In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Summary

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e reagenti,

Abstract

Il verme nematode C. elegans è un organismo modello ideale per relativamente semplice, a basso costo di imaging neuronale in vivo. Suo piccolo corpo trasparente e semplice, ben caratterizzato sistema nervoso consente l'identificazione e l'imaging di fluorescenza di ogni neurone all'interno dell'animale intatto. Tecniche di immobilizzazione semplici con un impatto minimo sulla fisiologia dell'animale consentono esteso time-lapse imaging. Lo sviluppo di geneticamente codificati fluorofori calcio sensibili come cameleon ¹ e ² permettono GCaMP immagini in vivo di calcio neuronale relative sia fisiologia cellulare e l'attività neuronale. Numerosi ceppi transgenici che esprimono questi fluorofori in neuroni specifici sono prontamente disponibili o possono essere costruiti utilizzando tecniche ben consolidate. Qui si descrivono le modalità dettagliate per la misura della dinamica del calcio all'interno di un singolo neurone in vivo usando sia GCaMP e cameleon. Discutiamo vantaggi e disadvantetà di entrambi, nonché vari metodi di preparazione del campione (immobilizzazione animale) e analisi di immagine. Infine, vengono presentati i risultati di due esperimenti: 1) Uso GCaMP per misurare la risposta sensoriale di un neurone specifico ad un campo elettrico esterno e 2) Uso cameleon misurare la risposta fisiologica di calcio di un neurone laser a danni traumatici. Tecniche di imaging di calcio come questi sono ampiamente utilizzati in C. elegans e sono stati estesi alle misure in animali liberi di muoversi, i neuroni contemporaneamente e confronto tra background genetico. C. elegans presenta un sistema robusto e flessibile per imaging in vivo neuronale con vantaggi rispetto ad altri sistemi modello semplicità tecnica e costo.

Introduction

Qui vi presentiamo metodi pratici per imaging in vivo di calcio in C. elegans neuroni. Lo sviluppo di geneticamente codificati calcio-sensibili fluorofori con elevato rapporto segnale-rumore rende C. elegans un sistema relativamente semplice e conveniente per la misurazione di neurofisiologia e di attività. La nostra immagine è fatta con un microscopio standard con largo campo imaging di fluorescenza dei fluorofori comunemente disponibili. Vi presentiamo diverse tecniche che impiegano fluorofori diversi e preparati di campionamento diverse, discutendo i punti di forza e di debolezza di ciascuno. I dati vengono quindi presentato da due esperimenti di esempio. Una risorsa eccellente aggiuntiva sulle tecniche descritte qui possono essere trovati in WormBook, "Imaging l'attività dei neuroni e dei muscoli" di R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Due classi principali di geneticamenteautomaticamente codificati reporter calcio fluorescenti sono comunemente usati in C. elegans: GCaMP singolo canale e FRET-based cameleon. Noi descrivere i metodi e mostrare esempi di dati generati da ciascuna.

GCaMP si basa su una modifica proteina fluorescente verde (GFP), che è sensibile alla concentrazione di calcio circostante. Questo viene realizzato per fusione GFP e la elevata affinità calmodulina calcio proteina, in modo tale che il legame del calcio da calmodulina porta la molecola di GFP in una conferma efficiente fluorescente ^2. I recenti progressi in questi fluorofori generano dimensioni eccezionali del segnale fino a 500% di aumento di intensità di fluorescenza in un range fisiologico dei livelli di calcio e cinetica ragionevolmente veloci di ~ 95 msec tempo di salita e tempo di decadimento ~ 650 msec ^4. In periodi di tempo relativamente brevi (minuti), questi segnali di grandi dimensioni può consentire l'imaging risoluzione più bassa (inferiore ingrandimento) e, dato un bravo initmisurazione di riferimento ial, negare la necessità di base continuo o misurazioni comparative.

Cameleon ha il vantaggio di essere un FRET-based fluoroforo che genera una misurazione raziometrica confrontando due canali indipendenti o lunghezze d'onda ^1. Si compone di due fluorofori distinti (proteine ​​fluorescenti-ciano e giallo-emissione, CFP e YFP) collegati da una proteina calmodulina. Il complesso è illuminata con luce blu (440 nm) che eccita la PCP. Il legame di calcio porta i fluorofori più vicini, aumentando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) dal CFP (donatore) alla YFP (accettore) e causando l'emissione PCP (480 nm) per diminuire l'emissione e YFP (535 nm) per aumentare . Relativi livelli di calcio sono misurati come rapporto della YFP / CFP intensità. Cinetica Cameleon sono lento di quello di GCaMP, misurata in vivo per avere un tempo di salita di ~ 1 sec ed un tempo di decadimento di ~ 3 sec ^5. Tuttavia,il rapporto dei segnali contrapposti mobili aumenta la dimensione del segnale e compensa una serie di possibili artefatti dovuti ai cambiamenti nella concentrazione fluoroforo, movimento o deriva fuoco e candeggio.

