Summary
In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.
Abstract
Fibered confocale fluorescentie in vivo beeldvorming met een optische vezelbundel gebruikt hetzelfde principe als fluorescerende confocale microscopie. Het kan fluorescente wekken in situ elementen via optische vezels en noteer aantal geëmitteerde fotonen, via dezelfde optische vezels. De lichtbron is een laser die de spannende licht stuurt door middel van een element binnen de vezel bundel en als het scant over het monster, herschept een afbeelding pixel voor pixel. Aangezien deze scan is zeer snel, door het te combineren met speciale software voor beeldverwerking, kunnen de beelden in real-time met een frequentie van 12 beelden / sec worden verkregen.
We ontwikkelden een techniek om kwantitatief karakteriseren capillaire morfologie en functie, met behulp van een confocale fluorescentie videomicroscopie apparaat. De eerste stap in ons experiment was 5 seconden films op te nemen in de vier kwadranten van de tumor om het capillaire netwerk visualiseren. Alle films werden verwerkt met behulp van software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Parijs Frankrijk) dat een geautomatiseerde segmentatie van schepen rond een gekozen diameter (10 micrometer in ons geval) uitvoert. Zo kunnen we de functionele capillaire dichtheid ", die de verhouding tussen het totale schip stippellijn de totale oppervlakte van het beeld kwantificeren. Deze parameter is een surrogaat marker voor microvasculaire dichtheid, meestal gemeten met behulp van pathologie gereedschap.
De tweede stap was om films van de tumor opnemen over 20 min om lekkage van de macromoleculaire contrastmiddel te kwantificeren door de capillaire wand in het interstitium. Door het meten van de verhouding van de signaalintensiteit in het interstitium boven in de vaten, een "index lekkage werd verkregen, als een surrogaat marker voor capillaire permeabiliteit.
Introduction
Angiogenese is een complex proces 1 dat de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen gaat. Pathologische veranderingen in weefsel microcirculatie, samengesteld arteriolen, capillairen, venulen en zijn betrokken bij een groot aantal ziekten zoals kanker, ontsteking, of diabetes. Het is daarom essentieel om methoden om microvessel structuur en functie kwantitatief beoordelen. Imaging maakt de studie van microvaatjes in een niet-of micro-invasieve wijze in real-time en in vivo, en herhaalde metingen in de tijd in hetzelfde dier 2.
Momenteel wordt de dynamische contrast-versterkte (DCE) beeldvorming 3 vaak gebruikt om weefsel microcirculatie te beoordelen. Dynamisch contrast-versterkte beeldvorming is een techniek die volgt na verloop van tijd de biologische verdeling van een tracer intraveneus geïnjecteerd. Van deze overname, kan kwantitatieve parameters worden gehaald als gevolg van weefsel vascularisatie. DCE beeldvormingis meestal gebruikt met CT, MRI en echografie. Echter, deze technieken geen direct bekijken van de microvaatjes, aangezien hun resolutie, anders dan bij het gebruik van specifieke experimentele apparatuur blijft meestal macroscopische.
In dit artikel stellen we voor om de tumorvaatstelsel studeren aan de microscopische schaal en in vivo met behulp van dynamische contrast-versterkte optische beeldvorming, met fibered confocale videomicroscopie. We gebruikten een macromoleculaire contrastmiddel (FITC-dextran) die uitsluitend in vaten of lekkage blijft door de endotheliale barrière in het interstitium, volgens het molecuulgewicht en de eigenschappen van het endotheel van het onderzochte weefsel 4. Hierdoor kon de studie van beide microvessel structuur, door de juiste afbakening van schepen, en capillaire permeabiliteit, door lekken en zich ophopen in het interstitium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het contrastmiddel
- Voor FITC-dextran 70 kDa, de geïnjecteerde dosis is 500 mg / kg (10 mg FITC-dextran verdund in 0,1 ml zoutoplossing muis gewicht van 20 g).
- De agent moet niet te lang worden blootgesteld aan licht. Om bleken te voorkomen, is het raadzaam om de buis met aluminiumfolie bedekken.
2. Anesthesie
- Muizen werden verdoofd met een intraperitoneale injectie van een mengsel van 01:04 van xylazine (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrijk) en ketamine (500 ketamine, Virbac, Carros, Frankrijk), respectievelijk 66 mg / kg en 264 mg / kg voor 20 g muis.
3. Voorbereiding van het Orgaan van Interest
- We geschoren de muizen ter plaatse van belang (bijvoorbeeld via een subcutane tumor). Dierlijk haar is vaak auto-tl bij wit. Wanneer zwart, absorbeert licht.
- De huid tegenover het orgel af te beelden werd ingesneden. Het is belangrijk om te wachten totdat het bloeddeg is gestopt vóór het injecteren van het contrastmiddel, anders zal lekken in het bloed en vervuilen het beeld.
