Summary
במאמר זה, אנו מציגים שיטה לניתוח microvessels גידול in vivo באמצעות videomicroscopy הקרינה משופרת ניגודיות דינמי. שני פרמטרים כמותיים נרכשו: צפיפות תפקודית נימים המשקפת את כלי הדם של הגידול, וזליגת מדד המשקפת את הדליפות של קיר אנדותל.
Abstract
confocal הקרינה בתחום ההדמיה vivo fibered עם צרור סיבים אופטי משתמשת באותו העיקרון כמו מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי. זה יכול לרגש את הניאון באלמנטים באתרו דרך הסיבים אופטיים, ולאחר מכן להקליט חלק מהפוטונים הנפלטים, דרך אותו הסיבים אופטיים. מקור האור הוא לייזר ששולח אור המרגש באמצעות אלמנט בתוך צרור הסיבים וכמו סריקות על המדגם, משחזר פיקסל תמונה בפיקסל. כסריקה זו מהירה מאוד, על ידי שילוב עם תוכנת עיבוד תמונה ייעודית, ניתן לקבל תמונות בזמן אמת עם תדר של 12 מסגרות / sec.
פיתחנו טכניקה לאפיון מורפולוגיה נימים ותפקוד כמותית, באמצעות מכשיר videomicroscopy הקרינה confocal. השלב הראשון בניסוי שלנו היה לרשום 5 סרטי שניות בארבעה הרביעים של הגידול כדי להמחיש את רשת הנימים. כל הסרטים עובדו באמצעות תוכנה (אניmageCell, מאונה קיאה טכנולוגיה, פריז צרפת) שמבצעת פילוח אוטומטי של כלי סביב קוטר בחר (10 מיקרומטר במקרה שלנו). לפיכך, אנו יכולים לכמת את "הצפיפות תפקודית נימים", שהוא היחס בין שטח הכלי המוחלט והשטח הכולל של התמונה. פרמטר זה היה סמן הפונדקאי לצפיפות כלי הדם, נמדד בדרך כלל תוך שימוש בכלים לפתולוגיה.
הצעד השני היה להקליט סרטים של הגידול מעל 20 דקות לכמת דליפת חומר ניגוד macromolecular של דרך קיר הנימים לתוך interstitium. על ידי מדידת היחס בין עוצמת אות בinterstitium על זה בכלי, "זליגת מדד 'הושגה, הפועלת כסמן הפונדקאי לחדירות נימים.
Introduction
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב 1 המערב את היווצרותם של כלי דם חדשים מכלי קיימים מראש. שינויים פתולוגיים בזרימת דם לרקמות, מורכבים מarterioles, נימים, וvenules, הם מעורבים במגוון רחב של מחלות כגון סרטן, דלקת, או סוכרת. לכן זה חיוני כדי לפתח שיטות להערכת מבנה דם קטן ותפקוד כמותית. הדמיה מאפשרת המחקר של microvessels באופן שאינו או מייקר פולשנית, בזמן אמת וin vivo, וצעדים חוזרים ונשנים לאורך זמן באותה החיה 2.
נכון לעכשיו, הדמיה דינמית משופר לעומת זאת, (DCE) 3 משמשת בדרך כלל כדי להעריך את זרימת דם לרקמות. הדמיה משופרת ניגודיות דינמי היא טכניקה העוקבת לאורך זמן biodistribution של נותב מוזרק לווריד. מרכישה זו, ניתן לחלץ פרמטרים כמותיים המשקפים כלי דם לרקמות. הדמיה DCEכבר משמש לרוב עם CT, MRI או אולטראסאונד. עם זאת, שיטות ההדמיה הללו אינן מאפשרות צפייה ישירה של microvessels, שכן ברזולוציה שלהם, אלא בשימוש במכשירי ניסוי ספציפיים, לרוב נשארת מקרוסקופית.