Geneticamente codificati reporter fluorescenti negare gran parte della preparazione del campione richiesto con esogena sonde amministrati e C. elegans piccolo corpo trasparente permette l'imaging nel intatta di un animale con semplice fluorescenza ampio campo. La principale sfida tecnica nella preparazione del campione è quindi sicuro per immobilizzare gli animali. Ci sono un certo numero di differenti tecniche comunemente utilizzate ciascuno con vantaggi e svantaggi. Utilizzando un agente farmacologico di paralizzare gli animali è facile da implementare e permette il montaggio di animali multiple su una preparazione (Levamisole, un agonista colinergico che causa tessuto muscolare cogliere viene tipicamente usato ^6). C. elegans può anche essere fisicamente immobilizzato da montarliil rigida 10% agarosio ^{7, 8.} Questo impatto minimizza sulla fisiologia degli animali, consente a lungo termine di imaging (ore) e il recupero di animali di più, ma è tecnicamente più difficile. Entrambe queste tecniche limitare l'accesso fisico agli animali (che sono sotto un coprioggetto) e può quindi essere utilizzata solo con determinati stimoli sperimentali (come luce, temperatura, campo elettrico o danni laser). Per stimoli in cui è necessario l'accesso fisico, come il tatto o la somministrazione di prodotti chimici, molti studi hanno successo incollato C. elegans in atto (con colla veterinario grado) ^9. Questo è tecnicamente più impegnativo, è una preparazione singolo animale e non consente il recupero degli animali. Infine, numerosi dispositivi microfluidici sono stati impiegati che fisicamente trattenere C. elegans, preservando fisiologia animale, permettendo l'esposizione alla maggior parte di stimoli (a seconda del modello del dispositivo) e può permettere lo scambio rapido e recupero degli animali

I metodi presentati qui possono essere usati per misurare l'attività neuronale e fisiologia cellulare in C. elegans. Diamo un esempio di ciascuna: utilizzando GCaMP per misurare la risposta sensoriale del neurone ASJ ad un campo elettrico esterno, e utilizzando cameleon per misurare la risposta fisiologica di calcio al danno laser di un neurone. Questi esempi mostrano i vantaggi e gli inconvenienti dei due tipi di fluorofori e illustrare cosa è possibile con il sistema.

