Summary
Bu yazıda, dinamik kontrastlı floresan videomikroskopi kullanarak in vivo tümör mikrodamarlar analiz etmek için bir yöntem mevcut. İki sayısal parametreler elde edilmiştir: işlevsel tümörün damarlanma yansıtan kılcal yoğunluk ve endotel duvarın bir sızıntının yansıtma indeksi sızıntı.
Abstract
Bir fiber optik demeti ile fibered konfokal floresan in vivo görüntüleme floresan konfokal mikroskopi gibi aynı prensibi kullanır. Bu, optik fiberlerin yoluyla in situ elemanlarında floresan heyecan ve daha sonra aynı fiber optik üzerinden, fotonların bir kaydedebilir. Işık kaynağı, elyaf demeti içinde bir öğe aracılığıyla verici ışık gönderir ve bu örnek üzerinde tarar, piksel, bir görüntü piksel yeniden bir lazerdir. Bu tarama özel bir görüntü işleme yazılımı ile birleştirerek, çok hızlı olduğu için, 12 kare / sn 'lik bir frekans ile gerçek zamanlı görüntüleri elde edilebilir.
Biz bir konfokal floresan videomikroskopi cihazı kullanılarak, kantitatif kılcal morfolojisi ve fonksiyonunu karakterize etmek için bir teknik geliştirdi. Bizim deneyde ilk adım kılcal ağ görselleştirmek için tümörün dört kadranda 5 sn film kaydetmek oldu. Tüm filmleri (yazılım kullanarak işlendi ImageCell, seçilmiş çapı (bizim durumumuzda 10 mikron) etrafında gemilerin otomatik segmentasyon gerçekleştiren Mauna Kea Teknoloji, Paris Fransa). Böylece, toplam damar alanı ve görüntü toplam alanı arasındaki oran fonksiyonel kılcal yoğunluk 'ölçmek olabilir. Bu parametre genellikle patoloji araçlarını kullanarak ölçülen mikrovasküler yoğunluk için bir vekil belirtecidir.
İkinci adım interstisyuma kılcal duvarından makromoleküler kontrast madde sızmasını ölçmek için 20 dakika boyunca tümörün film kaydetmek için oldu. Damarlarda bu fazla interstisyumda sinyal yoğunluğu oranının ölçülmesi ile, bir "göstergesi kaçak 'kılcal geçirgenliği için bir belirteç olarak hareket eden, elde edildi.
Introduction
Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının oluşumunu içeren karmaşık bir süreçtir 1'dir. Arteryollerin, kılcal damarların ve venüllerin oluşan doku mikro patolojik değişiklikler, örneğin kanser, iltihap ya da diyabet gibi hastalıkların geniş bir ürün yelpazesi söz konusu olmaktadır. Bu kantitatif Mikrodamar yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler geliştirmek elzemdir. Görüntüleme gerçek zamanlı olarak ve in vivo olarak, bir non-veya mikro-invasif bir şekilde, mikrokapların çalışma sağlar ve aynı hayvanda 2 zamanla tekrar ölçer.
Şu anda, dinamik kontrastlı (DCE) görüntüleme 3 yaygın doku mikrodolaşımı değerlendirmek için kullanılır. Dinamik kontrastlı görüntüleme zaman içinde intravenöz olarak enjekte edilen bir izleyici bir biyo dağılıma takip eden bir tekniktir. Bu alım, niceliksel parametreler doku kanlanmalı yansıtan elde edilebilir. DCE görüntülemeçoğu zaman CT, MRI veya ultrason ile kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu görüntüleme teknikleri, özel deneysel cihazların kullanımı ile dışında kendi çözünürlük, en sık makroskopik kaldığı için, mikrokapların doğrudan görüntüleme izin vermez.
