Summary

C生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

Published: April 10, 2013
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Summary

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、<em> Cエレガンス</em>のための理想的なモデル生物を作る<em生体内で></em比較的シンプルで低コストな技術を使用して>神経イメージング。ここでは、遺伝的にコードされた蛍光カルシウムインジケーターを使用してそのまま成体内の単一ニューロン画像法を説明します。

Abstract

線虫C. elegansは、in vivoで比較的簡単、低コスト神経イメージングのための理想的なモデル生物である。その小さな透明なボディとシンプルな、よく特徴付けられた神経系が無傷動物内の任意のニューロンの同定および蛍光イメージングを可能にします。動物の生理機能への影響を最小限に抑えてシンプルな固定化技術は、拡張タイムラプスイメージングを可能にする。そのようなカメレオン1とGCaMP 2として遺伝的にコード化されたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、細胞生理学と神経活動の両方に関係する神経細胞のカルシウムのin vivoイメージングが可能です。特定のニューロンにこれら蛍光体を発現している多数のトランスジェニック系統は、容易に入手可能であるか、十分に確立された技術を用いて構築することができる。ここでは、GCaMPとカメレオンの両方を使用して、in vivoでの単一ニューロン内のカルシウム動態を測定するための詳細な手順について説明します。我々は、利点とdisadvantを議論両方の年齢だけでなく、試料調製(動物固定化)と画像解析の様々な方法。外傷性のレーザー損傷にニューロンの生理的カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用した外部電場と2に特有のニューロンの感覚反応)を測定するGCaMPを使用した:1)最後に、我々は2つ​​の実験の結果を提示する。これらのようなカルシウムイメージング技術は、C 広く使用されていますエレガンスとは、遺伝的背景を越えて自由に移動する動物は、同時に複数のニューロンと比較して、測定値に拡張されました。Cでelegansは技術的シンプルさとコストで他のモデルシステムを超える利点を用い in vivo神経イメージングための堅牢で柔軟なシステムを提示する。

Introduction

ここでは、C生体内カルシウムイメージングための実用的な方法を提示する線虫の神経細胞。高い信号対雑音比を持つ遺伝的にコードされたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、Cを作る神経生理学および活性の測定のために比較的簡単で費用対効果の高いシステムをエレガンス 。当社のイメージングは​​、一般的に利用可能な蛍光団の広視野蛍光イメージングを用いた標準的な複式顕微鏡を使って行われます。我々は、それぞれの長所と短所を議論し、様々なフルオロフォアおよび異なる試料調製を採用するいくつかのテクニックを紹介します。その後、データは2つの例の実験から示されている。ここに記載されている技術上の優れた追加のリソースがWormBook "イメージング神経細胞や筋肉の活性" R. Kerrによる、(記載されていますhttp://www.wormbook.org )3。

genetiの2つの主要なクラス的にエンコードされた蛍光カルシウム記者は、一般的にC言語で使用されているエレガンス :単一チャネルのGCaMPとFRETベースのカメレオン。我々は方法を説明し、それぞれによって生成されるデータの例を示します。

GCaMPは、周囲のカルシウム濃度に敏感で修正された緑色蛍光タンパク質(GFP)に基づいています。これは、カルモジュリンによるカルシウムの結合が効率蛍光確認2にGFP分子をもたらすように、GFPの融合と高カルシウム親和性タンパク質カルモジュリンによって達成される。これらのフルオロフォアの最近の進歩は、カルシウム濃度の生理的範囲と合理的に高速〜95ミリ秒の立ち上がり時間の動態および〜650ミリ秒の減衰時間が4以上の蛍光強度の最大500%増加と優れた信号の大きさを生成します。比較的短い期間(分)をかけて、これらの大規模な信号は低解像度のイメージングを可能にする(低倍率)と、行儀のinitが与えられたことができますIALベースライン測定、連続ラインまたは比較測定の必要性を否定する。

カメレオンは、2つの独立したチャンネルまたは波長1を比較するレシオメトリック測定を生成FRETベースの蛍光団であるという利点があります。それはカルモジュリンタンパクによって連結された2つの別々の蛍光色素分子(水色と黄色発光蛍光タンパク質、CFPとYFP)で構成されています。錯体は、CFPを励起する青色光(440 nm)を照射する。カルシウムの結合はYFP(アクセプター)へCFP(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を増加させるとCFPの発光(480 nm)は減少とYFP発光(535 nm)を増加させることを引き起こして、より緊密フルオロフォアをもたらし。相対的なカルシウムレベルがYFP / CFP強度の比として測定されます。カメレオン動態は〜1秒、3秒〜5の減衰時間の立ち上がり時間を持つようにインビボで測定GCaMPのそれよりも遅いです。しかし、逆に信号を移動の比率は、信号の大きさを増大させ、蛍光物質濃度、動きやフォーカスドリフトと漂白の変化による可能アーティファクトの数を補正します。