Protocol

1. Configurazione ottica

1. Utilizzare un microscopio standard composto con capacità di imaging epifluorescenza. Usiamo un Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertito con un illuminatore Intensilight HG.
2. Per una migliore immagine e la qualità del segnale utilizzare un alto ingrandimento, obiettivo di alta apertura numerica. Si utilizzano in genere un obiettivo Nikon X60 1,4 olio NA immersione. In alcuni casi è possibile usare più basso ingrandimento (X40, X20) a seconda del livello di espressione del fluoroforo e la forza del segnale.
3. Utilizzate una sensibilità elevata raffreddato CCD, come ad esempio una telecamera Andor Clara per massimizzare sensibilità delle immagini e ridurre al minimo il rumore di fondo.
4. Per fluorofori singolo colore usare il filtro standard a fluorescenza microscopio impostare progettato per la particolare lunghezza d'onda del fluoroforo. Per GCaMP utilizzare uno standard GFP filtro impostato ottimizzato per l'eccitazione a 488 nm ed emissione a 525 nm. Nessuna modifica ulteriore ottici sono necessari.
Figura 1. Si compone di:
1. Un filtro microscopio impostato con 440 ± 20 Eliminare filtro di eccitazione nm e 455 nm a lungo passare specchio dicroico.
2. Una maschera immagine inserita al piano dell'immagine iniziale immediatamente al di fuori del microscopio porto di imaging (in cui il sensore CCD di solito sedersi). Questo limita il campo di vista tale che riempirà solo metà del sensore della telecamera. Ponendo questa maschera i primi risultati piano dell'immagine in confini un'immagine nitida e nessuna sovrapposizione quando le due immagini sono proiettate side-by-side.
3. L'obiettivo primo relè impostare una lunghezza focale di distanza da tegli piano immagine iniziale tale che collima la luce.
4. Uno specchio dicroico, che divide la luce in due lunghezze d'onda di imaging separati o canali che riflettono un colore (> 515 nm, giallo) mentre l'altra trasmissione (<515 nm, ciano).
5. Filtri di emissione (filtri passa-banda) limitano ulteriormente la luce trasmessa alle lunghezze d'onda di imaging specifiche (ciano a 485 ± 40 nm e gialli a 535 ± 30 nm),
6. Le lenti secondo relè (uno per ogni canale) collocati nei percorsi ottici tali che riorienta la luce ad un secondo piano dell'immagine alla telecamera CCD.
7. Una coppia di specchi ed un secondo specchio dicroico dirige i percorsi ottici in modo tale che le due immagini ricombinati e sono proiettate side-by-side sul sensore CCD. Figura 4A illustra un esempio di immagine risultante.
5. Iniziale ottica Allineamento: consente di avviare la configurazione e l'allineamento delle ottiche con un imag alto contrastoe si utilizza un obiettivo a basso ingrandimento e trasmessi ad ampio campo di illuminazione della luce (un pennarello nero disegnato su un vetrino da microscopio funziona bene). Portare l'immagine a fuoco attraverso gli oculari microscopio e poi passato alla porta microscopio da utilizzare. Con illuminazione a luce alta visualizzare le immagini su una scheda in corrispondenza del piano focale iniziale (pochi cm al di fuori del porto microscopio). Posizionare la prima lente relay (C) nel percorso del fascio tale che è una distanza focale dal piano focale iniziale e collima la luce mentre non deviare il percorso del raggio (cioè è direttamente centrato nel percorso del fascio). Posizionare la maschera in primo piano focale, regolata per mezzo limitare il campo di vista e produrre un pensionante acuto nell'immagine. Posizionare gli specchi e filtri (D, E, G) tale che il percorso del fascio rimane parallela al piano del tavolo e viene eseguito in due percorsi paralleli side-by-side, come mostrato in figura 1B. Centro le lenti a relè secondo (F) nei loro rispettivi percorsi ottici espostarsi avanti e indietro lungo i percorsi di portare le immagini a concentrarsi su una scheda posta erano il sensore CCD sarà. Se fatto correttamente le due immagini devono essere parafocale con gli oculari del microscopio e le porte della fotocamera. Infine posizionare la fotocamera in posizione e mettere a punto l'allineamento.
6. Regolazione allineamento ottico di precisione: Utilizzare la doppia immagine vista dalla telecamera CCD per regolare l'allineamento ottico. Utilizzare un'immagine ad alto contrasto e iniziare con minore ingrandimento, il passaggio a un ingrandimento maggiore per l'allineamento finale. Posizionare l'immagine trasmessa (ciano canale in Figura 1B) per coprire una metà del campo visivo della telecamera di vista spostando la camera in posizione X e Y. l'immagine riflessa (canale giallo in Figura 1B) per coprire l'altra metà del campo di visualizzare regolando gli ultimi due specchi (G) nel suo percorso ottico. Ottimizzare fuoco muovendo la seconda lente relay per ogni canale avanti e indietro lungo il percorso del fascio. Se a sinistrainalterata la configurazione ottica devono essere stabili e richiedono solo rari regolazione fine tune.

