In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans
Summary
Med sin lille transparent legeme, veldokumenteret neuroanatomi og et væld af medgørlige genetiske teknikker og reagenser,<em> C. elegans</em> Gør en ideel model organisme for<em> In vivo</em> Neuronal billeddannelse ved hjælp af relativt enkle, billige teknikker. Her beskriver vi en enkelt neuron billeddannelse inden intakte voksne dyr ved hjælp af genetisk kodede fluorescerende calcium indikatorer.
Abstract
The nematode worm C. elegans er en ideel model organisme for relativt enkle, billige neuronal billeddannelse in vivo. Dens lille gennemsigtig krop og enkle, velkarakteriseret nervesystem tillader identifikation og fluorescensimagografi af enhver neuron i det intakte dyr. Enkle immobiliseringsteknikker med minimal indvirkning på dyrets fysiologi giver udvidet time-lapse imaging. Udviklingen af genetisk kodede calciumfølsomme fluoroforer såsom Cameleon 1 og GCaMP 2 tillader in vivo billeddannelse af neuronal calcium om både celle fysiologi og neuronal aktivitet. Talrige transgene stammer, der udtrykker disse fluoroforer i specifikke neuroner er let tilgængelige eller kan konstrueres ved anvendelse velkendte teknikker. Her beskriver vi nærmere procedurer for måling af calcium dynamik inden for en enkelt neuron in vivo ved hjælp af både GCaMP og Cameleon. Vi diskuterer fordele og disadvantalder såvel såvel som forskellige fremgangsmåder til prøvefremstilling (animalsk immobilisering) og billedanalyse. Endelig præsenterer vi resultater fra to forsøg: 1) Anvendelse GCaMP at måle sensoriske reaktion af en bestemt neuron til et eksternt elektrisk felt og 2) Brug Cameleon at måle den fysiologiske calciumrespons af en neuron for traumatisk laser skader. Calcium billeddiagnostiske teknikker som disse er udbredt i C. elegans og er blevet udvidet til at omfatte målinger i frit bevægelige dyr, flere neuroner samtidigt og sammenligning på tværs af genetiske baggrunde. C. elegans præsenterer en robust og fleksibelt system til in vivo neuronal billeddannelse med fordele frem for andre modelsystemer i teknisk enkelhed og omkostninger.
Introduction
Her præsenterer vi praktiske metoder til in vivo calcium billeddannelse i C. elegans neuroner. Udviklingen af genetisk kodede calcium-følsomme fluoroforer med højt signal-støjforhold gør C. elegans en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv system til måling af neurofysiologi og aktivitet. Vores billeddannelse sker med et standard sammensat mikroskop med bred felt fluorescensimagografi af almindeligt tilgængelige fluorophorer. Vi præsenterer flere teknikker anvender forskellige fluoroforer og forskellige sample præparater, diskuterer styrker og svagheder ved hver. Data så præsenteret fra to eksempler eksperimenter. En fremragende supplerende ressource på teknikkerne beskrevet her, kan findes i WormBook, "Imaging aktiviteten af neuroner og muskler" af R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
To store klasser af genetisktisk kodede fluorescerende calcium reportere er almindeligt anvendt i C. elegans: enkelt kanal GCaMP og FRET-baserede Cameleon. Vi vil beskrive metoder og vise eksempler på data genereret af hver.
GCaMP er baseret på en modificeret grønt fluorescerende protein (GFP), der er følsom over for det omgivende calciumkoncentration. Dette opnås ved fusion af GFP og den høje calcium affinitet protein calmodulin, således at bindingen af calcium fra calmodulin bringer GFP molekylet i en effektiv fluorescerende bekræftelse 2. Den nylige fremskridt i disse fluorophorer genererer exceptionel signal størrelse med op til 500% stigning i fluorescensintensiteten over et fysiologisk område af calcium og rimeligt hurtig kinetik for ~ 95 msek stigetid og ~ 650 msek henfaldstid 4. Over relativt korte perioder (minutter), kan disse store signaler giver mulighed for lavere opløsning billeddannelse (lavere forstørrelse), og da en artig initial basismåling, ophæve behovet for kontinuerlig baseline eller sammenlignende målinger.
