In vivo avbildning av blodkärl i tumören med hjälp av fluorescens Confocal videomikroskopi

Summary

I detta papper presenterar vi en metod för att analysera tumörmikrokärl in vivo med hjälp av dynamisk kontrastförstärkt fluorescens videomikroskopi. Två kvantitativa parametrar förvärvats: funktionell kapillär densitet återspeglar kärl av tumören, och index läckage återspeglar leakiness av endothelial väggen.

Abstract

Fibered konfokal fluorescens bildåtergivning in vivo med ett fiberoptiskt knippe använder samma princip som fluorescerande konfokalmikroskopi. Den kan excitera fluorescerande in situ-element genom de optiska fibrerna, och sedan spela in några av de emitterade fotonerna, via samma optiska fiber. Ljuskällan är en laser som sänder det exciterande ljuset genom ett element i fiberknippet och när den skannar över provet, återskapar en bild pixel för pixel. Eftersom den här analysen är mycket snabb, genom att kombinera den med dedikerade bildbehandlingsprogram, kan bilder i realtid med en frekvens på 12 bilder / sek uppnås.

Vi utvecklade en teknik för att kvantitativt karakterisera kapillär morfologi och funktion, med hjälp av en konfokala fluorescens videomikroskopi enhet. Det första steget i vårt experiment var att registrera 5 sec filmer i de fyra kvadranterna av tumören för att visualisera det kapillära nätverket. Samtliga filmer har bearbetats med hjälp av programvara (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris Frankrike) som utför en automatisk segmentering av fartyg runt en vald diameter (10 mikrometer i vårt fall). Således kan vi kvantifiera "funktionell kapillär densitet", som är förhållandet mellan den totala kärlet området och den totala ytan av bilden. Denna parameter var en surrogatmarkör för mikrovaskulära densitet, vanligtvis mäts med användning av patologiverktyg.

Det andra steget var att spela in filmer i tumören under 20 minuter för att kvantifiera läckage av det makromolekylära kontrastmedel genom kapillärväggen i interstitium. Genom att mäta förhållandet av signalintensiteten i interstitium över det i kärlen, var en "index läckage" som erhållits, i egenskap av en surrogatmarkör för kapillär permeabilitet.

Introduction

Angiogenes är en komplex process ¹ som innebär bildandet av nya blodkärl från redan existerande kärl. Patologiska förändringar i vävnadsmikrocirkulationen, som består av arterioler, kapillärer och venoler, är inblandade i ett stort antal sjukdomar som cancer, inflammation, eller diabetes. Det är därför viktigt att utveckla metoder för att kvantitativt bedöma mikrokärls struktur och funktion. Imaging möjliggör studier av mikrokärl i en icke-eller mikro-invasivt sätt, i realtid och in vivo, och upprepade mätningar över tiden i samma djur ^2.

För närvarande är dynamisk kontrastförstärkt (DCE) imaging ³ används ofta för att bedöma vävnadsmikrocirkulation. Dynamisk kontrastförstärkt avbildning är en teknik som följer med tiden biodistributionen av ett spårämne injiceras intravenöst. Från detta förvärv kan kvantitativa parametrar utvinnas reflekterande vävnads vaskularisering. DCE-avbildninghar oftast med CT, MR eller ultraljud. Men dessa avbildningstekniker tillåter inte direkt visning av mikrokärl, eftersom deras upplösning, annat än med hjälp av särskilda experimentella enheter, oftast förblir makroskopisk.

I detta papper, föreslår vi att studera tumörkärlen på mikroskopisk skala och in vivo med hjälp av dynamisk kontrastförstärkt optisk avbildning, med fibered konfokal videomikroskopi. Vi använde ett makromolekylärt kontrastmedel (FITC-dextran) som förblir enbart inom fartyg eller läckage genom den endoteliala barriären till interstitium, enligt dess molekylvikt och de egenskaper hos endotelet i vävnaden undersökts ^4. Detta tillät studiet av både mikrokärlsstruktur, genom att korrekt avgränsa fartyg, och kapillär permeabilitet, genom att läcka och ansamlas i interstitium.

Protocol

1. Framställning av kontrastmedlet

1. För FITC-dextran 70 kDa, är den dos injicerades 500 mg / kg (10 mg av FITC-dextran utspätt i 0,1 ml saltlösning till en mus med en vikt 20 g).
2. Agenten får inte utsättas för lång för ljus. För att undvika blekning, är det rekommenderat att täcka röret med aluminiumfolie.

2. Anestesi

1. Möss sövdes genom en intraperitoneal injektion av en blandning av 01:04 av xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrike) och ketamin (Ketamin 500, Virbac, Carros, Frankrike), respektive 66 mg / kg och 264 mg / kg för en 20 g mus.

