Summary
在本文中,我们提出了一个使用动态对比增强荧光电视显微镜来分析肿瘤微血管体内的方法。购入两个量化参数:功能性毛细血管密度反映了肿瘤的血管,和索引泄漏反映内皮壁的泄漏。
Abstract
纤维状共聚焦荧光体内成像用的光纤束采用相同的原理荧光共聚焦显微镜观察。它可以在原位元件通过光纤激发荧光,然后通过同一根光纤记录一些所发射的光子。光源是发出的激发光通过光纤束中的元素和,因为它扫描过样品,通过再现像素的图像的像素的激光。作为该扫描是非常快的,通过将其与专用的图像处理软件相结合,图象实时地与12帧/秒的频率可以得到。
我们开发出一种技术来定量表征毛细血管的形态和功能,使用共焦荧光电视显微镜设备。在我们的实验中,第一步是要记录5秒的电影中的四个象限的肿瘤可视化的毛细血管网。所有影片均采用软件处理(我mageCell,莫纳克亚技术,法国巴黎),执行船舶自动分段围绕一个选定的直径(在我们的案例中10微米)。因此,我们可以量化的“功能性毛细血管密度”,它是总血管面积和图像的总面积之比。这个参数是一个替代指标微血管密度,通常采用病理工具测量。
第二个步骤是,记录肿瘤的电影在20分钟内通过毛细血管壁进入间质的量化的大分子造影剂的泄漏。通过测量间质比,在血管信号强度的比率,一个人指数泄漏“获得,作为一个替代指标毛细血管的通透性。
Introduction
血管生成是一个复杂的过程1,涉及从预先存在的血管形成新的血管。在组织的微循环的病理变化,小动脉,毛细血管和小静脉的组成,有牵连的大范围的疾病,例如癌症,炎症,或糖尿病。因此,必须发展的方法来定量评估微血管结构和功能。成像使微血管研究在非或微创方式,在实时和体内 ,并在相同的动物2随时间重复测量。
目前,动态对比增强(DCE)成像3通常被用来评估组织的微循环。动态对比增强成像是如下一段时间静脉注射示踪剂的生物分布的技术。从此次收购,定量参数可以提取反映组织血管。 DCE成像已最经常使用的CT,MRI或超声波。然而,这些成像技术不允许直接观看的微血管,因为它们的分辨率,比使用特定的实验设备等,最常见的仍然是宏观的。
在本文中,我们提出使用动态对比增强光学成像,与纤维状的共聚焦电视显微镜来研究肿瘤血管在微观尺度和体内 。我们使用的大分子造影剂(FITC-葡聚糖),其只保持容器或泄漏内通过内皮屏障进入间质,根据其分子量和组织的血管内皮细胞的特性研究4。这使研究既微血管结构,通过正确划定的船只,和毛细血管的通透性,通过泄漏和积聚在间质。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。造影剂的制备
- 为FITC-葡聚糖70kDa的,注入的剂量为500毫克/千克(10毫克的FITC-葡聚糖稀释在0.1ml生理盐水的小鼠重20克)。
- 该代理不应该过长暴露在光线下。为了避免漂白,建议用铝箔覆盖的管。
2。麻醉
- 小鼠通过腹膜内注射甲苯噻嗪的1:4的混合物的麻醉(Rompun 2%,拜耳,皮托,法国)和氯胺酮(氯胺酮500,维克,卡罗,法国),分别为66毫克/公斤和264毫克/公斤为20g的鼠标。
3。利息的器官的制备
- 我们剃光小鼠在感兴趣的位置(例如,通过皮下肿瘤)。动物毛往往是自发荧光,当白色。当黑色的,它吸收光线。
- 面对将要被成像的器官皮肤切开。它要等到流血是重要克已停止注入造影剂之前,否则会漏出血液中并污染图像。
4。获得
- 的造影剂或者通过颈静脉或尾静脉注入。没有或很少的背景信号中在不存在荧光对比剂所观察到的器官。
- 将探头放置在要成像的器官的前面。在我们的研究中,这是肿瘤。
- 激光被接通照亮肿瘤,看到了荧光的毛细管。
- 肿瘤是由移动探头在一个非常缓慢的运动,同时记录以可视化的毛细血管网手动探讨。重要的是要保持一个稳定的手是很重要的,而这种技术需要一点经验。在我们的研究中,这第一步允许功能性毛细血管密度的定量。
- 第二个步骤是动态采集随着时间的推移。在这项研究中,我们使用了70kDa的FITC-葡聚糖。没有间隙泄漏,在大多数正常器官但在肿瘤。要获得相同的位置随时间(如在我们的例子)的图像,建立一个系统,以保持探头在感兴趣的领域是很重要的。这是通过使用一个手工支撑以保持探头完成,并通过放置一个比特超声凝胶上的探针的尖端。录制前,时间都花在稳定探头置于与肿瘤接触。一旦该位置被固定,只有极少运动,由于鼠标的呼吸。激光被打开以记录3个图像,每隔30秒,20分钟,以检测毛细血管渗漏的存在。它被关闭的每个记录之间,以减少造影剂漂白。
- 在我们的实验中,处死小鼠,在过程结束时肿瘤的组织学分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过分析所收集的数据,我们可以定量分析不同的参数,反映微循环。
我们研究了体内的结肠肿瘤使用纤维状的共聚焦荧光电视显微镜系统(Cellvizio,Maunakea技术,巴黎,法国2),喷射的高分子荧光对比剂后异硫氰酸荧光素-葡聚糖(植入BALB-C小鼠的外周血管网FITC-葡聚糖)与70 kDa的(Sigma-Aldrich公司,圣康丁法拉维耶,法国)中,用488 nm和520 nm处分别激发和发射波长(对于我们的成像系统兼容)的分子量。