2. Preparazione del campione e acquisizione dati.

1. Acquisire gli animali che esprimono un fluorocromo sensibile di calcio nel neurone di interesse da parte della Genetica Caenorhabditis Center (CGC) o da altre fonti. Alternativamente animali transgenici possono essere costruiti utilizzando standard C. elegans tecniche. Espressione singola cellula non è necessaria (e talvolta non auspicabile neuroni multiple devono essere studiati, vedi ¹²⁾ fintanto immagini e misurazioni da più celle possono essere facilmente separati. Se il transgene fluoroforo non è integrato nel genoma, variazione significativa dell'espressione può avvenire da un animale all'altro. In questo caso, la preselezione animali con livelli di espressione più alti usando un microscopio a fluorescenza dissezione aumenta il rapporto segnale-rumore e migliora le misurazioni. Fluoroforo livelli di espressione need essere sufficiente per essere prontamente ripreso con la telecamera sotto i parametri di acquisizione richiesti dall'esperimento.
2. Rendere le pastiglie agarosio richiesti per la tecnica di immobilizzazione desiderata (vedere 2.3) premendo una piccola goccia di agarosio fuso tra due lastre di vetro distanziate da due pezzi di nastro laboratorio. Se necessario, pastiglie agarosio possono essere trasferiti ad un vetrino di vetro prima di montare gli animali. Vedere la Figura 2.
3. Immobilizzare C. elegans per imaging utilizzando una delle seguenti tecniche:
   1. Paralisi farmacologica: Aggiungi il 0,05% al ​​2% Levamisole pad agarosio (mescolandolo nel agarosio fuso prima di prendere le pastiglie al punto 2.2). Scegli animali 5-10 sul tampone e coprire con un vetrino coprioggetti. Applicare piccole quantità di miscela di cera di paraffina calda (50% e 50% vaselina) angoli del vetrino per tenerlo in posizione. Lasciare 5-10 minuti per il Levamisole abbia effetto e gli animali a become completamente immobile.
   2. Stiff agarosio Immobilizzazione: C. elegans può essere fisicamente immobilizzato utilizzando tamponi rigidi 10% agarosio e 0.05 micron di diametro nanoparticelle polistirolo. Rendere 10% agarosio pad (10% agarosio in tampone NGM in peso) come in 2,2. Aggiungere ~ 3 ml di soluzione di tallone (1:10 microsfere di polistirene in NGM in volume) al di sopra del platorello. Rapidamente, scegliere 5-10 C. elegans nella piscina di soluzione tallone sul pad e delicatamente coprire con un vetrino coprioggetti. Utilizzare cera fusa applicato angoli del vetrino per tenerlo in posizione. (Per ulteriori dettagli su questa tecnica vedi ⁷ così come un precedente articolo JoVE ⁸⁾
   3. Incollaggio: C. elegans può essere incollata utilizzando piccole quantità di adesivo di grado veterinaria applicato su un lato dell'animale.
   4. Dispositivi microfluidici: Numerosi dispositivi microfluidici sono stati progettati per contenere fisicamente C. elegans in atto per l'imaging.
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4. Posizionare il vetrino preparato sul microscopio e mettere a fuoco il neurone desiderato. Spesso è più facile trovare il C. elegans con forte illuminazione campo e basso ingrandimento. Poi il passaggio a elevato ingrandimento e di imaging di fluorescenza di trovare e mettere a fuoco il neurone specifico.
5. Stimolo: Se una risposta neuronale ad uno specifico stimolo è desiderato (luce, campo elettrico, spunti gustative e olfattive, temperatura, ecc), l'apparato stimolo deve essere progettato nella configurazione microscopio, tale che può essere somministrato agli animali nella preparazione del campione mentre imaging.
6. Acquisire immagini utilizzando la fotocamera CCD microscopio. Tempi di esposizione e la luce di eccitazione livello dipende dal segnale di base e il livello di espressione del fluoroforo, con segnali più deboli che richiedono tempi di esposizione più lunghi con risoluzione temporale concordantly meno. Si utilizzano in genere ~ 300 msec tempi di esposizione.
7. Acquisire le immagini singolarmente o come tiMi film accelerato. Perché C. elegans neuroni mostrano generalmente dinamiche lente di attivazione (cioè non hanno potenziali d'azione a base di sodio), frame rate relativamente lenti ~ 1 sec sono spesso sufficienti per misurare la dinamica dei neuroni. Velocità di acquisizione fino a ~ 90 fotogrammi al secondo sono stati utilizzati anche se questi possono essere limitati dal tempo di integrazione necessario per fluorescenza debole. Film individuali di un singolo neurone può facilmente estendere per alcuni minuti (min ~ 5-10) o più a lungo se il preparato è stabile immobilizzazione e il frame rate relativamente lento.

