunden af rene reagensglas (1,0 x 7,5 cm). Cirka otte reagensglas er behov for en gennemsnitlig størrelse prøve (4 ml).
- Forsigtigt lag 1 ml Hams F-10 medium (su. pplemented med 2 mM CaCl 2 og 5 mg / ml bovint serumalbumin at fremme capacitation in vitro) på toppen af hver sæd portion (Se figur 1) TIP: Tryk på væggen af røret med spidsen af mikropipetten og forsigtigt dispensere mediet over prøven. Det er afgørende at gøre det langsomt som en blanding af begge lag (prøve og medium) skal undgås.
- Omhyggeligt læne rørene til en 30 ° vinkel ca. Dette vil øge overfladearealet mellem de to væsker, hvilket vil øge fortrængning (swim-up) af humane celler fra prøven til mediet under inkubation.
- Placer gruppen af lænede reagensglas inde i en inkubator ved 37 ° C og CO 2 5% / luft 95% i 1 time.
- Med en mikropipette forsigtigt fjerne den øverste 700 ul HAM F-10 medium (der nu indeholder motile sædceller) fra hvert rør og pool alle de indsamlede prøver i en enkelt rent glasrør (1,0 x 7,5 cm, for større mængder bruger en 15 mlFalcon-rør), undgå bobledannelse. Place 10 ul af samleprøve på den optiske planglas en Makler Optælling Chamber base, og derefter placere dækglasset (når låget er på plads, undgå at løfte eller dækning igen for at opretholde en ensartet spredning af sædprøve). Sørg for at undgå dannelse af bobler inde i kammeret, da dette ville resultere i en unøjagtig celletal.
- Overhold under et sammensat mikroskop (brug af en 20X målsætning anbefales). Dækslet glas af den Makler Counting Chamber har en stor firkant bestående af 100 mindre kvadrater (dvs. en 10 med 10 grid). Tæl cellerne i enhver strimmel af 10 felter. Dette antal repræsenterer deres koncentration i millioner celler / ml. Gentag tæller i yderligere to 10-firkantede strimler, og beregne gennemsnittet af de tre tæller BEMÆRK:. Hvis Makler Counting kammer (som er specielt designet til at tælle sædceller) ikke er tilgængelig, kan enhver hemocytometer kammer anvendes.
- Juster prøvens final koncentration til 1x10 7 celler / ml i suppleret Hams F-10 medium. Når det kræves, inkuberes prøven ved 37 ° C og CO 2 5% / luft 95% for 5 timer for at fremme capacitation.
2.. Fluorescensfarvestof Loading for Ca 2 + Målinger
Der er flere fluorescerende farvestoffer rådighed til at måle intracellulær Ca2 +, er hensigtsmæssige skal vælges i henhold til dens Kd, og dets emissions-og excitation bølgelængder (til kvalitative og kvantitative målinger, enkelt og dobbelt emissions-og excitationsbølgelængder, henholdsvis skal være anvendes) mere information). For den nuværende kvalitative applikation vi brugte Fluo-3 AM, en celle-gennemtrængende farvestof med en Kd = 325 nM, og en enkelt emission og excitation bølgelængder 506/526 nm, henholdsvis 12.
- Forbered 50 pi af en 1 mM Fluo-3:00 stamopløsning ved at opløse indholdet af en 50 ug farvestof hætteglas (MW = 1130 g / mol) i 44 pi af vandfrit DMSO.
- Ved hjælp af en 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes den nødvendige mængde spermsuspension (se krævede beløb for hver specifik teknik nedenfor) med nok 1 mM Fluo-3:00 stamopløsning til opnåelse af en slutkoncentration på 2 uM Fluo-3 AM (dvs. 1 ml af lager Fluo-3:00 tilsættes til hver 500 pi spermiesuspension).
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og beskyttet mod lys.
- Centrifugér glasset ved 750 xg i 5 min ved hjælp af en mikrocentrifuge, aspireres og supernatanten, og pellet resuspenderes i passende volumen (se krævede koncentration for hver enkelt teknik nedenfor) for Human Sperm Medium (HSM, mM: 120 NaCl, 15 NaHCO3 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 Na laktat, 5 D-glucose, 1 Na pyruvat, pH = 7,4) NB: Dannelsen af en sky snarere end en pille indikerer, at cellerne er i god stand.