Cameleon har den fordel, at et FRET-baseret fluorophor, der genererer en ratiometrisk måling sammenligning af to uafhængige kanaler eller bølgelængder 1. Den består af to separate fluoroforer (cyan-og gul-emitterende fluorescerende proteiner, CFP og YFP) forbundet af en calmodulin-protein. Komplekset belyses med blåt lys (440 nm), der ophidser den fælles fiskeripolitik. Binding af calcium fører fluoroforer tættere på hinanden, hvilket øger fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) fra CFP (donor) til YFP (acceptor) og forårsager CFP emission (480 nm) at falde, og YFP emission (535 nm) for at øge . Relative niveauer af calcium måles som forholdet mellem den YFP / CFP intensitet. Cameleon kinetikken er langsommere end GCaMP, målt in vivo til at have en stigetid på ~ 1 sekund og en henfaldstid på ~ 3 sek 5. Imidlertidforholdet mellem modsat bevægelige signaler forøger signalet størrelse og kompenserer for en række mulige artefakter som følge af ændringer i fluorophor koncentration, bevægelse eller fokus drift og blegning.
Genetisk kodede fluorescerende reportere ophæver meget af prøven nødvendige forberedelser med exogent administrerede sonder og C. elegans lille gennemsigtig krop giver billeddannelse i det intakte dyr ved hjælp af simple bredt felt fluorescens. Den største tekniske udfordring i prøveforberedelse er derfor for sikkert at immobilisere dyrene. Der findes en række forskellige almindeligt anvendte teknikker hver med fordele og ulemper. Anvendelse af et farmakologisk middel til at lamme dyrene er let at gennemføre og tillader montering af flere dyr på et præparat (Levamisol, en cholinerg agonist, der forårsager muskelvæv at gribe anvendes typisk 6). C. elegans kan også fysisk immobiliseres ved at montere dempå stiv 10% agarose 7, 8. Dette minimerer indvirkning på dyrs fysiologi, tillader langsigtet imaging (timer) og inddrivelse af flere dyr, men er mere teknisk vanskeligt. Begge disse teknikker begrænser fysisk adgang til dyr (som er under et dækglas) og kan derfor kun anvendes sammen med visse eksperimentelle stimuli (såsom lys, temperatur, elektrisk felt eller laser beskadigelse). For stimuli hvor fysisk adgang er påkrævet, såsom berøring eller administration af kemikalier, har mange studier med succes limet C. elegans på plads (ved hjælp af veterinære klasse lim) 9. Dette er teknisk mere udfordrende, er et enkelt dyr forberedelse og tillader ikke dyr opsving. Endelig har adskillige mikrofluidenheder været ansat som fysisk begrænse C. elegans, kan bevare dyrs fysiologi, så udsættelse for de fleste typer af stimuli (afhængigt af enhedens design) og muliggøre hurtig udveksling og nyttiggørelse af dyrene <sup> 10, 11. Men MicroFluidics kræver yderligere tekniske færdigheder og evner inden for design, fremstilling og implementering. I immobiliserede dyr aktivitet og stimulus respons kan generelt måles i sensorisk og interneuroner. Aktivitet af motorneuroner kræver mere sofistikerede teknikker til billeddannelse i bevægelse dyr. Her vil vi præsentere detaljerede fremgangsmåder, der anvender de to mest enkle teknikker til farmakologisk paralyzation og immobilisering med stiv agarose.
Fremgangsmåderne præsenteres her kan anvendes til at måle neuronal aktivitet og cellefysiologi i C. elegans. Vi giver et eksempel på hver: hjælp GCaMP at måle den sensoriske respons ASJ neuron til en ekstern elektrisk felt, og ved hjælp Cameleon at måle den fysiologiske calcium respons på laser beskadigelse af en neuron. Disse eksempler viser fordelene og ulemperne ved de to typer af fluoroforer og illustrerer, hvad der er muligt med systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisk kodede calcium indikatorer er blevet almindeligt anvendt i C. elegans neurobiologi. Adskillige grupper har anvendt disse teknikker til at studere reaktion af primære sensoriske neuroner på eksterne stimuli som vist her med ASJ reaktion på et elektrisk felt. Fremtrædende eksempler indbefatter fornemmelse af mekanisk kontakt, særlige kemikalier, temperatur og et elektrisk felt 12, 16-19. Aktivitet af interneuron og muskelceller er også overvåges både som respons på stimuli og på kont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adskillige mennesker har bidraget til arbejdet beskrevet i dette dokument. CVG byggede forsøgsopstillingen, og LS, SHC, og CVG udførte forsøgene. CVG og SHC skrev manuskriptet. Alle forfatterne efterfølgende deltog i revisionsprocessen og godkendt den endelige kopi af manuskriptet. Vi takker Paul Sternberg for GCaMP stamme. Nogle nematode stammer anvendt i dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansieret af NIH National Center for Forskning Ressourcer (NCRR). Det MATLAB billedanalyse programmet blev tilpasset fra den, der anvendes i 18 år. Forfatterne blev støttet af Boston University og Massachusetts Life Sciences Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