3. Analisi dei dati

1. Ci sono una serie di pacchetti di imaging diverse fluorescenti software disponibili con capacità di analisi dinamiche e raziometrico tra ImageJ e NIS-Elements. Usiamo un semplice personalizzato programma MATLAB che misura la media del segnale fluorescente su una regione selezionata di interesse.
2. Per le singole immagini (o filmati time-lapse che restanoperfettamente immobile) selezionare una regione di interesse (ROI) all'interno del neurone con immagini e una regione separato nelle vicinanze per la misurazione del fondo. Per le immagini raziometrici selezionare ROI simile e regioni sfondo per ciascuna delle doppie immagini.
3. Leggero movimento del neurone con immagini in un time-lapse filmato richiede ulteriori analisi per selezionare automaticamente il ROI in ogni fotogramma, che può essere realizzato utilizzando numerosi sistemi di monitoraggio degli oggetti. Il programma visualizza una immagine compressa di tutte le immagini del film, da cui un confine ruvida (che comprende l'oggetto di interessi in tutti i fotogrammi) è selezionate manualmente e una regione autonoma sfondo selezionato. Per il primo fotogramma, un ROI viene selezionato manualmente all'interno della regione di confine. Per ogni frame successivo, il programma seleziona i pixel più luminosi dall'interno della zona di confine per generare un ROI della dimensione corretta (cioè lo stesso numero di pixel del ROI manuale primo fotogramma). Per le immagini in cui l'obiettivot di interesse è sufficientemente luminoso poi lo sfondo circostante all'interno della regione di confine questo protocollo seleziona un ROI ragionevole per ogni fotogramma.
4. Il segnale fluorescente, F, per ogni frame viene calcolato come media delle intensità dei pixel nella ROI meno l'intensità media della regione di sfondo. Valori raziometrici sono calcolati come rapporto tra i due segnali (YFP-YFP _sfondo) / (CFP _CFP-sfondo) -0,65. Il fattore di 0,65 compensa spurgo attraverso il canale PCP nel canale YFP, che dipenderà fluorofori così come l'insieme particolare filtro utilizzato (questo valore è tipicamente ~ 0,6 per configurazioni cameleon).
5. Il livello di calcio relativo per ciascun frame viene calcolato come variazione percentuale di intensità normalizzata ad un valore basale iniziale misurato dal primo fotogramma (o serie di fotogrammi): Af / F = (F (t)-F _o) / F _o, dove F (t) è la fluorescenza al tempo t e F _oè il valore di riferimento iniziale.
6. Un ROI selezionando corpo cellulare genera i segnali più forti più robusti, ma è anche possibile selezionare e misurare segnali da un ROI lungo i processi nervosi.

4. Risoluzione di problemi

1. Sbiancamento: L'esposizione alla luce di eccitazione può causare il deterioramento del fluoroforo ed è caratterizzato da una diminuzione costante del segnale che dipende dai livelli di esposizione. Misurazioni raziometriche aiuto per compensare questo. Tuttavia selettiva sbiancamento di una lunghezza d'onda possono ancora verificarsi (tipicamente candeggianti PCP più veloce poi YFP). Se si verifica lo sbiancamento ridurre il livello di esposizione di luce, riducendo i tempi di esposizione e / o intensità di eccitazione (con filtri a densità neutra nella via di illuminazione). Se necessario, si può compensare sbianca eseguendo finti processi (con l'esposizione di eccitazione stessa ma nessuno stimolo neuronale) e quantificare la costante di tempo di decadimento del segnale.
2. C.. elegans rispondere alla esposizione alla luce e stimoli sperimentali, che li rende più probabile di muoversi al momento della registrazione. Leggero movimento può introdurre rumore significativo nella misurazione soprattutto quando si misura dai processi di assoni. Analisi Raziometrico aiuta a mitigare questi effetti in qualche misura e le misure dal corpo cellulare sono più robusti. Attenta esecuzione e la raffinatezza delle procedure di immobilizzazione comporta completamente immobile animali.
3. Sfondo di selezione: L'attenta selezione di una regione di fondo è necessario per l'analisi delle immagini di successo. Regioni sfondo deve essere ragionevolmente uniformi e più scura poi il neurone creata l'immagine. Deve essere sufficientemente rimosso per evitare luce diffusa (e quindi un segnale pickup) dal neurone imaged. Troviamo una regione uniforme 20-50 micron dal ROI funziona bene nella maggior parte dei casi.
4. Ottica raziometrici: Il corretto allineamento delle ottiche di imaging è fondamentale per la generazione di una chiara immagine doppia. Allegati microscopio commerciali per l'imaging raziometrico sono disponibili. Una tecnica alternativa è quella di utilizzare immagini in sequenza rapida con una ruota veloce filtro per passare rapidamente tra le lunghezze d'onda di emissione durante la registrazione di immagini separate per ciascuno.
5. Raziometrico Analisi: L'analisi qui descritto è una tecnica relativamente semplice che genera segnali stabili in virtù di media su un ROI. Si richiede un oggetto riconoscibile luminoso per selezionare il ROI. Analisi più sofisticate raziometrico è possibile far avvicinare e mappando le doppie immagini tali che il rapporto fluorescente può essere calcolata pixel per pixel.