- Cellerne er nu fyldt med farvestoffet, de forbliver levedygtige (holdt ved 37 ° C og beskyttet mod lys) i cirka to timer, og kan anvendes i enhver af de følgende teknikker.
3.. Teknik # 1. Konventionel fluorometri (Gennemsnitlig Oplysninger fra en stor celle population)
Udstyr: For vores sperm befolkningen [Ca 2 +] i målinger, vi bruger en SLM Aminco spektrofluorometer drives af Olis software (Bogart, GA, USA) med magnetomrører kontrol (SIM Aminco) og koblet til en blå LED (Luxeon stjerne LXHL- LB3C fra LUMILEDS) og en 465-505 nm band-pass filter (Chroma Technology Corp) for Fluo-03:00 excitation. LED styres af en specialbygget strømforsyning (700 mA). Emission lys måles ved at indstille emissionsbølgelængden (λ Em) til 525 nm på spektrofluorometer s monochromator.
- Sted 570 pi af HSM og 30 pi af sædcelle suspension (tidligere er indlæst med Fluo-3 AM og resuspenderet i HSM at opnå 1x10 8 celler / ml) i en fladbundet glasrør (ID 8 x 50 mm). Placer en magnetisk opsigt bar inde i røret, og læg slangen ind i læsning kammer spektrofluorometer (forvarmet til 37 ° C), omrøres prøven under hele købet tiden.
- Start eksperiment ved hjælp af udstyrets software (Olis software i dette tilfælde) og fortsæt til at erhverve fluorescens værdier ved en frekvens på 0,5 Hz løbet 300 sek. Anvende de ønskede testforbindelser ved injektion af det passende volumen fra en stamopløsning (generelt 100X mere koncentreret end den ønskede slutkoncentration) under anvendelse af en Hamilton mikro-sprøjte som følger:
- Anskaf basal fluorescens til 30 sek.
- Ved 100 sek tilsættes 20 uM ionomycin (som en positiv kontrol, for at opnå den maksimale fluorescens værdi).
- Kør en negativ kontrol ved at gentage trin 3.1 til 3.2.3 ovenfor, men tilføjer i stedet for Pg kun opløsningsmidlet anvendes til at opløse den (HSM med 0,01% vandfrit DMSO).
- Eksport rå fluorescensintensitets værdier til Microsoft Excel og normalisere dem ved hjælp af følgende ligning: (F/F0) - 1. Hvor F er fluorescensintensiteten målt på et givent tidspunkt (t), og F0 er den gennemsnitlige basal fluorescens taget under de indledende 30 sek. Plot den samlede serie af (F/F0) - 1-værdier vs tid (figur 2A). Måle forskellen mellem fluorescensintensiteten værdier før og efter tilsætningen af testforbindelserne (bf), plotte dem på et søjlediagram og behandle data anvender de statistiske analysemetoder (figur 2B).
4.. Teknik # 2. Stoppet Flow fluorometri (Information med High Temporal Resolution fra en stor celle population)
Udstyr: Intracellulær [Ca2 +] ændrer måles med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af en SFM-20 stopped-flow mixer koblet til en MOS-200 hurtige kinetik optisk system, både fra biologisk videnskab instrumenter (Grenoble, Frankrig). Alle data analyseres med Bio-Kine32 software fra samme selskab.
- Indstil de relevante forhold i udstyr, belysning kilde skal være tændt i mindst 15 min, før du starter eksperimentet, justere excitation og emission filtre, juster fotoforstærker til en spænding værdi inden for området fastlagt af stopped-flow producent, og indstil badet temperaturen ved 37 ° C.
- Fyld en af instrumentets sprøjter med 1 ml Fluo-3-AM loaded sædceller (1x10 7 celler / ml) og den anden sprøjte med 1 ml af forbindelsen, der skal testes, enten HSM (negativ kontrol),10 uM ionomycin (positiv kontrol) eller 10 uM Pg opløst i HSM Note:. I dette trin er det afgørende at undgå bobledannelse samtidig trække væske ind i sprøjter.
