Summary
В данной работе мы представляем метод для анализа опухолевых микрососудов в естественных условиях с использованием динамического контрастным усилением флуоресценции видеомикроскопии. Были приобретены два количественные параметры: функциональный плотности капилляров, отражающий кровоснабжение опухоли, и утечки индекс, отражающий неплотности из эндотелиальных стенках.
Abstract
Волокнистые конфокальной флуоресцентной в естественных изображений с светового пучка использует тот же принцип, как флуоресцентной конфокальной микроскопии. Это может возбудить флуоресцентные в элементах на места через оптические волокна, а затем записать некоторые из излучаемых фотонов, с помощью тех же оптических волокон. Источником света является лазер, который посылает возбуждающего света через элемент в расслоения и, как он сканирует по образцу, воссоздает изображения пиксель за пикселем. Как это сканирование происходит очень быстро, путем объединения его с выделенным программным обеспечением для обработки изображений, изображения в режиме реального времени с частотой 12 кадров / сек можно получить.
Мы разработали методику для количественного характеризуют капилляров морфологию и функцию, с помощью конфокальной флуоресцентной видеомикроскопии устройство. Первый шаг в нашем эксперименте было записывать 5 секунд фильмов в четырех квадрантов опухоли визуализировать капиллярную сеть. Все фильмы были обработаны с помощью программного обеспечения (яmageCell, Мауна-Кеа Технологии, Париж Франция), который выполняет автоматизированную сегментацию сосудов вокруг выбранного диаметра (10 мкм в нашем случае). Таким образом, можно количественно оценить "функциональной плотности капилляров ', который является соотношение между общей площадью сосуда и общей площади изображения. Этот параметр был суррогатным маркером плотности микрососудов, как правило, измеряется с помощью патологии инструменты.
Вторым шагом было записывать фильмы опухоли в течение 20 мин для количественного утечку макромолекулярном контрастного вещества через стенки капилляров в интерстиций. Измеряя соотношение интенсивности сигнала в интерстиции над, что в сосудах, был получен "индекс утечки", действуя в качестве суррогатного маркера проницаемости капилляров.
Introduction
Ангиогенез является сложным процессом, 1, что предполагает формирование новых кровеносных сосудов из уже существующих судов. Патологические изменения в ткани микроциркуляции, состоящие из артериол, капилляров и венул, вовлечены в большом спектре заболеваний, таких как рак, воспаление, или диабет. Поэтому очень важно в разработке методов количественной оценки структуры микрососудов и функции. Изображений позволяет изучать микрососудов в не-или микро-инвазивная образом, в режиме реального времени и в естественных условиях, и повторные измерения с течением времени в той же животного 2.
В настоящее время динамического контрастным усилением (DCE) визуализации 3 обычно используется для оценки тканевой микроциркуляции. Динамическая визуализация с контрастным усилением является методом, который следует в течение долгого времени биораспределение трассера введен внутривенно. С этим приобретением, количественные параметры могут быть извлечены отражающие ткани васкуляризации. Томография DCEбыл наиболее часто используется с КТ, МРТ или УЗИ. Однако эти методы визуализации не позволяют непосредственное наблюдение микрососудов, так как их разрешение, кроме с использованием конкретных экспериментальных устройств, наиболее часто остается макроскопическим.
В этой статье мы предлагаем изучить сосудистую сеть опухоли в микроскопическом масштабе и в естественных условиях с использованием динамического оптических изображений контрастным усилением, с расслаивается конфокальной видеомикроскопии. Мы использовали макромолекулярную контрастное вещество (FITC-декстран), который остается исключительно в судах или утечек через эндотелия барьер в интерстиции, в соответствии с его молекулярной массы и характеристики эндотелия ткани изучены 4. Это позволило изучение как структуры микрососудов, по правильно разграничения сосуды и проницаемость капилляров, по протекал, и накапливается в интерстиции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Агента Contrast
- Для FITC-декстрана 70 кДа, доза вводится 500 мг / кг (10 мг FITC-декстран разводили в 0,1 мл физиологического раствора на мышь весом 20 г).
- Агент не должен подвергаться воздействию слишком долго, чтобы света. Чтобы избежать отбеливания, рекомендуется, чтобы покрыть трубу с алюминиевой фольгой.
2. Анестезия
- Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией смеси 1:04 ксилазина (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Франция) и кетамин (кетамин 500, Virbac, Каррос, Франция), соответственно 66 мг / кг и 264 мг / кг для 20 г мыши.
3. Подготовка органа интересов
- Мы побрился мышей по месту нахождения интерес (например, над подкожной опухоли). Волос животных часто самофлюоресцирующими когда белый. Когда черный, он поглощает свет.