Representative Results

Qui vi presentiamo i risultati di due esperimenti separati. Il primo impiega GCaMP misurare la risposta di un neurone specifico a uno stimolo sensoriale definito esterno, dando un buon esempio di come reporter di calcio fluorescenti può essere utilizzato per monitorare l'attività neuronale in otticamente intatta C. elegans. Il secondo impiega cameleon misurare il calcio intracellulare transiente attivato entro un neurone in risposta al danno laser specifico, illustrando così come fisiologia calcio può essere misurata in una singola cellula in vivo. Per mettere a fuoco gli aspetti tecnici di ogni misurazione dei risultati di prova individuali sono presentati e discussi in dettaglio. Spesso la risposta media nel tempo (calcolato come la risposta media ad ogni tempo rispetto allo stimolo) o un parametro specifico (come l'ampiezza media della risposta) sono calcolati attraverso numerose prove. Tipicamente 10-20 prove sono necessarie per generare una misura accettabile media ma tsuo numero dipenderà in variabilità intrinseca della risposta. Tale analisi dei dati per gli esperimenti qui discusse possono essere trovati in ¹² e ^13.

Misurazione GCaMP della risposta sensoriale: Quando sono sottoposti a un forte campo elettrico esterno (≥ 3 V / cm), C. elegans attivamente strisciare verso il polo negativo del campo con precisione movimento diretto. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo comportamento electrotactic è mediato principalmente dai neuroni a destra ea sinistra, ASJ amphid neuroni sensoriali situati nella testa dell'animale ^12. Per visualizzare questa risposta abbiamo utilizzato un ceppo transgenico che esprime GCaMP3 in particolare nei neuroni destro e sinistro ASJ sotto il promotore-9 gpa. Abbiamo immobilizzato animali per l'imaging con tamponi agarosio contenenti 0,05% Levamisole sandwich tra due vetrini (come descritto nelle procedure). Lo stimolo elettrico è stato somministrato utilizzando una camera di imaging personalizzato costruito che si adatta alfase di un microscopio invertito Nikon Ti (v. ^12). In breve, la preparazione vetrino è collocato (con il lato verme basso) sopra un foro in una camera di plastica permette l'accesso per gli obiettivi da sotto e standard di imaging attraverso il vetrino. La camera è stata riempita con 0,25 mM NaCl e 50 mM di tampone di glicerolo e lo stimolo campo elettrico applicato utilizzando due elettrodi di platino lungo le estremità della camera. Come descritto sopra, un singolo neurone ASJ esprimere CGaMP è stato ripreso con un obiettivo 1,4 X100 olio NA immersione e standard GFP set di filtri. Un time-lapse film è stato acquistato per 80 sec (1 frame / sec, 300 msec tempo di esposizione), mentre sottoporre l'animale a un monitor esterno 3 V / cm FIELD elettrico per tre studi distinti ciascuno della durata di 10 sec (Figura 3). Abbiamo misurato l'intensità di fluorescenza a corpo cellulare utilizzando l'analisi dell'immagine sopra descritto. Il video mostra lievi difetti di movimento e la deriva fuoco nel corso dell'esperimento. La strength del segnale GCaMP resta vigorosa tuttavia mostra un grande aumento ~ 250% della fluorescenza in risposta sia al 1 ^° e 3 ^rd stimoli. Il risultato degli stimoli secondo è sostanzialmente ridotta dimostrando variabilità nella risposta neuronale. Lo sbiancamento è minima come è evidente dal ritorno ad un livello di base coerente.

Cameleon misurazione della fisiologia cellulare di calcio: Lesione traumatica cellulare provoca un calcio di grandi dimensioni transitorio all'interno di un neurone che svolge un ruolo fondamentale nel destino fisiologico dettare risposta cellulare (morte delle cellule cioè contro l'inizio dei processi di riparazione). Possiamo misurare il danno indotto la risposta in vivo, utilizzando un laser a femtosecondi a tagliare individuale C. elegans neuroni ¹⁴ mentre misurare simultaneamente segnali di calcio cellulari utilizzando cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Animali che esprimono cameleon YC3.60 nei sei neuroni mechanosensory (sotto lamec promotore-4), sono stati immobilizzati con 10% di agarosio e polistirene nanoparticelle come descritto nelle procedure. Abbiamo impiegato ottica di imaging doppi per registrare i segnali sia dal CFP e YFP canali di fluorescenza, come descritto nelle procedure. Abbiamo immaginato un singolo neurone e ALM laser mirato l'assone ~ 20 um dal corpo cellulare (Figura 4A). L'assone è stato interrotto da una breve (<1 sec), l'esposizione alla luce da un femtosecondo impulsi laser a raggi infrarossi focalizzato al punto di destinazione, lungo l'assone con l'obiettivo di imaging (vedi ¹³ per dettagli sulla chirurgia laser). Time-lapse immagini ad un fotogramma ogni 3 secondi, con 400 msec tempi di esposizione sono stati registrati per 320 secondi durante l'esecuzione di chirurgia laser e livelli di calcio calcolati usando l'analisi raziometrico.