- Løft begge instrument stempler indtil de rører spidsen af sprøjten stemplerne.
- Indstille strømningshastigheden til den mindste værdi, der vil give en målelig reaktion for at minimere celleskader. Flowet vi bruger i SFM-20-systemet er 1 ml / sek 13.
- Indstil frekvensen (i dette tilfælde 10 msek) og total prøveudtagning tid (i dette tilfælde 50 sek).
- Trigger blanding af reagenser BEMÆRK:. Mens en enkelt udløser på et tidspunkt kan foretages manuelt, kan et sæt af automatiske træk udløser være forprogrammeret samt.
- Sporet af rå fluorescens (arbitrære enheder) vs tid vises på computerskærmen.
- Den blanding af reagenser i sig selv vil generere et spor, der ikke er en lige linje. Således, for at opnå den faktiske [Ca2 +] ændring afledt fra en stimulus, skal styringen spor opnået fra blande celler med medium (negativ kontrol) trækkes fra hver af de eksperimentelle spor. Analysere data efter behov; nogle kinetiske parametre kan også opnås med Bio-Kine32 erhvervelse software. Rå spor uden subtraktion er vist i supplerende Figur 1 til sammenligning.
- For at ændre reagensen i teststoffet sprøjte, rense det ud grundigt med destilleret vand. Så fyld sprøjten til sin maksimale volumen med destilleret vand, skal det placeres i den tilsvarende stemplet i stopped-flow fluorometer og skub vandet gennem den interne mekanisme (skyllevandet skal rettes til affaldsbeholderen). Gentag dette trin to gange mere.
- Gentag trin 4,2-4,9, fylde den anden sprøjte med den næste ønskede testforbindelse.
- Ved afslutningen af forsøget, skylles hele udstyret med destilleret vand, fuldstændigt dræne vand frainterne slanger.
5.. Teknik # 3. Flowcytometri (Single Cell oplysninger indhentet fra et stort antal af celler)
Udstyr: Denne teknik muliggør samtidig måling af flere parametre i en enkelt øjeblik i tid, men i modsætning til de tidligere teknikker, betyder det ikke måle ændringer over tid, men snarere giver parameterværdierne på måletidspunktet. Derfor, i stedet for at tilføje Pg at udløse reaktion, i dette tilfælde målte vi intracellulær Ca2 + niveauer i sædceller før og efter induktion capacitation. Vi brugte en FACSCanto Cytometer (Becton Dickinson) og data blev analyseret med FlowJo software (Tree stjerne 9.3.3).
- Forbered de eksperimentelle prøver i cytometer rør ved at placere 500 pi cellesuspension (4x10 6 celler / ml) pr rør under hver betingelse, der skal testes (i dette tilfælde, ti betingelser, se tabel 1). Indsamle fluorescens data tilbagem 10.000 begivenheder pr prøve.
- At opstille et eksperiment bruge udstyret software til:
- Opret en ny: folder, eksperimentere, prøve og antal rør.
- Vælg passende cytometer indstillingerne for Fluo-3 AM (brug FITC-fluoresceinisothiocyanat-filter) og PI (brug PI-Propidiumiodid-filter).
- Kør ufarvede kontrol rørene 1 og 2 i cytometret. Saml FSC og SSC data for at kontrollere, at tærskel indstillinger er passende og at skabe den tilsvarende port for at diskriminere snavs fra cellerne.
- Hvis du vil oprette kompensation kontroller, skal du køre følgende kontrolprøver, indsamling auto og maksimal fluorescens data (PI og FITC kanaler) (BEMÆRK: denne opgave er normalt udføres af udstyrets tekniker):
- Ufarvede celler (rør 1 og 2).
- Celler fyldt med Fluo-3 AM (2 uM) (rør 3 og 4).
- Døde celler (spermatozoer suspenderet i 0,1% Triton X-100 i HSM i 10 minutter ved stuetemperatur)farvet med PI (1,2 uM PI, dvs 0,25 pi 2,4 mM PI sættes til 500 pi spermiesuspension) i løbet af 30 minutter ved 37 ° C, beskyttet mod lys (rørene 5 og 6).- Se optagede data, og vælg porten til de ønskede befolkninger.