במאמר זה, אנו מציעים ללמוד את כלי הדם של גידול בקנה המידה המיקרוסקופית וin vivo באמצעות דימות אופטי משופר ניגודיות דינמי, עם videomicroscopy confocal fibered. אנו משמשים חומר ניגוד macromolecular (FITC-dextran) אשר נשאר אך ורק בתוך כלי או דליפות דרך מחסום האנדותל לתוך interstitium, על פי המשקל המולקולרי שלו ואת המאפיינים של האנדותל של הרקמה למדו 4. זו אפשרה המחקר של שני מבנה הדם הקטן, על ידי כראוי מגדיר כלי, וחדירות נימים, על ידי הדלפה והצבירה בinterstitium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומר הניגוד
- לFITC-dextran 70 kDa, חומר המוזרק הוא 500 מ"ג / קילוגרם (10 מ"ג FITC-dextran בדילול מלא ב0.1 מיליליטר של תמיסת מלח לעכבר במשקל 20 ז).
- הסוכן לא צריך להיות חשוף יותר מדי זמן לאור. כדי להימנע מהלבנה, מומלץ לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום.
2. הרדמה
- עכברים מורדמים בזריקת intraperitoneal של תערובת של 1:4 של xylazine (Rompun 2%, באייר, Puteaux, צרפת) וקטמין (קטמין 500, Virbac, Carros, צרפת), בהתאמה 66 מ"ג / קילוגרם ו264 מ"ג / קילוגרם לעכבר 20 גרם.
3. הכנת האיבר של עניין
- גלחנו את העכברים במיקום של עניין (למשל, מעל גידול תת עורי). שיער בעלי החיים הוא לעתים קרובות אוטומטי ניאון כאשר לבן. כאשר שחור, היא סופגת את אור.
- העור מול האיבר להיות צילם היה חרות. חשוב לחכות עד המחורבןגרם הפסיק לפני הזרקת חומר הניגוד, אחר זה ידלוף בדם ולזהם את התמונה.
4. רכישה
- חומר הניגוד שהוזרק או דרך וריד הצוואר או וריד הזנב. אין או אות קצת רקע יש באיבר שנצפה בהיעדר חומר ניגוד ניאון של.
- החללית הייתה להציב מול האיבר להיות צילם. במחקר שלנו, זה היה הגידול.
- הלייזר היה מופעל כדי להאיר את הגידול ולראות את הקרינה בנימי הדם.
- הגידול שנחקר באופן ידני על ידי הזזת החללית בתנועה איטית מאוד בעת ההקלטה כדי להמחיש את רשת הנימים. זה חשוב לשמור על יד יציבה, וטכניקה זו דורשת ניסיון מועט. במחקר שלנו, צעד ראשון זה אפשר כימות של צפיפות נימים פונקציונלית.
- הצעד השני היה הרכישה הדינמית לאורך זמן. במחקר זה, אנו משמשים 70 kDa FITC-dextran. אין זליגת ביניים ברוב האיברים נורמלים אבל יש בגידולים. לרכוש תמונות מאותו המיקום לאורך זמן (כמו במקרה שלנו), חשוב להגדיר את מערכת כדי לשמור את החללית על השטח של עניין. הדבר נעשה על ידי שימוש בתמיכה בעבודת יד כדי להחזיק את החללית, ועל ידי הצבת קצת ג'ל אולטרסאונד על הקצה של החללית. לפני ההקלטה, זמן הוקדש כדי לייצב את החללית הציבה במגע עם הגידול. ברגע שהמצב היה מאובטח, הייתה תנועה מינימאלית רק בשל נשימותיו של העכבר. הלייזר היה מופעל כדי להקליט 3 תמונות בכל 30 שניות ל20 דקות כדי לזהות הנוכחות של דליפת נימים. זה היה כבוי בין כל הקלטה כדי להפחית הלבנת חומר ניגוד.
- בניסוי שלנו, עכברים הוקרבו בסוף ההליך לניתוח היסטולוגית של גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בנתונים שנאספו, אנחנו יכולים לנתח כמותית פרמטרים שונים המשקפים את זרימת דם.
למדנו בvivo רשת כלי הדם ההיקפי של גידול במעי הגס שהושתל בעכברי BALB-c באמצעות מערכת fibered confocal videomicroscopy הקרינה (Cellvizio, Maunakea טכנולוגיה, פריז, צרפת 2), לאחר הזרקת חומר ניגוד ניאון macromolecular של ההעמסה isothiocyanate-dextran ( FITC-dextran) עם משקל מולקולרי של 70 kDa (סיגמא אולדריץ, סנט קוונטין Fallavier, צרפת) ועם אורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו520 ננומטר, בהתאמה (לתאימות עם מערכת ההדמיה שלנו).
