Summary
En este artículo se presenta un método para analizar los microvasos tumorales in vivo utilizando dinámica de fluorescencia videomicroscopy contraste. Dos parámetros cuantitativos se adquirieron: la densidad capilar funcional que refleja la vascularidad del tumor, y las fugas de índice que refleja la falta de estanqueidad de la pared endotelial.
Abstract
Con fibras de fluorescencia confocal de formación de imágenes in vivo con un haz de fibra óptica utiliza el mismo principio que la microscopía confocal fluorescente. Se puede excitar fluorescencia en elementos in situ a través de las fibras ópticas, y luego grabar algunos de los fotones emitidos, a través de las mismas fibras ópticas. La fuente de luz es un láser que envía la luz de excitación a través de un elemento dentro del haz de fibras y ya que revisa sobre la muestra, recrea una imagen píxel a píxel. Como este análisis es muy rápido, al combinarlo con el software de procesamiento de imágenes dedicado, imágenes en tiempo real con una frecuencia de 12 fotogramas / seg se pueden obtener.
Hemos desarrollado una técnica para caracterizar cuantitativamente la morfología y la función capilar, usando un dispositivo de videomicroscopía de fluorescencia confocal. El primer paso en nuestro experimento era grabar películas 5 segundos en los cuatro cuadrantes del tumor para visualizar la red capilar. Todas las películas fueron procesados mediante el software (ImageCell, Mauna Kea Tecnología, París Francia) que realiza una segmentación automatizado de los vasos alrededor de un diámetro elegido (10 micras en nuestro caso). Por lo tanto, se podría cuantificar la "densidad capilar funcional", que es la relación entre el área total del vaso y el área total de la imagen. Este parámetro fue un marcador sustituto para la densidad microvascular, por lo general medido usando herramientas de patología.
El segundo paso fue grabar películas del tumor durante 20 min para cuantificar la fuga del agente de contraste macromolecular a través de la pared capilar al intersticio. Mediante la medición de la relación de intensidad de la señal en el intersticio más que en los vasos, se obtuvo un "índice de fugas ', que actúa como un marcador sustituto para la permeabilidad capilar.
Introduction
La angiogénesis es un proceso complejo 1 que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes. Los cambios patológicos en la microcirculación del tejido, compuesto de las arteriolas, capilares y vénulas, están implicados en una amplia gama de enfermedades tales como el cáncer, la inflamación, o la diabetes. Por tanto, es esencial para desarrollar métodos para evaluar cuantitativamente la estructura y función de los microvasos. Imaging permite el estudio de los microvasos en un no-o de forma micro-invasivo, en tiempo real e in vivo, y medidas repetidas en el tiempo en el mismo animal 2.
Actualmente, con contraste dinámico (DCE) de formación de imágenes 3 es comúnmente utilizado para evaluar la microcirculación del tejido. De formación de imágenes de contraste mejorado dinámica es una técnica que sigue a lo largo del tiempo la biodistribución de un trazador inyectado por vía intravenosa. A partir de esta adquisición, parámetros cuantitativos se pueden extraer lo que refleja la vascularización del tejido. Imágenes DCEse ha utilizado con mayor frecuencia con la TC, resonancia magnética o ecografía. Sin embargo, estas técnicas de imagen no permiten la visión directa de los microvasos, ya que su resolución, que no sea con el uso de dispositivos experimentales específicos, más a menudo permanece macroscópica.
En este trabajo, nos proponemos estudiar la vascularización del tumor a escala microscópica como in vivo utilizando imágenes ópticas con contraste dinámico, con Fibered videomicroscopy confocal. Se utilizó un agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de los vasos o las fugas a través de la barrera endotelial en el intersticio, de acuerdo con su peso molecular y las características del endotelio del tejido estudiaron 4. Esto permitió que el estudio de la estructura tanto de los microvasos, delineando correctamente los vasos, y la permeabilidad capilar, filtrando y acumulando en el intersticio.
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Protocol
1. Preparación del agente de contraste
- Para FITC-dextrano de 70 kDa, la dosis inyectada es de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluyó en 0,1 ml de solución salina para un ratón de peso 20 g).
- El agente no debe exponerse demasiado tiempo a la luz. Para evitar la decoloración, se recomienda para cubrir el tubo con papel de aluminio.
2. Anestesia
- Los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de 01:04 de xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Francia) y ketamina (ketamina 500, Virbac, Carros, Francia), respectivamente 66 mg / kg y 264 mg / kg para un ratón de 20 g.
3. Preparación del Organo de Interés
- Se afeitaron los ratones en el lugar de interés (por ejemplo, más de un tumor subcutáneo). El pelo de los animales es a menudo auto-fluorescente cuando blanco. Al negro, que absorbe la luz.