- Juster porten og vælge "Anvend" til Alle Erstatning Controls.
- Vælg eksperiment> kompensation setup> beregne kompensation.
- Omdøb kompensation opsætning og link & spar.
- Kør alle eksperimentelle rør (i dette tilfælde rørene 7-10). I slutningen, eksportere alle data til software til rådighed til analyse (se trin 5.6).
- Analysere resultaterne af hver enkelt eksperiment ved hjælp af udstyrets software, den kommercielt tilgængelige FlowJo software eller Cytobank gratis software ( http://www.cytobank.org/ ).
6.. Teknik # 4.. Single Cell Imaging (Single Cell Information med høj rumlig opløsning) Udstyr:. Kundetilpassede Imaging set-up Vores imaging set-up består af et omvendt Nikon Diaphot 300 mikroskop udstyret med en temperaturregulator (Medical System Corp Greenvale, NY), et Nikon PlanApo 60X (1,4 NA olieimmersion) målsætning. Fluorescensbelysning leveres af en Luxeon V stjerne Lambertian Cyan LED del # LXHL-LE5C (Lumileds Lighting LLC, San Jose, CA) er knyttet til en specialbygget stroboskopisk kontrolboks. LED var monteret i en FlashCube40 forsamling med dichroic spejl M40-DC400 (Rapp Opto Electronic, Hamburg, Tyskland) (båndbredder: excitation 450-490 nm, dichroic spejl 505 nm og emission 520-560 nm). LED produktionen var synkroniseret til eksponering Out signal om Cool Snap CCD-kamera via styreboksen til at producere en enkelt flash på 2 msek varighed per individuel eksponering. Kameraet eksponeringstid blev sat svarende til flash varighed (2 ms). Billeder indsamles hver 250 msek (eller kan tilpasses efterden ønskede tidsmæssige opløsning) ved hjælp af IQ software (Andor Bioimaging, Wilmington, NC).
- Forbered runde dækglas (diameter = 25 mm) ved at anvende en 5-ul dråbe poly-L-lysin-opløsning (0,01% w / v) på midten. Lad det stå i mindst 1 time (det kan tørre). Ved hjælp af en sprøjteflaske skylles behandlede område med vand før brug. Denne procedure vil give sædceller til at klæbe til dækglasset fra deres hoved, mens deres flagellum stadig kan bevæge sig.
- Forbered forbindelserne, der skal testes ved at opløse dem i HSM henhold til tabel 2.. Forbindelser tilsættes sekventielt i den samme optagelse kammeret, hvilket gør sikker på altid at tilføje det samme volumen, og at koncentrationen af stamopløsningen under hensyntagen fortyndingen det vil have, når blandet med volumen allerede er til stede i kammeret (som anført i Tabel 2). Hold alle testopløsninger i et bad ved 37 ° C, indtil de skal anvendes.
- Saml dækglasset inde i recording kammer og sted 10 pi Fluo-03:00-loadede celler (1 x10 7 celler / ml) i midten. Dække cellerne med 200 pi forvarmet HSM.
- Placer kammeret på scenen af mikroskopet forvarmet til 37 ° C, vist cellerne (ved hjælp af fase kontrast) og vælge et område til billeddannelse. Det er vigtigt at vælge et område, hvor celledensitet er hensigtsmæssig (se figur 5A), for mange celler gør analyse vanskelig på grund af overlappende signaler BEMÆRK: Cellerne skal være solidt fastgjort til låget glide ved deres hoved, men udviser flagellar bevægelse, som bekræfter. levedygtighed.
- Anskaf fluorescens billeder i levende tilstand for at justere fokus og lysstyrke.
- Start eksperimentet ved at aktivere tidsserier billede erhvervelse software (IQ i dette tilfælde). Typisk fire billeder er erhvervet pr sekund med belysning på 2 msek per billede.
