Summary
Dans cet article, nous présentons une méthode pour analyser les microvaisseaux tumoraux in vivo en utilisant la fluorescence dynamique vidéomicroscopie de contraste amélioré. Deux paramètres quantitatifs ont été acquises: densité capillaire fonctionnelle réfléchissant la vascularisation de la tumeur, et les fuites d'index reflétant la perméabilité de la paroi endothéliale.
Abstract
Confocale fibrée imagerie de fluorescence in vivo avec un faisceau de fibre optique utilise le même principe que la microscopie confocale à fluorescence. Il peut exciter fluorescente in situ dans les éléments à travers les fibres optiques, et ensuite enregistrer une partie des photons émis, par l'intermédiaire des mêmes fibres optiques. La source de lumière est un laser qui émet la lumière d'excitation au moyen d'un élément à l'intérieur du faisceau de fibres et qui scrute au-dessus de l'échantillon, recrée un pixel d'image par pixel. Comme cette analyse est très rapide, en le combinant avec un logiciel spécialisé de traitement d'image, des images en temps réel avec une fréquence de 12 images / s peuvent être obtenues.
Nous avons développé une technique pour caractériser quantitativement la morphologie et de la fonction capillaire, en utilisant un dispositif de vidéo-microscopie confocale de fluorescence. La première étape dans notre expérience était d'enregistrer des 5 films à sec dans les quatre quadrants de la tumeur de visualiser le réseau capillaire. Tous les films ont été traitées en utilisant le logiciel (jemageCell, Mauna Kea Technologie, Paris France) qui effectue une segmentation automatique des navires autour d'un diamètre choisi (10 um dans notre cas). Ainsi, on peut quantifier la "densité capillaire fonctionnelle», qui est le rapport entre la superficie totale de la cuve et la surface totale de l'image. Ce paramètre a été un marqueur de substitution pour la densité microvasculaire, généralement mesurée à l'aide des outils de pathologie.
La deuxième étape a consisté à enregistrer les séquences vidéo de la tumeur de plus de 20 min pour quantifier les fuites de l'agent de contraste macromoléculaire à travers la paroi capillaire dans l'interstitium. En mesurant le rapport de l'intensité du signal dans l'interstitium plus que dans les récipients, un "indice de fuite" a été obtenue, agissant comme un marqueur de substitution de la perméabilité capillaire.
Introduction
L'angiogenèse est un processus complexe qui implique 1 la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Des changements pathologiques dans la microcirculation des tissus, composées d'artérioles, des capillaires et des veinules,, sont impliquées dans un grand nombre de maladies telles que le cancer, l'inflammation ou le diabète. Il est donc essentiel de développer des méthodes pour évaluer quantitativement la structure et la fonction des microvaisseaux. Imaging permet l'étude des micro-vaisseaux dans un non-invasive ou micro-manière, en temps réel et in vivo, ainsi que des mesures répétées dans le temps chez le même animal 2.
Actuellement, dynamique contraste amélioré (DCE) imagerie 3 est couramment utilisé pour évaluer la microcirculation des tissus. L'imagerie par contraste amélioré dynamique est une technique qui va suivre dans le temps la biodistribution d'un traceur injecté par voie intraveineuse. De cette acquisition, les paramètres quantitatifs peuvent être extraites reflétant la vascularisation des tissus. Imagerie DCEa été le plus souvent utilisé avec CT, IRM ou échographie. Cependant, ces techniques d'imagerie ne permettent pas la visualisation directe des microvaisseaux, depuis leur résolution, à l'exception de l'utilisation de dispositifs expérimentaux spécifiques, reste le plus souvent macroscopique.
Dans cet article, nous proposons d'étudier la vascularisation de la tumeur à l'échelle microscopique et in vivo en utilisant l'imagerie optique de renforcement du contraste dynamique, avec fibrée vidéomicroscopie confocale. Nous avons utilisé un agent de contraste macromoléculaire (FITC-dextran) qui reste exclusivement dans les récipients ou les fuites à travers la barrière endothéliale dans l'interstitium, en fonction de son poids moléculaire et les caractéristiques de l'endothélium du tissu étudié 4. Cela a permis l'étude de la structure à la fois des microvaisseaux, en délimitant correctement les navires, et la perméabilité capillaire, par des fuites et l'accumulation dans le tissu interstitiel.
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Protocol
Une. Préparation de l'agent de contraste
- Pour FITC-dextran 70 kDa, la dose injectée est de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextran dilué dans 0,1 ml de solution saline pour une souris pesant 20 g).
- L'agent ne doit pas être exposé trop longtemps à la lumière. Pour éviter le blanchiment, il est recommandé de couvrir le tube de papier d'aluminium.
2. Anesthésie
- Les souris ont été anesthésiés par une injection intrapéritonéale d'un mélange de 1:4 de xylazine (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, France) et la kétamine (kétamine 500, Virbac, Carros, France), respectivement 66 mg / kg et 264 mg / kg pour une souris de 20 g.