4. Acquisitie
- Het contrastmiddel werd geïnjecteerd, zowel via de halsader of de staartveine. Er is weinig of geen achtergrondsignaal in het orgaan waargenomen in de afwezigheid van een fluorescerend contrastmiddel.
- De sonde werd geplaatst voor het orgaan af te beelden. In onze studie was de tumor.
- De laser werd ingeschakeld om de tumor te verlichten en zie de fluorescentie in de haarvaten.
- De tumor werd handmatig onderzocht door het bewegen van de sonde in een zeer langzame beweging tijdens de opname aan het capillaire netwerk te visualiseren. Het is belangrijk om een vaste hand houden en deze techniek vereist weinig ervaring. In onze studie, de eerste stap mag kwantificering van functionele capillaire dichtheid.
- De tweede stap was de dynamische acquisitie in de tijd. Voor dit onderzoek gebruiken we een 70 kDa FITC-dextran. Er is geen interstitiële lekkage in de meeste normale organen, maar er is in tumoren. Om beelden van dezelfde locatie in de tijd (zoals in ons geval) verkrijgen, is het belangrijk om een systeem om de sonde op het gebied van belang te handhaven. Dit werd gedaan met behulp van een handgemaakte ondersteuning van de sonde te houden en door een beetje ultrasone gel op de punt van de sonde. Voor de opname is tijd om de sonde in contact gebracht met de tumor te stabiliseren. Zodra de positie werd beveiligd, was er slechts een minimale beweging veroorzaakt door de muis ademhaling. De laser werd ingeschakeld om 3 beelden elke 30 seconden gedurende 20 minuten opnemen op de aanwezigheid van capillaire lekkage te detecteren. Het werd uitgeschakeld tussen elke opname om contrastmiddel bleken te verminderen.
- In ons experiment, werden muizen gedood aan het einde van de procedure voor histologische analyse van tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de verzamelde gegevens, kunnen we kwantitatief analyseren verschillende parameters die de microcirculatie.
Wij in vivo de perifere vasculaire netwerk van een colontumor geïmplanteerd in BALB-c-muizen met een fibered confocale fluorescentie videomicroscopie systeem (Cellvizio, Maunakea Technology, Parijs, Frankrijk 2), na injectie van een macromoleculaire fluorescerende contrastmiddel fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran ( FITC-dextran) met een molecuulgewicht van 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrijk) en met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 520 nm respectievelijk (voor compatibiliteit met onze beeldvormingssysteem).
De eerste stap in ons experiment was 5 seconden films op te nemen in elk van de vier kwadranten van de tumor om het capillaire netwerk visualiseren. Dit liet representatieve steekproef van de tumorvascularisatie. Alle films werden verwerkt met behulp van een software (ImageCell, MaunaKea Technology, Parijs Frankrijk) het uitvoeren van een geautomatiseerde segmentatie van schepen in de beelden rond een gekozen diameter (10 micrometer in ons geval, die schepen variërend 5-20 micrometer in doorsnede inbegrepen). Zo kunnen we de functionele capillaire dichtheid (FCD), dat de verhouding tussen de totale schip stippellijn de totale oppervlakte van het beeld kwantificeren. Deze parameter is een surrogaat marker van microvasculaire dichtheid, meestal gemeten met behulp van pathologie gereedschap. Figuur 1 toont een voorbeeld van het type beelden verkregen en het resultaat van het schip segmentatie. In dit voorbeeld werd FCD gemeten als 36%.
Vervolgens werden drie beelden opgenomen na elke 30 seconden gedurende 20 min om de aanwezigheid van capillaire lekkage te detecteren. Visueel onderzoek van de beelden werd eerst uitgevoerd om de afwezigheid of aanwezigheid van contrastmiddel lekkage in het interstitium alsook de ruimtelijke verdeling (homogeen of heterogeen) evalueren.
We trokken drie regio's van int erest (ROI) in de capillairen en drie ROI in het interstitium op tijdstippen 0, 5, 10 en 20 minuten. Het signaal intensiteiten (SI) in drie verschillende capillairen en aangrenzend interstitiële gebieden werden gemiddeld op elk tijdstip. Index lekkage (%) werd als volgt = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, waarbij Ip is perivasculaire (of interstitieel) intensiteit Ii intravasculaire intensiteit 5 berekend -7. Figuur 2 toont een voorbeeld van contrastmiddel lekkage in het interstitium. In dit voorbeeld werd index lekkage gemeten als 1,47.
Deze dynamische contrast-versterkte optische beeldvormingstechniek maakt in vivo metingen van de tumor microcirculatie. Het weerspiegelt de architectuur van tumorvaten door het kwantificeren capillaire dichtheid en hun functionaliteit door het kwantificeren capillaire permeabiliteit.
g "/>
Figuur 1. Links:. Beeld van kleine bloedvaten in de oppervlakkige laag van de tumor Rechts: de toepassing van het schip detectie module automatisch segment schepen met diameters 5-20 micrometer (diameter van belang: 10 pm). De gesegmenteerde vaten worden paars gemarkeerd.