- Brug en mikropipette til forsigtigt tilføje (drop-wise) testforbindelsen (Pg i dette tilfælde), fortsat image erhvervelse som krævet og udføre to sekventielle kontrol tilføjelser i det samme kammer: (1) 20 uM ionomycin for at opnå maksimal fluorescens og (2) 5 mM MnCl2 at opnå minimal fluorescens. Alternativt kan forbindelser tilsættes med et perfusionskammer, der giver fordelene ved give stimulus fjernet, og evnen til ensartet bade cellerne med forbindelsen. På samme tid, har det ulemperne ved at kræve større mængder af opløsning, og gøre temperaturkontrol mere problematisk.
- Gentag opkøb i et nyt kammer med hver ønskede teststoffet.
- Udføre billedanalyse online ved hjælp af udstyret software, eller offline ved hjælp af enten IQ Software eller Image J freeware. Tegn områder af interesse (ROI'er) omkring hver celle (eller en del af celle) og også vælge en celle-fri område (automatisk baggrund subtraktion af softwaren). En tid-fluorescensintensitet serien er derefter opnået for hver ROI og disse data may blive eksporteret til Microsoft Excel til yderligere analyse. Vi normalisere fluorescensintensitets værdier ved hjælp af følgende ligning: (F/F0) - 1. Hvor F er fluorescensintensiteten målt på et givent tidspunkt (t) og F0 er den gennemsnitlige fluorescens taget under de indledende 30 sek. Plotte samlede serie (F/F0) - 1 vs tid (figur 5B). Værdier kan også normaliseret med fluorescens værdien opnået efter ionomycin tilsætning som 100%.
- Image Analysis kan alternativt udføres ved hjælp af billedet J gratis software.
Teknik # 1. Konventionel fluorometri
Progesteron er et af de kendte AR inducere og som forventet, det gør fremprovokere en forbigående [Ca2 +] i-stigning i human sæd (vist i figur 2). Tilsætning af en calciumionophor (ionomycin) får maksimalt [Ca 2 +] i stigning, hvilket ikke vender tilbage til basale niveauer.
Teknik # 2. Stopped Flow fluorometri
Progesteron-induceret [Ca 2 +] i stigning blev målt som før (konventionel fluorometri), men denne gang med en større tidsmæssig opløsning, i dette tilfælde hyppigheden af overtagelsen var 0,1 Hz. Som vist i figur 3, både progesteron (forbigående, rød linje) og ionomycin (vedvarende, blå linie) forårsagede en meget hurtig [Ca2 +] i-stigning. Fraværet af en forsinkelse i progesteron-induceret [Ca 2 +] i stigning er i overensstemmelse med tidligere rapporter tyder på, at progesteron direkte aktiverer Ca2 +-kanal CatSper, uden mellemliggende signalering 10,14.
Teknik # 3. Flowcytometri
[Ca 2 +] Jeg blev målt i capacitated og ikke-capacitated menneskelige sædceller. Som tidligere rapporteret i mus 15, kvæg sperm 16 og menneskelig sæd 17, vi også observeret forøget [Cen 2 +] i i capacitated sammenlignet med ikke-capacitated humane sædceller. Baldi, et al. (1991) 17 rapporterede højere basal [Ca 2 +] i i capacitated end i ikke-capacitated menneskelige sædceller ved hjælp af konventionelle fluorometri. I dette arbejde har vi brugt flowcytometri at måle [Ca2 +] i før og efter in vitro capacitation. Flowcytometri giver os mulighed for at se, at fordelingen af fluorescens værdier for capacitated sæd (figur 4D, blå trace) er flyttet til højere værdier i forhold til ikke-capacitated sædceller (figur 4D, rød trace). De fluorescens værdier for den enkelte celle kan observeres i de to-dimensionelle dot plots vist i figur 4G, vigtigere, kan signalet opstår fra døde celler (15% ca) skal afskaffes (fig. 4G, øvre kvadranter).
Teknik # 4.. Single Cell Imaging
Progesteron-inducered [Ca 2 +] i ændring blev målt i enkelte sædceller. Progesteron Derudover forårsager en stigning i [Ca 2 +] Jeg både i sperm hovedet og i flagellum. Som observeret i befolkningen eksperimenter enkelt celle analyse viste en forbigående og en vedvarende stigning for progesteron og ionomycin, hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Skematisk diagram af forsøgsprotokollen for sæd prøveforberedelse ved swim-up-metoden. De vigtige skridt for adskillelse af bevægelige sædceller og justering af deres koncentration er illustreret. Det sidste inkuberingstrin kun udføres, når capacitation er påkrævet.