遺伝的にコードされた蛍光レポーターは、外因的に投与されたプローブとCで必要な試料調製の大半を否定elegansの小さな透明の本体はシンプルな広視野蛍光を用いて無傷動物内の撮像を可能にします。試料調製における主要な技術的課題は、安全に動物を固定することである。それぞれの長所と短所とは異なる一般的に使用される技術が数多くあります。動物を麻痺させる薬剤を使用することで、実装が容易であり、1つの準備(レバミゾール、つかむために筋肉組織を引き起こしコリン作動薬は一般的に6を使用されている)上に複数の動物の取付けができます。Cで虫も、物理的マウントすることによって、固定化することができる堅い10パーセントアガロース7,8で。動物生理学上の影響を最小限に抑えることは、長期的なイメージング(時間)と、複数の動物の回復が可能になりますが、より技術的に困難である。これらの手法の両方は、動物への物理的アクセスを制限(カバースリップの下にある)、したがって、唯一の特定の実験刺激(光、温度、電界やレーザー損傷など)で使用することができます。そのような化学物質のタッチや管理などの物理的なアクセスが必要な刺激は、多くの研究では、正常にCをくぎ付けにしている代わりに (獣医グレード接着剤を使用して)9。これは技術的に困難である、単一の動物の準備であり、動物の回復を許可していません。最後に、多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を抑えることが採用されてきた 、動物の生理機能を維持する刺激のほとんどのタイプ(装置設計に依存します)への暴露を可能と動物の迅速な交換とリカバリを有効にすることができます<sup> 10、11。しかしマイクロフルイディクスは、設計、製造、実装に追加の技術的なスキルや能力を必要とします。固定化された動物では、アクティビティと刺激応答は一般的感覚と介在ニューロンで測定することができます。運動ニューロンの活動は、移動動物におけるイメージングのための、より高度な技術を必要とします。ここでは、薬理学的な麻痺と硬いアガロースと固定化の二つの最も簡単な手法を採用する詳細な方法を紹介します。

ここで紹介する方法はCの神経活性および細胞生理機能を測定するために用いることができるエレガンス 。我々は、それぞれの例を参考にしてください外部電場にASJニューロンの感覚応答を測定するGCaMP使用しており、ニューロンのレーザー損傷に対する生理カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用しています。これらの例は、蛍光色素分子の2つのタイプの利点と欠点を示しており、システムで可能なことを示しています。

Protocol

1。光学装置落射蛍光イメージング機能を備えた標準的な複式顕微鏡を使用しています。我々はIntensilight HGイルミとニコンの​​EclipseのTi-U倒立顕微鏡を使用しています。 最高の画像と信号の品質確保のため、高倍率、高開口数の対物レンズを使用しています。我々は通常、ニコンX60 1.4のNA油浸対物レンズを使用しています。いくつかのケースでは、蛍光体の発現レベルと信号?…

Representative Results

ここでは、2つの独立した実験の結果を提示する。最初は蛍光カルシウム記者が光学的に無傷での神経活動を監視するために使用できる方法の良い例を与えて、定義された外部の刺激に対して特定の感覚ニューロンの応答を測定することがGCaMP採用エレガンス 。第二は、カメレオンが一時的細胞内カルシウムは、このようにカルシウムの生理機能が生体内での単一セル内で…

Discussion

遺伝的にコードされたカルシウム指示薬は広く、Cで利用されてきたelegansの神経生物学。多数のグループが電界にASJ応答でここで示すよう外部刺激に対する一次感覚ニューロンの応答を研究するために、これらの技術を採用してきた。顕著な例は、機械的なタッチの感覚、特定の化学物質、温度、電界12、16から19が含まれいます。介在ニューロンと筋細胞の活?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

何人かの人は、このホワイト·ペーパーで説明された仕事に貢献した。 CVGは、実験装置を構築し、LS、SHC、とCVGは、実験を行った。 CVGおよびSHCは原稿を書いている。すべての著者は、その後改訂プロセスに参加し、原稿の最後のコピーを承認した。我々はGCaMP株についてポールスタンバーグに感謝します。この作業で使用されるいくつかの線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター(NCRR)によって運営されている線虫遺伝学センター(CGC)から提供された。 MATLABの画像解析プログラムを18で使われているから脚色したものです。著者はボストン大学、マサチューセッツ工科大学ライフサイエンスセンターではサポートされていた。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope
Nikon    
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon    
Optical table or 3’X3′ optical
grade breadboard
Thor Labs   If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology
  High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.
41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass
Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass
Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer      
Levamisole Sigma    
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter
polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg)
Sternberg Lab Strain PS6388  
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60
Gabel Lab Strain CG1B  

References

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Cite This Article
Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

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