Figuur 2. Lekkage van de capillairen naar het interstitium op verschillende tijdstippen, respectievelijk t 0 (a) t 5 (b), T 10 (c) en t 20 (d). Vessels (V) worden beschouwd als hoog signaal lineaire structuren. Vóór injectie (t 0), wordt geen signaal waargenomen in het interstitium (I). Geleidelijk kan een verbetering worden gezien in het interstitium gevolg van lekkage van het fluorescerende contrastmiddel door de abnormale tumor endotheliale barrière.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie van de tumor microcirculatie is essentieel in het begrijpen van de pathofysiologie van tumorgroei, de verspreiding en de respons op de therapie 1 geworden. Optische beeldvorming is een van de technieken die kunnen worden gebruikt om de capillairen observeren met een fluorescerend contrastmiddel en morfologische (functionele capillaire dichtheid) en functionele (index lekkage) kwantificeert.
De fluorescentie microscopie we in deze studie heeft zowel voordelen en beperkingen. Een voordeel is de mogelijkheid om de omvang van het contrastmiddel te kiezen. Hier, met een 70-kDa FITC-dextran, lekkage van de endotheliale barrière aan het begin van het experiment was minimaal, waardoor we de oorspronkelijke morfologie (kronkeling, anarchistisch netwerk enz..) Van het vaartuig waarnemen met een goed contrast tussen schepen en interstitium 8, en na een vertraging, een lekkage van het contrastmiddel dan 20 min. van de waarneming. De in-plane (xy) resolutie is hoog (3,5 micrometer), wat ons toeliet om de schepen en het interstitium op een microscopisch niveau zichtbaar te maken, in plaats van een macroscopisch niveau als bij de meeste andere beeldvormende technieken (MRI, CT, echografie, PET ...). Tenslotte is real-time imaging, waardoor veranderingen kunnen worden waargenomen als ze optreden.
Er zijn echter nadelen aan deze techniek. De inrichting is delicaat te bedienen. Inderdaad, de probe is zeer klein (1,8 mm) en glad en het is moeilijk om te verblijven op dezelfde plaats op de tumor gedurende langere tijd. Ademhaling bewegingen van het dier in gevaar brengen ook standvastigheid. Om dit te verbeteren, gebruikten we echogel de sonde en een handgemaakte steun immobiliseren van de sonde op zijn plaats te houden. Bovendien kunnen we alleen oppervlakkige gebied van de tumor (van 100 urn tot 170 urn) staand, waardoor de resultaten alleen betrekking op de oppervlakkige lagen van de tumor.
De belangrijkste beperking, however, is de moeilijkheid in het bereiken absolute kwantificering middels optische beeldvorming. Index lekkage ratio, en daarom slechts een semi-kwantitatieve parameter. Ten eerste zijn er artefacten door gedeeltelijke voluming in het ROI. Inderdaad, hoewel de in-plane resolutie is hoog, de z-plane resolutie laag (slice dikte van 70 um), hetgeen betekent dat het zowel schepen en interstitium. Daarom, bij het meten signaalintensiteit in een vat met een 10-micrometer diameter, wordt het gemiddelde van de omringende interstitium in de slice. Ook, optische beeldvorming, is een complexe relatie tussen de signaalintensiteit en contrastmiddel concentratie. Wanneer een weefsel wordt verlicht door fotonen kunnen vele gebeurtenissen gelijktijdig plaatsvinden en beïnvloeden de verzamelde signaal. Er zijn natuurlijke chromoforen in weefsels die excitatie of emissie fotonen zoals hemoglobine of collageen kan absorberen. Er is ook een aantal diffusie fotonen die in verschillende richtingen verspreidt. Tenslotte bleken is waarschijnlijk eenvan de belangrijkste problemen bij het gebruik van FITC, omdat het leidt tot een verlies van signaal onafhankelijk van de concentratie. Verschillende onderzoeksgroepen werken aan het kwantificeren van het optische signaal, maar dit impliceert een complexe modelization 9,10.
Tenslotte worden longitudinale studies niet eenvoudig uit te voeren. We moesten de huid om de tumor om de beelden te verkrijgen onthullen incisie, en het kan moeilijk blijken te sluiten van de incisie, vooral wanneer het orgaan waargenomen diep in de lichaamsholte (bijvoorbeeld lever en nieren).
Over het algemeen hebben we een dynamische contrast-versterkte fluorescentie optische beeldvormingstechniek om kwantitatief karakteriseren capillaire anatomie en functie, met behulp van een confocale fluorescentie videomicroscopie apparaat. Deze techniek vereist verdere bevestiging, maar kan nuttig zijn voor het vergelijken van tumor vascularisatie voor en na de behandeling, of tussen tumormodellen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