השלב הראשון בניסוי שלנו היה לרשום 5 סרטי שניות בכל אחד מארבעת הרבעים של הגידול לדמיין את רשת הנימים. דגימה זו אפשרה נציג של כלי הדם של הגידול. כל הסרטים עובדו באמצעות תוכנה (ImageCell, מאונהקיאה טכנולוגיה, פריז צרפת) ביצוע פילוח אוטומטי של כלי בתמונות סביב קוטר בחר (10 מיקרומטר במקרה שלנו, שכלל כלי החל 5-20 מיקרומטר קוטר). לפיכך, אנו יכולים לכמת את "הצפיפות התפקודית הנימים '(FCD), שהוא היחס בין שטח הכלי המוחלט והשטח הכולל של התמונה. פרמטר זה היה סמן הפונדקאי של צפיפות כלי הדם, נמדד בדרך כלל תוך שימוש בכלים פתולוגיה. איור 1 מציג דוגמא לסוג של תמונות המתקבלות והתוצאה מפילוח כלי שיט. בדוגמא זו, FCD נמדד כ36%.
ואז, שלוש תמונות נרשמו כל 30 שניות ל20 דקות כדי לזהות הנוכחות של דליפת נימים. בדיקה ויזואלית של התמונות בוצעה לראשונה, כדי להעריך את העדר או נוכחות של דליפת ניגוד לסוכן interstitium כמו גם הפריסה המרחבית שלה (הומוגנית או הטרוגנית).
ציירנו שלושה אזורים של int erest (ROI) בנימים ושלוש את ההחזר על ההשקעה בinterstitium בנקודות זמן 0, 5, 10 ו20 דקות. עוצמות האות (SI) בתוך שלוש נימים שונות ואזורי ביניים רציפים היו בממוצע בכל נקודת זמן. דליפת מדד (%) חושב באופן הבא = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, שבו ה-IP הוא perivascular (או ביניים) בעוצמה והשנייה הוא עוצמת intravascular 5 -7. איור 2 מראה דוגמא של דליפת חומר ניגוד בinterstitium. בדוגמא זו, זליגת מדד נמדדה כ1.47.
טכניקת הדמיה אופטית זה דינמי משופר לעומת זאת, מאפשרת במדידות vivo של מייקרו מחזורי גידול. היא משקפת את הארכיטקטורה של כלי גידול על ידי כימותי צפיפות נימים, והפונקציונליות שלהם על ידי כימות חדירות נימים.
g "/>
איור 1. משמאל:. תמונה של microvessels בשכבה השטחית של הגידול ימני: יישום של מודול איתור הכלי באופן אוטומטי כלי קטע בקטרים הנעים 5-20 מיקרומטר (בקוטר של עניין: 10 מיקרומטר). כלי המפולחים מסומנים בסגול.
איור 2. דליפה מהנימים לinterstitium בנקודות זמן שונה, בהתאמה t 0 (א), לא 5 (ב), לא 10 (ג) ולא 20 (ד). כלי שייט (V) נראית מבנים ליניארי גבוהה כאות. לפני הזריקה (t0), אין אות ראתה בinterstitium (אני). בהדרגה, שיפור שניתן לראות בinterstitium בשל דליפת חומר ניגוד הניאון של את מחסום האנדותל גידול לא נורמלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר מייקרו מחזורי גידול הפך להיות חיוני בהבנת הפתופיזיולוגיה של צמיחת גידול, הפצה ותגובה לטיפול 1. הדמיה אופטית היא אחת הטכניקות שיכולים לשמש כדי לבחון את נימי הדם באמצעות חומר ניגוד ניאון ולכמת (צפיפות פונקציונלית נימי) מורפולוגיים ופרמטרים תפקודיים (זליגת מדד).