在我们的实验中,第一步是要记录5秒的电影中的四个象限的肿瘤的可视化的毛细血管网。肿瘤血管形成这让代表性抽样。所有的电影都使用软件(的ImageCell,冒处理KEA技术,法国巴黎)进行血管的自动分割在各地选定的直径(在我们的案例中10微米,其中包括船只,从5-20微米,直径)的影像。因此,我们可以量化的“功能性毛细血管密度”(FCD),它是总血管面积和图像的总面积之比。这个参数是微血管密度的替代标记,通常使用的工具病理学测定, 图1示出了所获得的图像的类型和容器分割的结果的一个例子。在这个例子中,FCD测定为36%。
然后,三个图像记录每30秒20分钟来检测毛细血管渗漏的存在。首先被执行的图像的视觉检查,以评估造影剂漏入间质,以及其空间分布(均匀或不均匀)不存在或存在。
我们制定的int三个地区 erest(投资回报率)在毛细血管和三个投资回报率在间质在时间点0,5,10和20分钟。的信号强度(SI)的三个不同的毛细血管和相邻的空隙区域内的平均值在每个时间点。索引泄漏(%)如下计算=Σ[(Ip1/Ii1)+(Ip2/Ii2)+(Ip3/Ii3)]×100/3,其中Ip是血管周围(或间质性)强度和Ii为血管内强度5 -7。 图2显示了在间质中的造影剂泄漏的例子。在这个例子中,索引泄漏测量为1.47。
这种动态对比增强光学成像技术可以在肿瘤微循环体内测量。它反映了肿瘤血管的由量化毛细血管通透性量化毛细血管密度,以及它们的功能架构。
G“/>
图1。左:在肿瘤的浅层微血管图片右:应用血管检测模块来自动分割血管直径从5-20微米(直径权益:10微米)。该分段船舶用紫色突出。
图2。泄漏从毛细血管向间质的不同时间点,分别吨0(a)中,T 5(b)所示,吨图10(c)和t 20(d)所示。容器(V)被看作是高信号线性结构。注射(叔0)之前,没有任何信号被认为是在间质(I)。逐步,增强可以在间质由于荧光对比剂通过异常肿瘤内皮屏障渗漏看到。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肿瘤微循环的研究已成为了解肿瘤的生长,传播和对治疗的反应1的病理生理必不可少的。光学成像是可用于使用荧光造影剂,观察毛细血管和量化形态(功能性毛细血管密度)和功能性(指数泄漏)的参数的技术之一。
我们在这项研究中所使用的荧光显微成像既有优点也有限制。一个优点是能够选择所使用的造影剂的大小。这里,具有70-kDa的FITC-葡聚糖,通过在实验开始时的内皮屏障渗漏是最小的,这使我们能够观察到血管的初始形态(曲折度,无政府网络等 )之间具有良好的对比度血管和间质08和后以一个延时过的观测20分钟造影剂的泄漏。在平面内(倍y)的分辨率高(3.5微米),这使得我们能够想象的,而不是一个宏观层面与大多数其他成像技术(MRI,CT,超声,PET ......)的血管和间质在微观层面,。最后,这是实时成像,这意味着可以改变所发生的被观察到。
但是,也有缺点,这种技术。该装置是细腻的操作。的确,探针是非常小的(1.8毫米)和滑且难以停留在对肿瘤相同的地方过长时间。动物的呼吸运动也影响稳定性。为了改善这一点,我们使用超声波胶来固定探头和一个手工制作的支持,保持探头位置。此外,我们可以探索肿瘤的唯一的浅表区域(从100微米到170微米),表示所获得的结果的关注的肿瘤只有最表面的层。
主要的限制,howeveR,是实现绝对定量使用光学成像的难度。索引泄漏是一个比值,因此只有一个半定量参数。首先,有由于在ROI局部voluming工件。事实上,虽然在面内分辨率高,z平面的分辨率低(为70微米的切片厚度),这意味着它包括血管和间质。因此,测定在用10微米直径的容器中的信号强度时,它被平均以包含在切片周围的间质组织。另外,在光学成像,有信号强度和造影剂浓度之间的复杂关系。当一个组织是由光子照射,可能会同时发生,并采集到的信号影响的许多事件。有在组织中,可吸收激发或发射光子,如血红蛋白或胶原蛋白的天然发色团。也有一些扩散而分散在几个方向的光子。最后,漂白大概是1使用FITC标记的时候,因为它诱导浓度无关信号丢失最重要的问题。几个研究小组正在研究量化的光信号,但是这意味着一个复杂的模型化9,10。
最后,纵向研究不容易。我们不得不切开皮肤显露肿瘤,以获得图像,它可能难以收上来的切口,特别是当观察到的器官就是深藏在体腔( 如肝或肾)。
总体而言,我们开发了一种动态对比增强荧光光学成像技术来定量地表征毛细管解剖结构和功能,使用共聚焦荧光电视显微镜设备。这种技术需要进一步的验证,但也可以用于比较治疗前后之间,或在肿瘤模型中的肿瘤血管化是有用的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003). - Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009). - Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005). - Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).