3. Préparation de l'Organe d'intérêt
- Nous rasé la souris à l'endroit d'intérêt (par exemple, sur une tumeur sous-cutanée). Poils d'animaux est souvent auto-fluorescent lorsqu'il blanc. Lorsque noir, il absorbe la lumière.
- La peau en regard de l'organe à imager été incisée. Il est important d'attendre jusqu'à ce que le bleeding s'est arrêté avant d'injecter l'agent de contraste, sinon il risque de fuir dans le sang et contaminer l'image.
4. Acquisition
- L'agent de contraste a été injecté à travers une ou l'autre de la veine jugulaire ou la veine caudale. Il n'y a pas ou peu de bruit de fond dans l'organe observé en l'absence d'un agent de contraste fluorescent.
- La sonde a été placée en face de l'organe à imager. Dans notre étude, c'est la tumeur.
- Le laser a été allumé pour éclairer la tumeur et de vérifier la fluorescence dans les capillaires.
- La tumeur a été explorée en déplaçant manuellement la sonde selon un mouvement très lent pendant l'enregistrement de visualiser le réseau capillaire. Il est important de maintenir une main ferme, et cette technique nécessite un peu d'expérience. Dans notre étude, cette première étape a permis la quantification de la densité capillaire fonctionnelle.
- La deuxième étape a été l'acquisition dynamique au fil du temps. Pour cette étude, nous avons utilisé un 70 kDa FITC-dextran. Il n'y a pas de fuite interstitielle dans la plupart des organes normaux, mais il est dans les tumeurs. Pour acquérir des images de la même position dans le temps (comme dans notre cas), il est important de mettre en place un système pour maintenir la sonde sur la zone d'intérêt. Cela a été fait en utilisant un support à la main pour tenir la sonde, et en plaçant un morceau de gel d'ultrasons sur la pointe de la sonde. Avant l'enregistrement, le temps a été dépensé pour stabiliser la sonde placée en contact avec la tumeur. Une fois la position a été fixée, il n'y avait qu'un mouvement minime en raison de la respiration de la souris. Le laser a été allumé pour enregistrer trois images toutes les 30 secondes pendant 20 min pour détecter la présence d'une fuite capillaire. Il a été éteint entre chaque enregistrement de réduire agent de contraste blanchiment.
- Dans notre expérience, les souris ont été sacrifiées à la fin de la procédure pour l'analyse histologique des tumeurs.
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Representative Results
En utilisant les données recueillies, nous pourrions analyser quantitativement différents paramètres reflétant la microcirculation.
Nous avons étudié in vivo le réseau vasculaire périphérique d'une tumeur du côlon implanté dans des souris Balb-C en utilisant un système de fluorescence de vidéo-microscopie confocale fibrée (Cellvizio, Maunakea technologie, Paris, France 2), après l'injection d'un agent de contraste fluorescent macromoléculaire isothiocyanate de fluorescéine-dextran ( FITC-dextran) avec un poids moléculaire de 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) et avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 520 nm, respectivement (pour la compatibilité avec un système d'imagerie).
La première étape dans notre expérience était d'enregistrer des 5 films à sec dans chacun des quatre quadrants de la tumeur de visualiser le réseau capillaire. Cet échantillonnage représentant autorisé de la vascularisation de la tumeur. Tous les films ont été traitées à l'aide d'un logiciel (ImageCell, MaunaKea Technologie, Paris France) d'effectuer une segmentation automatique des navires dans les images autour d'un diamètre choisi (10 um dans notre cas, qui comprenait les navires allant 5-20 m de diamètre). Ainsi, on peut quantifier la "densité capillaire fonctionnelle» (FCD), qui est le rapport entre la superficie totale de la cuve et la surface totale de l'image. Ce paramètre a été un marqueur de substitution de la densité microvasculaire, généralement mesurée en utilisant des outils de pathologie. Figure 1 montre un exemple du type d'images obtenues et le résultat de la segmentation récipient. Dans cet exemple, FCD a été mesurée comme 36%.
Ensuite, les trois images ont été enregistrées toutes les 30 secondes pendant 20 min pour détecter la présence d'une fuite capillaire. L'examen visuel des images a été effectuée en premier, pour évaluer l'absence ou en présence d'un agent de contraste fuite dans l'interstitium, ainsi que sa répartition spatiale (homogène ou hétérogène).
Nous avons tiré trois régions de int EREST (ROI) dans les capillaires et trois ROI dans l'interstitium à des moments 0, 5, 10 et 20 min. Les intensités de signal (SI) dans les trois capillaires différents et des zones interstitielles contigus ont été en moyenne à chaque point de temps. Indice de fuite (%) a été calculé comme suit = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, où Ip est périvasculaire (ou interstitielle) et l'intensité Ii est l'intensité 5 intravasculaire -7. figure 2 montre un exemple d'agent de fuite de contraste dans le tissu interstitiel. Dans cet exemple, les fuites d'indice a été mesuré comme 1,47.
Cette technique d'imagerie optique dynamique à contraste amélioré permet des mesures in vivo de la microcirculation de la tumeur. Il reflète l'architecture des vaisseaux tumoraux en quantifiant la densité capillaire, et leur fonctionnalité en quantifiant la perméabilité capillaire.