3. Beredning av organ av intresse

1. Vi rakade mössen vid platsen av intresse (till exempel, över en subkutan tumör). Djur hår är ofta automatisk fluorescerande när vitt. När svart, absorberar det ljus.
2. Huden inför den kroppsdel ​​som skall avbildas skars. Det är viktigt att vänta tills bleeding har stannat innan du injicerar kontrastmedlet, annars kommer det att läcka i blodet och förorena bilden.

4. Förvärv

1. Kontrastmedlet injicerades genom antingen jugularvenen eller svansvenen. Det finns ingen eller liten bakgrundssignal i det organ som observeras i frånvaro av ett fluorescerande kontrastmedel.
2. Sonden placeras framför den kroppsdel ​​som skall avbildas. I vår studie var det tumören.
3. Lasern sattes på för att belysa tumören och se fluorescensen i kapillärerna.
4. Tumören undersöktes manuellt genom att flytta sonden i en mycket långsam rörelse under inspelningen för att visualisera det kapillära nätet. Det är viktigt att upprätthålla en stadig hand, och denna teknik kräver lite erfarenhet. I vår studie, detta första steg är tillåtna kvantifiering av funktionell kapillär densitet.
5. Det andra steget var den dynamiska förvärvet över tiden. För denna studie använde vi en 70 kDa FITC-dextran. Det finns ingen interstitiell läckage i de flesta normala organ, men det finns i tumörer. För att få bilder av samma plats över tiden (som i vårt fall), är det viktigt att inrätta ett system för att hålla sonden på området av intresse. Detta gjordes genom användning av en handgjord stöd för att hålla sonden, och genom att placera en bit av ultraljud gel på spetsen av sonden. Innan inspelningen, var tid att stabilisera sonden i kontakt med tumören. När läget var säkrad, fanns det bara minimal rörelse på grund av musens andning. Lasern sattes på för att spela in tre bilder varje 30 sek i 20 min för att detektera närvaron av kapillär läckage. Det var avstängd mellan varje inspelning för att minska kontrastmedel blekning.
6. I vårt experiment avlivades mössen vid slutet av förfarandet för histologisk analys av tumörer.

Representative Results

Med hjälp av data som samlats in, kan vi kvantitativt analysera olika parametrar som speglar mikrocirkulationen.

Vi studerade in vivo den perifera vaskulära nätverket av en kolontumör implanterades i BALB-c-möss med användning av en fibered konfokal fluorescens videomikroskopi systemet (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Frankrike ^2), efter injektion av en makromolekylär fluorescerande kontrastmedlet fluoresceinisotiocyanat-dextran ( FITC-dextran) med en molekylvikt på 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) och med exciterings-och emissionsvåglängder av 488 nm och 520 nm respektive (för kompatibilitet med vårt Imaging System).

Det första steget i vårt experiment var att registrera 5 sec filmer i varje av de fyra kvadranterna av tumören för att visualisera det kapillära nätverket. Detta tillät representativ provtagning av tumören vaskularisering. Samtliga filmer har bearbetats med hjälp av en programvara (Imagecell, MaunaKea Technology, Paris Frankrike) utför en automatisk segmentering av fartyg i bilderna kring en vald diameter (10 mikrometer i vårt fall, som inkluderade fartyg som sträcker sig från 5-20 mikrometer i diameter). Således kan vi kvantifiera "funktionell kapillär densitet" (FCD), som är förhållandet mellan den totala fartyget området och den totala ytan av bilden. Denna parameter var en surrogatmarkör för mikrovaskulära densitet, vanligtvis mäts med användning av patologiverktyg. Figur 1 visar ett exempel på den typ av bilder som erhålls, och resultatet av kärlet segmentering. I detta exempel framställdes FCD mätt som 36%.

Därefter tillsattes tre bilder registrerades varje 30 sekund under 20 minuter för att detektera närvaron av kapillär läckage. Visuell undersökning av bilderna utfördes först, för att utvärdera närvaron eller frånvaron av kontrastmedel läckage in i interstitium samt dess rumsliga fördelning (homogen eller heterogen).

Vi drog tre regioner int erest (ROI) i kapillärerna och tre ROI i interstitium vid tidpunkterna 0, 5, 10 och 20 min. Signalintensitet (SI) inom de tre olika kapillärer och sammanhängande interstitiell områden i genomsnitt vid varje tidpunkt. Index läckage (%) beräknades enligt följande = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, där Ip är perivaskulära (eller interstitiell) intensitet och Ii är intravaskulär intensitet ^{5 -7.} Figur 2 visar ett exempel på kontrastmedel läckage i interstitium. I detta exempel indexläckage mätt som 1,47.

Denna dynamiska kontrastförstärkt optisk bildteknik möjliggör in vivo mätningar av tumörmikrocirkulation. Det återspeglar arkitekturen i tumörkärlen genom att kvantifiera kapillär densitet, och deras funktion genom att kvantifiera kapillär permeabilitet.

g "/>
Figur 1. Vänster:. Bild av mikrokärl i det ytliga skiktet av tumören Höger: tillämpning av fartyget detekteringsmodulen till automatiskt segment fartyg med diametrar från 5-20 um (diameter ränta: 10 pm). De segmenterade fartygen är markerade i lila.