יש ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ששמשנו במחקר זה גם יתרונות ומגבלות. אחד יתרונות הוא יכולת לבחור את גודל חומר הניגוד בשימוש של. כאן, עם 70-kDa FITC-dextran, דליפה דרך מחסום האנדותל בתחילת הניסוי הייתה מינימאלית, אשר אפשרה לנו לבחון את המורפולוגיה הראשונית (tortuosity, רשת אנרכיה, וכו '.) של כלי עם קונטרסט טוב בין כלי שיט וinterstitium 8, ולאחר עיכוב, דליפת חומר הניגוד על 20 דקות של התבוננות ב. (X במטוסהרזולוציה Y) (3.5 מיקרומטר) הייתה גבוהה, אשר אפשרה לנו לדמיין את הכלים וinterstitium ברמה מיקרוסקופית, במקום ברמת מקרוסקופית כמו עם רוב שיטות הדמיה אחרות (MRI, CT, אולטרסאונד, PET ...). לבסוף, זו היא הדמיה בזמן אמת, מה שאומר שיכולים להיות שנצפו שינויים כפי שהם מתרחשים.
עם זאת, ישנם חסרונות לשיטה זו. המנגנון הוא עדין לתפעול. ואכן, הבדיקה היא קטנה מאוד (1.8 מ"מ) וחלקלקה וקשה כדי להישאר באותו המקום בגידול על פני תקופות זמן ארוכות. תנועות הנשימה של בעל החיים גם להתפשר יציבות. כדי לשפר את זה, השתמשנו ג'ל אולטרסאונד כדי לשתק את הבדיקה ותמיכה בעבודת יד על מנת לשמור על החללית בעמדה. יתר על כן, אנו יכולים לחקור את האזור השטחי בלבד של הגידול (מ100 מיקרומטר 170 מיקרומטר), מה שאומר שהתוצאות שהתקבלו דאגה השכבות השטחיות ביותר רק של הגידול.
המגבלה העיקרית, however, הוא הקושי להגיע כימות מוחלטת באמצעות הדמיה אופטית. דליפת מדד היא יחס, ולכן רק פרמטר חצי כמותית. ראשית, יש חפצים בשל voluming החלקי בהחזר על ההשקעה. ואכן, אם כי הרזולוציה במטוס היא גבוהה, ברזולוציה Z-המטוס היא נמוכה (עובי פרוסת 70 מיקרומטר), מה שאומר שזה כולל גם כלים וinterstitium. לכן, בעת מדידת עוצמת אות בכלי עם קוטר 10-מיקרומטר, הוא ממוצע עם interstitium מסביב נכלל בפרוסה. כמו כן, בהדמיה אופטית, קיים קשר מורכב בין עוצמת אות וריכוז חומר ניגוד. כאשר רקמה היא מוארת על ידי פוטונים, אירועים רבים עלולים להתרחש בו זמנית ולהשפיע על האות שנאסף. ישנן chromophores הטבעי ברקמות שיכולים לספוג עירור או פליטת פוטונים כגון המוגלובין או קולגן. יש גם כמה דיפוזיה אשר מפזרת פוטונים בכמה כיוונים. לבסוף, הלבנת היא כנראה אחדהנושאים החשובים ביותר בעת שימוש FITC, משום שהיא גורמת לאובדן בלתי תלוי אות של ריכוז. מספר קבוצות מחקר עובדות על כימות האותות אופטיים, אבל זה מרמז 9,10 modelization מורכב.
לבסוף, מחקרים ארוכי טווח לא מבוצעים בקלות. היינו צריך לחתוך את העור כדי לחשוף את הגידול על מנת לרכוש את התמונות, וזה עלול להיות קשה כדי לסגור את החתך, במיוחד כאשר באיבר שנצפה הוא עמוק בחלל הגוף (למשל בכבד או בכליות).
בסך הכל, שפיתחנו טכניקת הדמיה אופטית דינמית הקרינה משופרת לעומת זאת, כדי לאפיין האנטומיה נימים ותפקוד כמותית, באמצעות מכשיר videomicroscopy הקרינה confocal. טכניקה זו דורשת אימות נוספת, אך הוא עשוי להיות שימושי להשוואת כלי דם גידול לפני ואחרי הטיפול, או בין דגמי גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