Segnali sono stati misurati indipendentemente nel corpo cellulare (Figura 4B) e per il segmento assone entro 5 micron del punto di taglio (Figura 4C). Le figure mostrano sia la CIntensità FP e YFP nonché il risultante rapporto FRET. La misura al corpo cellulare si comporta bene con la PCP rapida diminuzione e l'aumento YFP in risposta al danno laser a t = 0 sec (freccia rossa). Ciò si traduce in un immediato aumento del 200% ~ nel segnale raziometrico (Af / F), che è mantenuta per ~ 90 secondi prima di ritornare ai livelli basali vicino. Lo sbiancamento è minima come è evidente dalla linea di fondo coerente.

Nel segmento assone vicino al punto di taglio, la quantità di fluoroforo locale varia nel corso dell'esperimento, complicando il segnale. La chirurgia laser taglia l'assone e rompe brevemente la membrana, permettendo fluoroforo a fuggire e che riduce temporaneamente la sua concentrazione citoplasmatica locale. Questo è evidente da una prima diminuzione nella traccia YFP nella Figura 4C e il confronto del segmento assone vicino al punto di danno nelle immagini YFP in tempi t = 0 sec e t = 6 sec, Figura 4A. A lapunti temporali ter, l'estremità rotta gonfia come parte del suo continuo recupero, con conseguente maggiore fluoroforo localizzata e un aumento di intensità. Questo è più evidente nel tracciato aumentando lentamente PCP nella Figura 4C e un confronto del segmento assone con le immagini della PCP a volte t = 0 sec e t = 270 sec, Figura 4A. Tuttavia, tali variazioni riguardino entrambi i canali allo stesso modo e il FRET rapporto compensa in modo efficace. La misura risultante mostra una risposta simile al corpo cellulare con un immediato aumento ~ 150% del segnale (Af / F), un recupero drammatico al basale vicino a ~ 90 sec e poi un ulteriore risposta minore secondario a ~ 150 sec. L'analisi raziometrica è fondamentale per questa misurazione come sarebbe estremamente difficile separare il segnale di calcio dagli altri effetti, che possono variare notevolmente da neurone a neurone e chirurgia alla chirurgia. Il segnale assone ha più rumore rispetto al segnale corpo cellulare dovuto principalmente al dimmer fluorescenza ela ROI più piccolo nella assone stretto.

Figura 1. Impostazione di base e ottica raziometriche. A) La fotografia mostra l'apparato sperimentale costituito da un microscopio invertito e l'ottica di imaging raziometrico. B) uno schema che illustra l'ottica di imaging necessarie per le FRET raziometriche misurazioni basate. L'immagine è divisa in due lunghezze d'onda o canali, che vengono proiettate side-by-side sulla matrice CCD.

Figura 2. Preparazione del campione. C. elegans sono montati su cuscinetti sottili agarosio per l'imaging. A) pastiglie agarosio sono intramezzando una piccola goccia diagarosio fuso tra due vetrini distanziate da due pezzi di nastro laboratorio. B) Gli animali sono trasferiti sul tampone agarosio e coperto con vetrino, tenuto in posizione da una piccola quantità di cera a ciascuno dei quattro angoli.

Figura 3. Dati esemplificativi GCaMP. Il segnale GCaMP, Af / F, registrato in vivo dal corpo cellulare del neurone ASJ rispondendo a un alternato on / off campo elettrico (traccia verde). Spesse linee grigie indicano i periodi in cui il campo elettrico esterno (3 V / cm) è stato applicato per l'animale. Barra della scala rappresenta il 100% di aumento di intensità di fluorescenza.