- La piel hacia el órgano a ser fotografiado se realizó una incisión. Es importante esperar hasta que el malditog se ha detenido antes de inyectar el agente de contraste, de lo contrario, se escapará en la sangre y contaminar la imagen.
4. Adquisición
- El agente de contraste se inyecta a través de ya sea de la vena yugular o la vena caudal. Hay poca o ninguna señal de fondo es en el órgano observada en ausencia de un agente de contraste fluorescente.
- La sonda se colocó en frente del órgano a explorar. En nuestro estudio, este fue el tumor.
- El láser se enciende para iluminar el tumor y ver la fluorescencia en los capilares.
- El tumor se exploró manualmente moviendo la sonda en un movimiento muy lento durante la grabación para visualizar la red capilar. Es importante mantener una mano firme, y esta técnica requiere un poco de experiencia. En nuestro estudio, este primer paso permitió la cuantificación de la densidad capilar funcional.
- El segundo paso fue la adquisición dinámico en el tiempo. Para este estudio, se utilizó un 70 kDa FITC-dextrano. No hay fugas intersticial en la mayoría de los órganos normales pero no es en tumores. Para adquirir imágenes de la misma ubicación en el tiempo (como en nuestro caso), es importante establecer un sistema para mantener la sonda en el área de interés. Esto se hizo mediante el uso de un soporte hecho a mano para sujetar la sonda, y mediante la colocación de un poco de gel de ultrasonido en la punta de la sonda. Antes de la grabación, el tiempo se pasó a estabilizar la sonda colocada en contacto con el tumor. Una vez que la posición estaba asegurada, sólo había movimiento mínimo debido a la respiración del ratón. El láser se enciende para grabar 3 imágenes cada 30 seg durante 20 min para detectar la presencia de la fuga capilar. Se apaga entre cada grabación para reducir el blanqueo de contraste.
- En nuestro experimento, los ratones fueron sacrificados al final del procedimiento para el análisis histológico de los tumores.
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Representative Results
Con los datos recogidos, podríamos analizar cuantitativamente diferentes parámetros que reflejan la microcirculación.
Se estudió in vivo la red vascular periférica de un tumor de colon implantadas en ratones Balb-c usando un sistema de videomicroscopía de fluorescencia confocal fibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnología, París, Francia 2), después de la inyección de un agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato de fluoresceína-dextrano ( FITC-dextrano) con un peso molecular de 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) y con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 520 nm, respectivamente (para la compatibilidad con nuestro sistema de formación de imágenes).
El primer paso en nuestro experimento era grabar películas 5 segundos en cada uno de los cuatro cuadrantes del tumor para visualizar la red capilar. Este muestreo representativo permitido de la vascularización tumoral. Todas las películas fueron procesados mediante un software (ImageCell, MaunaKea Tecnología, París Francia) realizar una segmentación automatizado de los vasos en las imágenes alrededor de un diámetro elegido (10 micras en nuestro caso, que incluía vasos que van desde 5 hasta 20 m de diámetro). Por lo tanto, se podría cuantificar la "densidad capilar funcional '(FCD), que es la relación entre el área total del vaso y el área total de la imagen. Este parámetro fue un marcador sustituto de la densidad microvascular, por lo general medido usando herramientas de patología. La figura 1 muestra un ejemplo del tipo de las imágenes obtenidas y el resultado de la segmentación de los vasos. En este ejemplo, FCD se midió como 36%.
Entonces, tres imágenes se registraron cada 30 s durante 20 min para detectar la presencia de la fuga capilar. El examen visual de las imágenes se realizó en primer lugar, para evaluar la ausencia o presencia de fugas de agente de contraste en el intersticio así como su distribución espacial (homogénea o heterogénea).
Dibujamos tres regiones de int erest (ROI) en los capilares y tres retorno de la inversión en el intersticio en puntos de tiempo 0, 5, 10 y 20 min. Las intensidades de señal (SI) dentro de los tres capilares diferentes y áreas intersticiales contiguas se promediaron en cada momento. Índice de fugas (%) se calculó como sigue = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, donde Ip es perivascular (o intersticial) y la intensidad Ii es la intensidad intravascular 5 -7. Figura 2 muestra un ejemplo de fugas de agente de contraste en el intersticio. En este ejemplo, las fugas de índice se midió como 1,47.
Esta técnica de imagen óptica dinámica con contraste permite mediciones in vivo de la microcirculación tumoral. Se refleja la arquitectura de los vasos del tumor mediante la cuantificación de la densidad capilar, y su funcionalidad mediante la cuantificación de la permeabilidad capilar.