- Кожа перед орган для включения в образ рассекали. Важно не ждать до кровотеченияхг остановилось перед инъекцией контрастного вещества, в противном случае он будет течь в крови и загрязнять изображение.
4. Приобретение
- Контрастное вещество вводили либо через яремную вену или хвостовую вену. Существует нет или мало фоновый сигнал в органе, наблюдаемой в отсутствие флуоресцентного контрастного вещества.
- Зонд был помещен в передней части органа для включения в образ. В нашем исследовании, это было опухоль.
- Лазер был включен, чтобы осветить опухоль и увидеть флуоресценцию в капиллярах.
- Опухоль была исследована вручную путем перемещения зонда в очень медленном движении во время записи для визуализации капиллярную сеть. Важно поддерживать устойчивый руку, и этот метод требует немного опыта. В нашем исследовании, этот первый шаг позволил количественную оценку функционального плотности капилляров.
- Вторым шагом было динамичным приобретение с течением времени. Для этого исследования мы использовали 70 кДа FITC-декстран. Там нет интерстициальный утечки в большинстве нормальных органов, но есть в опухоли. Чтобы получить изображения том же месте в течение долгого времени (как в нашем случае), важно создать систему для поддержания зонд на интересующей области. Это было сделано с помощью ручной поддержки, чтобы держать зонд, и путем размещения немного ультразвукового геля на кончике зонда. Перед записью времени было проведено, чтобы стабилизировать зонда в контакт с опухолью. После того, как позиция была обеспечена, был только минимальный движение из-за дыхания мыши. Лазер был включен в записи 3 изображений каждые 30 сек в течение 20 мин, чтобы обнаружить присутствие капиллярной утечки. Это был выключен между каждой съемкой для снижения контрастного вещества отбеливание.
- В нашем эксперименте мышей умерщвляли в конце процедуры для гистологического анализа опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя данные, собранные, мы могли количественно анализировать различные параметры, отражающие микроциркуляцию.
Мы учились в естественных условиях периферических сосудов сеть опухоли толстой кишки, имплантированного в BALB-C-мышей с использованием расслаивается конфокальной флуоресцентной системы видеомикроскопии (Cellvizio, Maunakea Технологии, Париж, Франция 2), после инъекции макромолекулярным флуоресцентного контрастного вещества флуоресцеинизотиоцианатом-декстрана ( FITC-декстран) с молекулярной массой 70 кДа (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Франция) и с возбуждения и излучения длин волн 488 нм и 520 нм соответственно (для совместимости с нашей системы формирования изображения).
Первый шаг в нашем эксперименте было записать 5 сек фильмы в каждом из четырех секторов опухоли визуализировать капиллярную сеть. Это позволило репрезентативная выборка из васкуляризации опухоли. Все фильмы были обработаны с помощью программного обеспечения (ImageCell, Мауна-Кеа Технологии, Париж Франция) выполнения автоматизированной сегментации сосудов на изображениях вокруг выбранного диаметра (10 мкм в нашем случае, в которую входили суда, начиная от 5-20 мкм в диаметре). Таким образом, можно количественно оценить "функциональной плотности капилляров '(FCD), который является соотношение между общей площадью сосуда и общей площади изображения. Этот параметр был суррогатный маркер плотности микрососудов, как правило, измеряется с помощью средства патологии. Рисунок 1 иллюстрирует пример типа и изображений, полученных в результате сегментации сосуда. В этом примере FCD измеряли, как 36%.
Затем три изображения были записаны каждые 30 сек в течение 20 мин, чтобы обнаружить присутствие капиллярной утечки. Визуальный осмотр изображений была впервые исполнена, чтобы оценить наличие или отсутствие контрастного агента утечки в интерстиции, а также его пространственного распределения (гомогенной или гетерогенной).
Мы обратили три области междунар erest (ROI) в капиллярах и три ROI в интерстиции в моменты времени 0, 5, 10 и 20 мин. Интенсивности сигналов (SI) в течение трех различных капилляров и смежных промежуточных щелевых участков были усреднены в каждый момент времени. Утечки Индекс (%) рассчитывают следующим образом = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] х 100/3, где Ip является периваскулярный (или интерстициальный) интенсивность и Ii является внутрисосудистого интенсивность 5 -7. Рисунок 2 показывает пример контрастного агента утечки в интерстиции. В этом примере, утечка индекс измеряли как 1,47.
Эта динамика техника оптических изображений с контрастным усилением позволяет в измерениях естественных условиях опухолевой микроциркуляции. Она отражает архитектуру сосудов опухоли по количественной капиллярную плотность и их функциональность путем количественного проницаемость капилляров.