Figura 4. Dati di esempio Cameleon. A) Tre fotogrammi separati mostra la doppia immaginevista di un neurone ALM prima e dopo la chirurgia laser dei 20 micron assone dal corpo cellulare. La freccia rossa nel pannello centrale indica il punto di taglio. Il pannello inferiore mostra il corpo della cella e il segmento assone produrre i segnali in B e C. B) Il cameleon YC3.60 segnale misurato al corpo cellulare del neurone ALM, prima e dopo la chirurgia laser (freccia rossa). C) Il Cameleon YC3 0,60 del segnale misurato ai segmento assone entro 5 micron del punto di taglio, prima e dopo la chirurgia laser. Tracce gialle indicano i segnali YFP, linee blu indicano i segnali della PCP e le tracce arancioni sono la risultante FRET rapporto. Tutti gli orari sono relativi al tempo di chirurgia laser. Barre di scala rappresentano un aumento del 100% di intensità di fluorescenza. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Indicatori calcio geneticamente codificati sono stati ampiamente utilizzati in C. elegans neurobiologia. Numerosi gruppi hanno utilizzato queste tecniche per studiare la risposta dei neuroni sensitivi primari a stimoli esterni come dimostrato qui con la risposta ASJ ad un campo elettrico. Esempi più evidenti riguardano sensazione del tatto meccanici, prodotti chimici specifici, la temperatura e un campo elettrico ^{12, 16-19.} Attività di interneuroni e cellule muscolari sono stati monitorati sia in risposta a stimoli e nel controllo del comportamento animale. Molti di questi studi hanno spinto queste tecniche un ulteriore passo avanti con il riconoscimento delle immagini e le tecniche di monitoraggio per consentire la registrazione di neuroni negli animali in parte trattenuti o anche liberi di muoversi così come la registrazione da parte dei neuroni contemporaneamente. Ulteriori studi hanno indagato altri aspetti della fisiologia calcio, come la risposta al danno neuronale ^{13, 20} come presentato qui come puredegenerazione neuronale su scale di tempo più lungo ^21.

Nella progettazione di un esperimento particolare, ciascuna delle tecniche alternative per quanto riguarda i giornalisti di calcio di uso comune e l'immobilizzazione degli animali deve essere attentamente valutata. Tecniche di immobilizzazione sarà dettato da aspetti tecnici quali la necessità di un accesso fisico per l'animale, la capacità di recuperare animali dopo imaging o la necessità di throughput elevato. Diversi giornalisti di calcio fluorescenti hanno vantaggi e svantaggi pure. GCaMP impiega semplice singola analisi di immagine del canale e la grande segnale-rumore lo rende applicabile a molte situazioni. Cameleon dall'altro richiede l'imaging più complesse e analisi, ma la misura risultante raziometrico può essere critico in situazioni con artefatti potenzialmente grandi. Per esempio, le fluttuazioni nella quantità di fluoroforo (come nell'esempio danni laser) possono verificarsi anche lunghi periodi di tempo(Ore) a causa di cambiamenti nei livelli di espressione. Ulteriori strategie di imaging duali sono possibili anche come GCaMP co-espresso con (o fisicamente collegato a) un fluoroforo RFP. Anche se non FRET-based questo sarebbe sfruttare la vasta gamma dinamica di varianti GCaMP moderni mentre si utilizza il canale rosso come un tempo reale misurazione di riferimento.

È importante notare che numerosi bicanale sistemi microscopio imaging e software di analisi sono commercialmente disponibili che, mentre spesso più costosi, può essere interessante per i ricercatori riluttanti a costruire il sistema casa costruita qui descritto. Commerciali sistemi di imaging a doppia (DualView2-DV2, fotometrici) in genere utilizzano ottiche simili al nostro sistema casa costruita, ma sono contenuti in un allegato microscopio singolo con procedure di allineamento standardizzate. In alternativa, i sistemi di scambio rapido filtro (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) consentire un rapido in tempo reale immagini in sequenza di due canali di colore wiThout ottiche immagini supplementari, ma sono anche costosi e richiedono una precisa sincronizzazione tra la centrale del filtro e l'acquisizione della fotocamera.

In sintesi, C. elegans presenta una serie di vantaggi, come un sistema di imaging in vivo. I fluorofori geneticamente codificati sono spesso specifica cella e può eliminare la necessità di iniezione o somministrazione di fluorofori esogeni. C. accessibilità elegans ottico permette l'imaging in animali intatti che sono di facile ed economica da mantenere, non richiedono la dissezione complicato o coltura neuronale e preservare la fisiologia cellulare. Inoltre, C. elegans ha grandi capacità per l'analisi genetica con un gran numero di reagenti disponibili genetiche e consolidate tecniche. Ci sono degli svantaggi naturalmente al sistema, la preoccupazione primaria forse essendo che è un invertebrato. Inoltre, fluorofori segnalare variazioni relative piuttosto c concentrazione di calcior di un valore assoluto e la risoluzione temporale di misure può essere limitato da entrambe le dinamiche del fluoroforo ma anche i tempi di integrazione necessari deboli segnali di fluorescenza. Infine, mentre il calcio è parte integrante di attività neuronale e segnalare i fluorofori non direttamente segnalare il potenziale di membrana di tensione misurato con tecniche elettrofisiologiche. Tuttavia illustrato dalle procedure qui presentate, C. elegans è un attraente, relativamente semplice ed economico sistema per una vasta gamma di studi di imaging neuronale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B