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Figura 1. A la izquierda:. Imagen de microvasos en la capa superficial del tumor Derecha: aplicación del módulo de detección de buques a los buques del segmento de forma automática con diámetros que van desde 5 hasta 20 m (diámetro de interés: 10 micras). Los vasos segmentados se resaltan en color púrpura.
Figura 2. Las fugas de los capilares hacia el intersticio en diferentes puntos de tiempo, respectivamente t 0 (a), t 5 (b), T 10 (c) y T 20 (d). Vasos (V) se consideran estructuras lineales como alta de señal. Antes de la inyección (t = 0), no hay señal se ve en el intersticio (I). Progresivamente, una mejora puede ser visto en el intersticio debido a una fuga del agente de contraste fluorescente a través de la barrera endotelial anormal del tumor.
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Discussion
El estudio de la microcirculación tumoral se ha convertido en esencial en la comprensión de la fisiopatología del crecimiento del tumor, diseminación y respuesta al tratamiento 1. De formación de imágenes óptico es una de las técnicas que se pueden utilizar para observar los capilares usando un agente de contraste fluorescente y para cuantificar morfológica (densidad capilar funcional) y los parámetros (índice de fuga) funcionales.
La imágenes de microscopía de fluorescencia se utilizó en este estudio tiene ventajas y límites. Una ventaja es ser capaz de elegir el tamaño del agente de contraste usado. Aquí, con un 70-kDa FITC-dextrano, la fuga a través de la barrera endotelial al comienzo del experimento fue mínima, lo que nos permitió observar la morfología inicial (tortuosidad, red anárquica, etc.) De los vasos con un buen contraste entre vasos y el intersticio 8, y después de un retraso, una fuga del agente de contraste durante 20 minutos de observación. El en el plano (xresolución y) fue alta (3,5 micras), que permitió visualizar los vasos y el intersticio a nivel microscópico, en lugar de a nivel macroscópico como con la mayoría de otras técnicas de imagen (resonancia magnética, tomografía computarizada, ultrasonido, PET ...). Por último, se trata de imágenes en tiempo real, lo que significa que los cambios se pueden observar a medida que ocurren.
Sin embargo, hay desventajas en esta técnica. El aparato es delicada para operar. De hecho, la sonda es muy pequeña (1,8 mm) y resbaladiza y es difícil para permanecer en el mismo lugar en el tumor durante largos períodos de tiempo. Movimientos de respiración del animal también comprometen la estabilidad. Para mejorar esto, se utilizó gel de ultrasonido para inmovilizar la sonda y un soporte hecho a mano para mantener la sonda en su posición. Además, podemos explorar sólo el área superficial del tumor (desde 100 micras a 170 micras), lo que significa que los resultados obtenidos se refieren únicamente a las capas más superficiales del tumor.
El límite principal, however, es la dificultad de llegar a una cuantificación absoluta utilizando imágenes ópticas. Fugas Index es una proporción, por lo que sólo un parámetro semi-cuantitativa. En primer lugar, hay artefactos debido a voluming parcial en el retorno de la inversión. De hecho, aunque la resolución en el plano es alta, la resolución plano z es baja (grosor de corte de 70 micras), lo que significa que incluye tanto los vasos y el intersticio. Por lo tanto, cuando la medición de intensidad de la señal en un recipiente con un diámetro de 10-micras, que se promedia con el intersticio circundante incluido en la rebanada. También, en formación de imágenes ópticas, existe una relación compleja entre la intensidad de la señal y la concentración de agente de contraste. Cuando un tejido es iluminado por los fotones, muchos eventos pueden ocurrir al mismo tiempo e influir en la señal recogida. Hay cromóforos naturales en los tejidos que pueden absorber de excitación o de emisión de fotones, como la hemoglobina o colágeno. También hay algo de difusión que dispersa los fotones en varias direcciones. Por último, el blanqueado es probablemente unode las cuestiones más importantes a la hora utilizando FITC, ya que induce una pérdida de señal independiente de la concentración. Varios grupos de investigación están trabajando en la cuantificación de la señal óptica, pero esto implica una compleja 9,10 modelización.
Por último, no se realizan con facilidad los estudios longitudinales. Tuvimos que incidir la piel para revelar el tumor con el fin de adquirir las imágenes, y puede resultar difícil de cerrar la incisión, en particular cuando el órgano observado es profunda en la cavidad del cuerpo (por ejemplo, hígado o riñón).
En general, hemos desarrollado una técnica de imagen óptica de fluorescencia con contraste dinámico para caracterizar cuantitativamente la anatomía y la función capilar, utilizando un dispositivo videomicroscopy fluorescencia confocal. Esta técnica requiere una validación adicional, pero puede ser útil para comparar la vascularización del tumor antes y después de la terapia, o entre modelos de tumores.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
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