Figur 2. Progesteron forårsager en stigning i [Ca 2 +] i i humane sædceller populationer. (A) Repræsentative fluorescens spor vs tid viser [Ca 2 +] i ændringer som følge af tilsætning af 4 uMprogesteron (Pg, rød trace) eller HSM med 0,01% dSmo (Pg køretøj) som negativ kontrol (CTL, blå trace). Som en positiv kontrol er ændringen induceret af 10 uM ionomycin (Iono) vist for hvert spor. Fluorescensværdierne blev erhvervet ved en frekvens på 0,5 Hz løbet 120 sek. (B) Søjler repræsenterer den gennemsnitlige bf fra hver tilstand ± SE, n = 3 (* p <0,001 sammenlignet med kontrol).
Figur 3. Progesteron og ionomycin fremkalde en hurtig [Ca 2 +] Jeg stige i humane sædceller befolkninger. [Ca 2 +] Jeg reaktioner blev registreret ved stikprøvekontrol hver 10 msek (AFU = arbitrære fluorescensenheder). (A) rå spor for kontrol (blande celler med HSM, grøn trace) og for signaler induceret med 10 pM p rogesterone (rød trace) eller med 10 pM ionomycin (blå spor). (B) berigtiget spor af signaler induceret med 10 pM progesteron (rød trace) eller med 10 pM ionomycin (blå spor), fremkommer ved at trække styresignal (grøn spore i panel A) fra deres tilsvarende rå signaler (røde og blå spor i panel A, henholdsvis). Progesteron inducerer en forbigående reaktion, med en maksimal fluorescens værdi forekommer 2,7 sek efter tilsætning af spole. På den anden side skaber ionomycin en hurtig og vedvarende respons gennem tiden (50 sek). Den indsatte i panel B viser en udvidet visning af den første 500 msek for hvert svar. Bemærk, at både ionomycin-og progesteron-induceret [Ca 2 +] Jeg stigninger starte umiddelbart efter blanding af cellerne med spole. Hvert spor repræsenterer gennemsnittet af tre optagelser. Alle spor blev normaliseret mod deres mindstekrav fluorescens værdier, og oven på hinanden.com/files/ftp_upload/50344/50344fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 4.. .. [Ca2 +] i stiger under human sperm capacitation capacitated (blå områder) og ikke-capacitated (røde områder) sædceller blev underkastet flowcytometrianalyse (A) fremad (FSC) og side scatter (SSC) plotter; de valgte gate indikeret med blå linie og kun de celler inden for dette område blev anvendt til yderligere analyse. Fluorescens histogrammer i FITC kanal fra ufarvede (autofluorescens) (B) og Fluo-3:00 farvede (positiv for FITC) (D) spermatozoer. Fluorescens histogrammer i PI kanal fra ufarvet (autofluorescens) (C) og døde (positiv for PI) (E) celler. To-dimensionelle fluorescens (Fluo-3 er ennd PI) dot plot for ufarvet (F), og dobbeltklik farves (Fluo-3 AM og PI) spermatozoer (G), er den procentdel af cellerne er optaget i hver kvadrant angivet med røde tal. Disse resultater er repræsentative for et eksperiment (n = 5).
Figur 5. Progesteron forårsager en stigning i [Ca 2 +] i i humane sædceller. (A) Repræsentative pseudo billeder af humane sædceller visualiseret ved begyndelsen (kontrol), og efter progesteron (Pg, 45 sek), ionomycin (Iono, 300 sek ) og MnCl2 (380 sek) tilføjelser. (B) Repræsentative normaliserede fluorescens spor af ni individuelle celler fra (A).