Figur 2. Läckage från kapillärerna till interstitium vid olika tidpunkter, respektive t ₀ (a), t ₅ (b), t ₁₀ (c) och t ₂₀ (d). Fartyg (V) betraktas som hög signal linjära strukturer. Före injektion (t _0), är ingen signal ses i interstitium (I). Successivt kan en förbättring ses i interstitium på grund av en läcka i den fluorescerande kontrastmedlet genom det onormala tumör endotelial barriär.

Discussion

Studiet av tumörmikrocirkulationen har blivit avgörande för att förstå patofysiologin vid tumörtillväxt, spridning och terapisvar ^1. Optisk avbildning är en av de tekniker som kan användas för att observera kapillärerna med användning av ett fluorescerande kontrastmedel och kvantifiera morfologisk (Funktionell kapillär densitet) och funktionella (index läckage) parametrar.

Den fluorescensmikroskopi avbildning vi använde i denna studie har både fördelar och begränsningar. En fördel är att kunna välja storlek på kontrastmedlet. Här, med ett 70-kDa FITC-dextran, läckage genom endothelial barriären i början av experimentet var minimal, som tillät oss att observera den ursprungliga morfologi (slingrighet, anarkistiskt nätverk, osv.) För alla fartyg med en bra kontrast mellan fartyg och interstitium ^8, och efter en fördröjning, ett läckage av kontrastmedlet över 20 minuter för observation. Den i-planet (xy) upplösningen var hög (3,5 nm), som tillät oss att visualisera kärlen och interstitium på en mikroskopisk nivå, i stället för en makroskopisk nivå med de flesta andra avbildningstekniker (MRI, CT, ultraljud, PET ...). Slutligen är detta realtid avbildning, vilket innebär att kan observeras förändringar när de uppstår.

Det finns dock nackdelar med denna teknik. Apparaten är känslig för att fungera. I själva verket är sonden mycket liten (1,8 mm) och halt, och det är svårt att hålla sig på samma plats på tumören under långa tidsperioder. Djurets andningsrörelser kompromissa också stadighet. För att förbättra denna använde vi ultraljudsgel att immobilisera sonden och ett handgjort stöd för att hålla sonden i läge. Dessutom kan vi utforska endast den ytliga delen av tumören (från 100 nm till 170 nm), vilket innebär att de resultat som erhållits berör endast de mest ytliga skikten av tumören.

Huvud gräns, however, är svårigheten att nå absolut kvantifiering med hjälp av optisk avbildning. Index läckage är ett förhållande, och därför bara en semi-kvantitativ parameter. Första finns det artefakter på grund av partiell voluming i ROI. I själva verket, även om i-planet upplösning är hög, är z-planet upplösning låg (slice tjocklek av minst 70 mikrometer), vilket innebär att den innehåller både fartyg och interstitium. Därför, när man mäter signalstyrkan i ett kärl med en 10-ìm diameter, är det i genomsnitt med den omgivande interstitium ingår i segmentet. Också i optisk avbildning, finns det ett komplext förhållande mellan signalintensiteten och kontrastmedlet koncentration. När en vävnad belyses av fotoner, kan många händelser inträffar samtidigt och påverka signal uppsamlades. Det finns naturliga kromoforer i vävnader som kan absorbera excitation eller emissions fotoner såsom hemoglobin eller kollagen. Det finns också en viss diffusion som sprider fotoner i flera riktningar. Slutligen är blekning förmodligen enav de viktigaste frågorna vid användning av FITC, eftersom den leder till en förlust av signal oberoende av koncentrationen. Flera forskargrupper arbetar på att kvantifiera den optiska signalen, men det förutsätter en komplex modelization ^9,10.

Slutligen är longitudinella studier inte lätt utföras. Vi var tvungna att incisionsfilm huden för att avslöja tumören för att få bilderna, och det kan vara svårt att stänga upp snittet, speciellt när orgeln observerade är djupt inne i kroppshålan (t.ex. lever eller njure).

Totalt sett har vi utvecklat en dynamisk kontrastförstärkt fluorescens optisk bildteknik för att kvantitativt karakterisera kapillär anatomi och funktion, med hjälp av en konfokala fluorescens videomikroskopi enhet. Denna teknik kräver ytterligare validering, men kan vara användbart för att jämföra tumör vaskularisering före och efter behandling, eller mellan tumörmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin serynge Myjector 1ml 29G	Terumo Europe	BS-05M2913
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa	Sigma-Aldrich	01619HH	100 mg/mL diluted in saline
Fibered confocal videomicroscopy	Cellvizio - MaunaKea Technologies
Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000	Leica Microsystems	LSU-488	Store at 4 °C
Probe ProFlexTM Z	MaunaKea Technologies
Mosaicing software	MaunaKea Technologies
Vessel detection software	MaunaKea Technologies