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Figure 1. Gauche:. L'image des microvaisseaux dans la couche superficielle de la tumeur droite: application du module de détection des navires pour les navires automatiquement des segments avec des diamètres allant 5-20 um (diamètre d'intérêt: 10 pm). Les vaisseaux segmentés sont mis en évidence en violet.
Figure 2. Les fuites à partir des capillaires de l'interstitium à différents points dans le temps, respectivement t 0 (a), t 5 (b), t 10 (c) et t 20 (d). Navires (V) sont vus structures linéaires aussi élevé de signaux. Avant l'injection (t 0), aucun signal n'est visible dans l'interstitium (I). Progressivement, une amélioration peut être vu dans l'interstitium due à une fuite de l'agent de contraste fluorescent à travers la barrière endothéliale tumorale anormale.
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Discussion
L'étude de la microcirculation de la tumeur est devenue essentielle dans la compréhension de la physiopathologie de la croissance tumorale, la diffusion et la réponse au traitement 1. L'imagerie optique est l'une des techniques qui peuvent être utilisées pour observer les capillaires au moyen d'un agent de contraste fluorescent et de quantifier morphologique (densité capillaire fonctionnelle) et (fuites d'index) des paramètres fonctionnels.
L'imagerie par microscopie de fluorescence, nous avons utilisé dans cette étude a des avantages et des limites. Un avantage est de pouvoir choisir la taille de l'agent de contraste utilisé. Ici, avec un 70-kDa FITC-dextran, la fuite à travers la barrière endothéliale au début de l'expérience était minime, ce qui nous a permis d'observer la morphologie initiale (tortuosité, réseau anarchique, etc.) Des navires avec un bon contraste entre vaisseaux et l'interstitium 8, et après un retard, une fuite de l'agent de contraste de plus de 20 min d'observation. Le dans le plan (xy) la résolution est élevée (3,5 um), qui nous a permis de visualiser les vaisseaux et le tissu interstitiel à un niveau microscopique, au lieu d'un niveau macroscopique comme la plupart des autres techniques d'imagerie (IRM, CT, échographie, PET ...). Enfin, c'est l'imagerie en temps réel, ce qui signifie que des changements peuvent être observés comme ils se produisent.
Cependant, il existe des inconvénients à cette technique. L'appareil est délicat à utiliser. En effet, la sonde est très faible (1,8 mm) et glissant, et il est difficile de rester à la même place sur la tumeur pendant de longues périodes de temps. Les mouvements respiratoires de l'animal compromettent aussi la stabilité. Pour améliorer ceci, nous avons utilisé un gel à ultrasons à immobiliser la sonde et un support à la main pour maintenir la sonde en position. En outre, on peut explorer la seule zone superficielle de la tumeur (à partir de 100 um à 170 um), ce qui signifie que les résultats obtenus ne concernent que les couches les plus superficielles de la tumeur.
La principale limite, uter, est la difficulté d'atteindre la quantification absolue en utilisant l'imagerie optique. fuite d'Index est un rapport, et donc qu'un paramètre semi-quantitative. Tout d'abord, il ya des artefacts dus à voluming partielle dans le ROI. En effet, bien que la résolution dans le plan est élevé, la résolution de plan z est faible (épaisseur de coupe de 70 pm), ce qui signifie qu 'il comprend deux récipients et l'interstitium. Par conséquent, lorsque l'on mesure l'intensité du signal dans un récipient d'un diamètre de 10 um, elle est en moyenne de l'interstitium entourant incluses dans la tranche. En outre, l'imagerie optique, il existe une relation complexe entre l'intensité du signal et la concentration de l'agent de contraste. Quand un tissu est éclairé par des photons, de nombreux événements peuvent se produire simultanément et d'influencer le signal recueilli. Il ya chromophores naturels dans les tissus qui peuvent absorber excitation ou d'émission des photons comme l'hémoglobine ou de collagène. Il ya aussi une certaine diffusion qui disperse photons dans plusieurs directions. Enfin, le blanchiment est probablement l'undes problèmes les plus importants lors de l'utilisation FITC, car il induit une perte de signal indépendant de la concentration. Plusieurs groupes de recherche travaillent sur la quantification du signal optique, mais cela implique une modélisation 9,10 complexe.
Enfin, des études longitudinales ne sont pas faciles à effectuer. Nous avons dû inciser la peau pour révéler la tumeur afin d'acquérir les images, et il peut s'avérer difficile de fermer l'incision, en particulier lorsque l'organe observé est profond dans la cavité du corps (par exemple, du foie ou des reins).
Dans l'ensemble, nous avons développé une fluorescence de contraste amélioré technique d'imagerie optique dynamique pour caractériser quantitativement l'anatomie et la fonction capillaire, en utilisant un dispositif de vidéo-microscopie confocale de fluorescence. Cette technique nécessite en outre la validation, mais peut être utile pour comparer la vascularisation de la tumeur avant et après le traitement, ou entre des modèles de tumeurs.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