Bu yazıda, fibered konfokal videomikroskopi ile, dinamik kontrastlı optik görüntüleme kullanarak mikroskopik ölçekte ve in vivo tümör damarsal çalışma öneriyoruz. Biz, molekül ağırlığı ve doku endotel özellikleri incelenmiştir 4 göre, interstisyuma endotel bariyerini damarlar ya da sızıntı içinde özel olarak kalan bir makromoleküler bir kontrast madde (FITC-dekstran) kullanılır. Bu sızıntı ve interstisyumda biriktirerek, doğru damarları çizen hem mikrovasküler yapı çalışması, ve kılcal geçirgenliği sağladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kontrast maddenin hazırlanması
- FITC-dekstran 70 kDa için enjekte edilen doz, 500 mg / kg (FITC-dekstran 10 mg 20 gr ağırlığında bir fare için 0.1 ml tuzlu su içinde seyreltilmiş) 'dir.
- Madde ışığa uzun süre maruz olmamalıdır. Ağartma önlemek için, alüminyum folyo ile tüp karşılamak için tavsiye edilir.
2. Anestezi
- Fareler ksilazin 01:04 karışımından bir intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi edilmiştir (Rompun% 2, Bayer, Puteaux, Fransa) ve ketamin (ketamin 500, Virbac, Carros, France), sırasıyla, 66 mg / kg ve 264 mg / kg 20 g bir fare için.
3. İlgi Organ hazırlanması
- Biz, (deri altından tümör üzerinde, örneğin) ilgilenilen yerde fareler traş. Hayvan saç genellikle beyaz otomatik floresan olduğunu. Ne siyah, ışık emer.
- Yansıması için organı bakan deri kazıma edildi. Bu kanayan kadar beklemek önemlidirg aksi takdirde kan sızıntı ve görüntüyü kirletecek, kontrast madde enjekte etmeden önce durdu.
4. Edinme
- Kontrast madde jugular damar ya da kuyruk ven yoluyla enjekte edildi. Bir fluoresan kontrast maddesi yokluğunda gözlenen organda hiç veya çok az arka plan sinyal yoktur.
- Sonda, görüntülenecek organın önüne yerleştirilmiştir. Bizim çalışmamızda, bu tümör oldu.
- Lazer tümörü aydınlatmak ve kılcal damarlar floresan görmek için döndü.
- Tümör kılcal ağ görselleştirmek için kayıt yaparken çok yavaş hareket probu hareket ettirerek elle araştırılmıştır. Bir elinizi sabit tutmak için önemlidir, ve bu teknik biraz deneyim gerektirir. Bizim çalışmamızda, bu ilk adım fonksiyonel kapiller yoğunluk ölçümü izin verdi.
- İkinci adım, zamanla dinamik satın alma oldu. Bu çalışma için, 70 kDa FITC-dekstran kullanılır. En normal organlarda hiçbir interstisyel sızıntı yoktur ama tümörlerde bulunmaktadır. (Bizim durumumuzda olduğu gibi) zamanla aynı konumda görüntüler elde etmek için, bu ilgi alanına probu korumak için bir sistem kurmak için önemlidir. Bu prob tutmak için bir el yapımı desteğini kullanarak yapılır ve prob ucunda ultrason jeli biraz koyarak edildi. Kayıttan önce, zaman tümör ile temas halinde yerleştirilen probu stabilize harcanmıştır. Pozisyon güvenli bir kez nedeniyle fare nefes sadece minimal hareket vardı. Lazer kılcal sızıntı varlığını tespit etmek için 20 dakika boyunca 3 görüntüleri 30 saniye kaydetmek için çalıştırılmıştır. Bu kontrast madde beyazlatma azaltmak için her kayıt arasında kapalıydı.
- Deneyde, farenin tümörleri histolojik analiz için prosedür sonunda kurban edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplanan veriler kullanılarak, kantitatif Mikrodolaşımı yansıtan farklı parametreleri analiz edebilirsiniz.
Biz çalışılan in vivo bir lifli konfokal videomikroskopi floresan sistemi (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Fransa 2), bir makromoleküler fluoresan kontrast madde enjekte edildikten sonra floresein izotiosiyanat-dekstran kullanarak (Balb-c farelere implante bir kolon tümör periferik vasküler ağ 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Fransa) ve sırasıyla 488 nm ve 520 nm uyarma ve emisyon dalga boyları ile (eden görüntüleme sistemi ile uyumluluk için) bir molekül ağırlığı olan FITC-dekstran).