| Tube | Betingelse | Behandling | Værdier, der skal måles | Kommentarer | Graph |
| 1 | Kontrol (Non-kapacitetsbegrænsninger celler) | Uplettet | a) FSC 1 og SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PI 4 fluorescens | a) at bestemme cellens størrelse og granularitet og skabe gate b) FITC 3 autofluorescens c) PE4 autofluorescens | a) Dot plot A, Red b) Histogram B, Rød c) Histogram, Rød |
| 2 | Kontrol (capacitated celler) | Uplettet | a) FSC 1 og SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PE4 fluorescens | a) at bestemme celler størrelse end granularitet og skabe gate b) FITC 3 autofluorescens c) PI 4 autofluorescens | a) Dot plot A, Blå b) Histogram B, blå c) Histogram C, blå |
| 3 | Positiv for FITC 3 (Non-kapacitetsbegrænsninger celler) | Label med FITC | FITC 3 fluorescens | At bestemme fluorescensen i prøven | Histogram D, Red |
| 4 | Positiv for FITC 3 (capacitated celler) | Label med FITC | FITC 3 fluorescens | At bestemme fluorescensen i prøven | Histogram D, Blå |
| 5 | Døde celler, positive for PI 4 (Non-kapacitetsbegrænsninger celler) | Label med PI | PI 4 fluorescens | At bestemme fluorescens af døde celler | Histogram E, Rød |
| 6 | Døde celler, positive for PI 4 (capacitated celler) | Label med PI | PI 4 fluorescens | At bestemme fluorescens af døde celler | Histogram E, Blå |
| 7 | Kontrol (Non-kapacitetsbegrænsninger celler) | Uplettet | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For at bestemme autofluorescens i FITC 3 og PI 4 kanaler | Dotplot F, Rød |
| 8 | Kontrol (capacitated celler) | Uplettet | FITC 3 og PI 4 fluorescens | For at bestemme autofluorescens i FITC 3 og PI 4 kanaler | Dotplot F, blå |
| 9 | Positiv for FITC 3 og PI 4 (Non-kapacitetsbegrænsninger celler) | Label med FITC 3 og PI 4 | FITC 3 og PI 4 fluorescens | At bestemme fluorescens værdier i begge kanaler i den eksperimentelle betingelse | Dotplot G, Rød |
| 10 | Positiv for FITC 3 og PI 4 (capacitated celler) | Label med FITC 3 og PI 4 | FITC 3 og PI 4 fluorescens | At bestemme fluorescens værdier i begge kanaler i den eksperimentelle betingelse | Dotplot G, Blå |
Tabel 1. Beskrivelse af prøver til et flowcytometer eksperiment 1 FSC: fremadspredning, 2 SSC:. Sidespredning, 3 FITC: fluoresceinisothiocyanat; 4 PI: Propidiumiodid.
| Compound | Volumen stamopløsning skal tilføjes | Stamopløsningskoncentration | Volumen til stede i kammeret på tidspunktet for tilsætning | Final koncentration i kammeret |
| Progesteron | 100 pi | 9 uM | 200 pi | 3 uM |
| Ionomycin | 100 pi | 80 uM | 300 gl | 20 uM |
| MnCl2 | 100 pi | 25 mM | 400 pi | 5 mM |
Tabel 2. Fremstilling af opløsninger til et billeddannende eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulær signalering er afgørende for de fleste cellulære aktiviteter Ca 2 + er en allestedsnærværende budbringer, der ledsager pattedyrceller i hele deres levetid, fra deres oprindelse ved befrugtningen, til slutningen af deres livscyklus. Som reaktion på forskellige stimuli, [Ca 2 +] Jeg stiger, svinger og afdrag med spatio-temporale kodificering, derfor er forskellige processer aktiveres, modulerede eller opsiges ved Ca 2 +-kodede meddelelser. Intracellulær Ca2 + dynamik er meget vigtige i sædceller fysiologi, da denne ion er involveret i en kompleks orkestrering af signaltransduktionsprocesser. Kendskab til sådanne Ca 2 + udsving kan hjælpe dechifrere den molekylære identitet af Ca 2 + involverede kanaler, og deres særlige roller i forskellige signalleringskaskader. Ca 2 +-følsomme fluorescerende farvestoffer udgør et kraftfuldt værktøj til at studere dem, således yderst specifik og følsom Ca 2 + measurements der kan anvendes til at spore koncentrationen ændringer i levende celler. I dette papir, er cellepopulation eksperimenter (konventionelle og stoppede flow fluorometri) og encellede eksperimenter (flowcytometri og single cell imaging), der anvendes til enten at følge spatio-temporale [Ca 2 +] ændringer i humane sædceller upon a progesteron stimulus, eller at estimere Ca2 + hvile niveau før og efter in vitro capacitation.