г "/>
Рисунок 1. Слева:. Картина микрососудов в поверхностном слое опухоли правой: применение модуля обнаружения судна автоматически сегмента сосуды диаметром от 5-20 мкм (диаметр интерес: 10 мкм). В Географическая сосуды выделены фиолетовым цветом.
Рисунок 2. Утечка из капилляров в интерстиций в различные моменты времени, соответственно T 0 (а), т 5 (б), т 10 (с) и т 20 (г). Суда (V) видны линейные структуры, как сигнал высокого уровня. Перед инъекцией (т 0), сигнал не видел в интерстиции (I). Постепенно улучшение можно увидеть в интерстиции из-за утечки флуоресцентного контрастного вещества через аномальной опухоль эндотелиального барьера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение опухоли микроциркуляции стало необходимым в понимании патофизиологии роста опухоли, распространения и реакции на лечение 1. Оптический изображений является одним из методов, которые могут быть использованы для наблюдения капилляры использованием флуоресцентного контрастное вещество и количественно морфологический (Functional капиллярной плотности) и функциональные (утечка индекс) параметры.
Флуоресцентной микроскопии изображений мы использовали в этом исследовании имеет свои преимущества и ограничения. Одним из преимуществ является возможность выбрать размер контрастного вещества используется. Здесь, с 70-кДа FITC-декстрана, утечки через эндотелиального барьера в начале эксперимента было минимальным, что позволило нам наблюдать начальную морфологию (извилистость, анархический сети, и т.д..) Сосудов с хорошим контрастом между сосудов и интерстиция 8, и после задержки, утечка контрастного вещества течение 20 минут наблюдения. В плоскости (ху) резолюция высокий (3,5 мкм), что позволило визуализировать сосуды и интерстиций на микроскопическом уровне, вместо того, чтобы макроскопическом уровне, как и в большинстве других методов визуализации (МРТ, КТ, УЗИ, ПЭТ ...). Наконец, это визуализация в реальном времени, что означает, что изменения можно наблюдать, как они происходят.
Однако существуют недостатки этого метода. Аппарат тонкий, чтобы работать. Действительно, зонд очень мала (1,8 мм) и скользкой, и трудно оставаться в том же месте на опухоль в течение длительных периодов времени. Дыхательные движения животного также компромисс устойчивость. Чтобы улучшить это, мы использовали ультразвуковое гель для иммобилизации зонда и ручной поддержку для поддержания зонда в положении. Кроме того, мы можем исследовать только поверхностные область опухоли (от 100 мкм до 170 мкм), что означает, что результаты, полученные касаться только наиболее поверхностные слои опухоли.
Основной предел, Howeveг, является трудность в достижении абсолютного количественного помощью оптических изображений. Утечки Индекс представляет собой отношение, и поэтому только полуколичественный параметр. Во-первых, есть артефакты, связанные с частичной voluming в ROI. Действительно, при том, что разрешение в плоскости высока, разрешение плоскости г низкий (толщина среза 70 мкм), что означает, что он включает в себя как сосуды и интерстиций. Таким образом, при измерении интенсивности сигнала в сосуде с диаметром 10 мкм, то в среднем с окружающей интерстиции, включенных в секцию. Кроме того, в оптических изображений, существует комплекс соотношение между интенсивностью сигнала и концентрацией контрастного вещества. Когда ткань освещена фотонов, многие события могут происходить одновременно и влияют на сигнал собраны. Существуют естественные хромофоры в тканях, которые могут поглощать возбуждения или выбросов фотоны, такие как гемоглобин или коллагена. Существует также ряд диффузии, который рассеивает фотоны в нескольких направлениях. Наконец, отбеливание, вероятно, одиниз самых важных вопросов при использовании FITC, потому что он вызывает потерю сигнала не зависит от концентрации. Несколько исследовательских групп работают над количественной оптический сигнал, но это подразумевает сложную modelization 9,10.
Наконец, продольные исследования не легко выполнить. Мы должны были надрезать кожу, чтобы выявить опухоль, чтобы приобрести изображения, и это может оказаться трудно закрыть разрез, особенно когда орган наблюдается глубоко в полости тела (например печени или почек).
В целом, мы разработали динамический флуоресценции с контрастным усилением технику оптических изображений количественно охарактеризовать капилляров анатомию и функцию, с помощью конфокальной флуоресцентной видеомикроскопии устройство. Этот метод требует дальнейшей проверки, но могут быть полезны для сравнения опухоли васкуляризации до и после терапии или между моделях опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