Bizim deneyde ilk adım kılcal ağ görselleştirmek için tümörün dört kadran her 5 sn film kaydetmek oldu. Tümör damarlanma Bu izin temsilcisi örnekleme. Tüm filmleri bir yazılım (ImageCell, Mauna kullanılarak işlendiKea Teknoloji, Paris Fransa) çapı 5-20 mikron arasında değişen gemiler dahil seçilen çap (bizim durumumuzda 10 mikron) etrafında görüntüleri gemilerin otomatik segmentasyon performans. Böylece, toplam damar alanı ve görüntü toplam alanı arasındaki oran fonksiyonel kılcal yoğunluğu '(FKH) ölçmek olabilir. Bu parametre, çoğunlukla patoloji aletler kullanılarak ölçülebilir, mikrovasküler yoğunluk, bunun yerine markör oldu. Şekil 1 elde edilen görüntülerin tipine ve damar bölütleme sonucunun bir örneğini göstermektedir. Bu örnekte, FCD% 36 olarak ölçülmüştür.
Daha sonra, üç görüntü kılcal sızıntı varlığını tespit etmek için 20 dakika boyunca her 30 saniye kaydedildi. Görüntülerin görsel olarak incelenmesi, birinci kontrast ajanı interstisyuma kaçağı hem de uzaysal dağılımı (homojen veya heterojen) ve yokluğunun ya da varlığının değerlendirilmesi için gerçekleştirildi.
Biz int üç bölge çekti zaman noktalarında 0, 5, 10 ve 20 dakika da interstisyumda kapilerlerin ve üç ROI erest (ROI). Üç farklı kılcal ve bitişik boşluk alanları olan sinyal yoğunlukları (SI) her zaman noktasında ortalama edilmiştir. = Σ Ip perivasküler (veya interstisyel) yoğunluğu ve Ii damar içi yoğunluğu 5'tir [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, aşağıdaki gibi Endeksi sızıntı (%) hesaplanmıştır -7. Şekil 2, interstisyumda kontrast madde kaçağı bir örneğini göstermektedir. Bu örnekte, işaret kaçak 1.47 olarak ölçülmüştür.
Bu dinamik kontrastlı optik görüntüleme tekniği tümör mikrodolaşımında in vivo ölçümler sağlar. Bu kapiller geçirgenliği ölçülerek kapiller yoğunluğu ve bunların işlevselliğini nicelleştirilmesiyle tümör damarlarının mimarisini yansıtmaktadır.
g "/>
Şekil 1. Sol:. Tümörün yüzeysel tabakasındaki mikrokapların resim Sağ: damar algılama modülünün uygulama için otomatik olarak değişen çaplarda kademeli bir gemi 5-20 um (ilgi çapı: 10 um) tanımlanmaktadır. Parçalara gemiler mor vurgulanır.
Şekil 2. Farklı zaman noktalarında İntersitisyel sırasıyla t 0 (a) t 5 (b), t 10 (c) ve t, 20 (d). Gemiler (V) için kılcal sızıntı olarak yüksek bir sinyal doğrusal yapılar görülür. Enjeksiyonu (t, 0) 'dan önce, sinyal İntersitisyel (I)' de görülmektedir. Giderek, bir donanım nedeniyle anormal tümör endotelyal bariyerini fluoresan kontrast maddesinin bir sızıntı için interstisyumda görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör mikrodolaşımında çalışma tümör büyümesi, yayılması ve tedaviye 1 yanıtı hastalık patofizyolojisi gerekli hale gelmiştir. Optik görüntüleme bir fluoresan kontrast maddesi kullanılarak kılcal gözlemlemek ve morfolojik (Fonksiyonel Kılcal Yoğunluk) ve fonksiyonel (index kaçak) parametrelerini ölçmek için kullanılabilir tekniklerden biridir.