Konventionel fluorometri er en udbredt teknik, fordi den nødvendige instrumentering er let tilgængelig i de fleste laboratorier, er det let at udføre, og det kan hurtigt informere om der er en [Ca 2 +] i tilvækst på en specifik stimulus. Stoppet flow fluorometri, selv kræver mere avancerede udstyr, giver høj tidsmæssig opløsning. Bestemmes for eksempel Kaupp og medarbejdere som efter progesteron stimuli, sperm [Ca 2 +] i stiger straks udenforsinkelse 10; dette faktum, sammenholdt med yderligere eksperimentelle bevismateriale 14, føre dem til at foreslå, at progesteron direkte aktiverer en Ca 2 + kanal (CatSper), udelukker medvirken af en signaleringskaskade eller en ekstra progesteron receptor, i det mindste under indledende progesteron-induceret tilvækst. Progesteron inducerer en forbigående stigning efterfulgt af en mindre og langsommere tilvækst og derfor kan mere end én Ca 2 + post mekanisme være involveret i den samlede indsats.
Flowcytometri er en meget kraftfuld teknik, men det kræver dyre instrumenter. Når tilgængelig, denne metode er af bemærkelsesværdig vigtighed, da det samtidigt måler flere parametre, på et stort antal celler, og i et relativt kort tid. Vigtigere er det, det giver forskelsbehandling mellem levende og døde celler. I dette papir viser vi for første gang ved hjælp af flowcytometri, at der er en Ca 2 + øge dnder capacitation i human sæd. Vores målinger forudsat fluorescens værdier for hver enkelt celle, således at fordelingen af disse værdier i befolkningen kan klart observeres, til gengæld muliggør eliminering af signalet fra døde celler (figur 4).
Fluorescens-baserede imaging assays på intakte levende celler supplerer de foregående tre teknikker, fordi det tilføjer rumlig opløsning på målingerne. Høj tidslig og / eller rumlig opløsning under billedbehandling kan også opnås, ifølge de foreliggende instrumentering kapaciteter (dvs. kameraets følsomhed, lyskilde, objektiv numerisk blænde, osv.). Men i betragtning af, at kun nogle få celler studeres på én gang, skal forsøgene gentages flere gange for at drage pålidelige konklusioner, hvilket gør analysen tidskrævende.
I dette papir vi brugte simple forsøgsprotokoller for at illustrere hver af de fireteknikker. Imidlertid kan disse fremgangsmåder udvides til at studere processer i langt større dybde. Der er et stort antal fluorescerende farvestoffer, som kan målrettes til specifikke rum af cellen (cytosol, mitokondrier, ER, endosomer, osv.), der er ratiometrisk farvestoffer (dobbelt emission og / eller excitation bølgelængder) som tillader kvantitativ bestemmelse af parameter, der måles (kalibrering er påkrævet), og endelig kan mere end en farve bruges på en gang til samtidig, for eksempel [Ca 2 +] i og [Ph] i-ændringer. Derudover kan disse teknikker kombineres med farmakologiske værktøjer og / eller omhyggeligt designede protokoller (varierende ekstracellulære Ca2 + koncentrationer, pH-værdier, temperaturer, eller enhver anden faktor, der kan påvirke respons) for at få oplysninger, der kan bruges til at belyse i detaljer processen under studiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Jose Luis De la Vega, Erika Melchy og Dr. Takuya Nishigaki til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexico) (99.333 og 128.566 til CT) Dirección General de Asuntos del Personal Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 til CT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5x5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
- Brokaw, C. J. Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids. J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, 1139-1150 (1995).
- Svahn, H. A., van den Berg, A. Single cells or large populations. Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).
- Strunker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P., et al. The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels. Annu. Rev. Physiol. , (2011).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).
- Kilic, F., et al. Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone. Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Xia, J., Ren, D. The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).
- Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).
- Baldi, E., et al. Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa. J. Androl. 12, 323-330 (1991).