Bu çalışmada kullanılan floresan mikroskobu görüntüleme avantajları ve sınırları hem de vardır. Bir avantajı, kullanılan kontrast maddenin boyutunu seçmek mümkün ediliyor. Burada, 70-kDa FITC-dekstran, deney başlangıcındaki endotel bariyerini sızıntı us arasında iyi bir kontrasta sahip kapların ilk morfolojisi (eğrilik, anarşik ağı, vb.) Gözlemlemek için izin verilmiş olan, çok az gemiler ve interstisyum 8 ve bir gecikmeden sonra, gözlem 20 dakika boyunca kontrast madde bir kaçak. In-düzlemine (xy) çözünürlük bize bunun yerine çoğu diğer görüntüleme teknikleri (MRI, CT, ultrason, PET ...) gibi bir makroskopik düzeyde, bir mikroskobik düzeyde damarları ve interstisyumunu görselleştirmek için izin, hangi (3.5 mikron) yüksek oldu. Son olarak, bu onlar ortaya gibi değişiklikler görülebilir anlamına gelir, gerçek zamanlı görüntüleme olduğunu.
Bununla birlikte, bu teknik dezavantajları vardır. Cihaz çalıştırmak için hassastır. Gerçekten de, sonda çok küçük (1.8 mm) ve kaygan olduğu ve uzun süre boyunca tümör üzerindeki aynı yerde kalma zordur. Hayvanın solunum hareketleri de istikrar uzlaşma. Bunu geliştirmek için, biz pozisyonda probu korumak için prob ve el yapımı bir destek hareketsiz için ultrason jeli kullanılır. Ayrıca, sonuçlar bir endişe tümörün sadece en yüzeysel katmanları elde anlamına gelir ki, tümör sadece yüzeysel alanını (100 um ila 170 um 'dan itibaren) keşfedebilir.
Ana sınırı, however, optik görüntüleme kullanarak kesin miktarının ulaşmadaki zorluktur. Index sızıntı oranı olduğu, ve bu yüzden sadece bir yarı-kantitatif parametresi. İlk olarak, ROI kısmi voluming nedeniyle eserler vardır. In-düzlem çözünürlüğü yüksek olmasına rağmen Gerçekten de, z düzlemi çözünürlük damarları ve interstisyumunu içerir anlamına gelir ki, (70 um'lik dilim kalınlığında) düşüktür. 10 mikron çaplı bir kap içinde sinyal yoğunluğu ölçümü, bu nedenle, bu dilim dahil çevreleyen interstisyuma ile ortalaması alınır. Ayrıca, optik görüntüleme, sinyal yoğunluğu ve kontrast madde konsantrasyonu arasında karmaşık bir ilişki vardır. Bir doku fotonlar tarafından yandığında, birçok olaylar aynı anda meydana gelen ve toplanan sinyali etkileyebilir. , Hemoglobin ya da kolajen gibi uyarım veya foton emisyon emebilen dokularda, doğal kromoforlar vardır. Birkaç yönde dağılan fotonların bir difüzyon de bulunmaktadır. Son olarak, ağartma muhtemelen birkonsantrasyon sinyal bağımsız bir kaybı neden olur, çünkü, PE kullanılarak en önemli konulardan. Çeşitli araştırma grupları, optik sinyal miktarının üzerinde çalıştıklarını, ancak bu karmaşık bir modellemesi 9,10 ima eder.
Son olarak, uzunlamasına çalışmalar kolaylıkla gerçekleştirilir değil. Biz görüntüleri elde etmek amacıyla tümör ortaya çıkarmak için cildi kesilirken vardı ve gözlenen organın vücut boşluğuna (örn. karaciğer veya böbrek) derin olduğu, özellikle kesi kapatmak için zor olabilir.
Genel olarak, biz konfokal floresan videomikroskopi cihazı kullanılarak, kantitatif kılcal anatomi ve fonksiyonunu karakterize etmek için bir dinamik kontrastlı floresan optik görüntüleme tekniği geliştirdi. Bu tekniği daha doğrulaması gerektirir, ancak tedavi öncesi ve sonrası, veya tümör modelleri arasında tümör kanlanmalı karşılaştırmak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
