בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans
Summary
עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים ריאגנטים,<em> ג elegans</em> עושה אורגניזם מודל אידיאלי עבור<em> In vivo</em> הדמיה עצבית תוך שימוש בטכניקות פשוטות יחסית, בעלות נמוכה. כאן אנו מתארים הדמית נוירון בודדה בתוך בעלי חיים מבוגרים ללא פגע באמצעות אינדיקטורים סיד ניאון מקודד גנטי.
Abstract
נמטודות התולעת ג elegans הוא אורגניזם מודל אידיאלי להדמיה פשוטה יחסית, בעלות נמוכה עצבית בגוף חי. גופו הקטן השקוף ופשוט, מערכת עצבים היטב מאופיינת מאפשר זיהוי והדמית קרינה של כל נוירון בתוך החיים השלמים. טכניקות קיבוע פשוטות עם השפעה מינימאלית על הפיסיולוגיה של בעלי החיים מאפשרות שיקוף מורחב זמן לשגות. הפיתוח של fluorophores הרגיש סיד הגנטי מקודד כגון 1 Cameleon וGCaMP 2 לאפשר בתחום הדמית vivo של סיד עצבי הנוגע גם פיזיולוגיה של תא ופעילות עצבית. זנים מהונדסים רבים מבטאים fluorophores אלה בתאי עצב ספציפיים הם זמינים או ניתן לבנות תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב. כאן, אנו מתארים הליכים מפורטים למדידת דינמיקת הסידן בתוך תא עצב יחיד בגוף החי הוא באמצעות GCaMP וCameleon. אנו דנים ביתרונות וdisadvantגילים גם כן שיטות שונות של הכנת מדגם (קיבוע בעלי חיים) וניתוח תמונה. לבסוף, אנו מציגים תוצאות משני ניסויים: 1) שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של נוירון ספציפי לשדה חשמלי חיצוני ו2) שימוש בCameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית של סיד נוירון לניזק ליזר טראומטי. שיטות הדמית סידן כגון אלה נמצאים בשימוש נרחב בג elegans והורחב למדידות בבעלי חיים שנעו בחופשיות, נוירונים מרובים בו זמנית והשוואה על פני רקע גנטי. ג elegans מציג מערכת חזקה וגמישה להדמיה עצבית vivo עם יתרונות על פני מערכות מודל אחרות בפשטות ועלות טכניות.
Introduction
כאן אנו מציגים שיטות מעשיות לתחום הדמית vivo סיד בג הנוירונים elegans. הפיתוח של fluorophores סיד רגיש המקודד גנטי עם יחס גבוה בין אות לרעש גורם ג elegans מערכת יעילה יחסית פשוטה ועלות למדידת נוירופיזיולוגיה ופעילות. ההדמיה שלנו נעשתה באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי באמצעות דימות פלואורסצנטי שדה הרחב של fluorophores הזמין בדרך כלל. אנו מציגים כמה טכניקות המעסיקות fluorophores שונה ותכשירים שונים לדוגמה, דנים בנקודתי החוזק והחולשה של כל אחד. נתונים שהוצגו אז משני ניסויים לדוגמה. משאב נוסף מצוין בטכניקות המתוארות כאן ניתן למצוא בWormBook, "הדמיה את הפעילות של תאי עצב ושרירים" על ידי ר 'קר, (http://www.wormbook.org 3).
שני סוגים עיקריים של genetiכתבי סיד ניאון מקודדים קאלי משמשים בדרך כלל בג elegans: GCaMP ערוץ אחד וCameleon סריג מבוסס. אנו מתארים שיטות ולהראות דוגמאות לנתונים שנוצרו על ידי כל אחד.
GCaMP מבוסס על חלבון שונה גרין פלורסנט (GFP), כי הוא רגיש לריכוז הסיד שמסביב. המטרה זו מושגת על ידי שילוב של GFP וcalmodulin חלבון זיקת סידן הגבוה, באופן שמחייב של סידן על ידי calmodulin מביא מולקולת GFP לאישור ניאון יעיל 2. את הפיתוחים האחרונים בfluorophores אלה יוצרים גודל אות יוצא דופן עם גידול של עד 500% בעוצמת קרינה על פני טווח פיסיולוגי של רמות הסידן וקינטיקה במהירות סבירה של זמן ~ 95 אלפיות עלייה ודעיכה ~ 650 אלפית 4. על פני תקופות זמן קצרות יחסית (דקות), האותות הגדולים האלה יכולים לאפשר להדמיה ברזולוציה נמוכה יותר (גדלה נמוכה יותר), וניתנו מחונך initמדידת קו הבסיס IAL, שוללת את הצורך הבסיסי רציפות או מדידות השוואתיות.
Cameleon יש את היתרון של להיות fluorophore סריג מבוסס שמייצר מדידת ratiometric השוואה שני ערוצים או אורכי גל 1 עצמאיים. זה מורכב משני fluorophores הנפרד (חלבוני ניאון וצהוב ציאן פולט, וYFP CFP) מקושר על ידי חלבון calmodulin. המתחם מואר באור כחול (440 ננומטר) שמרגש CFP. עקידת הסיד מביאה את fluorophores ביחד קרוב, הגדלת העברת אנרגית תהודת פלואורסצנטי (סריג) מCFP (תורם) לYFP (acceptor) וגורם לפליטת CFP (480 ננומטר) כדי להקטין וYFP הפליטה (535 ננומטר) כדי להגדיל . רמות סידן יחסיות נמדדות כיחס בין עוצמת YFP / CFP. קינטיקה Cameleon היא איטיות יותר מזה של GCaMP, נמדד בגוף חי יש זמן עלייה של ~ 1 שניות וזמן דעיכה של ~ 3 שניות 5. עם זאת,היחס של אותות הפוכים נעים מגדיל את גודל האות ומפצה על מספר החפצים אפשריים עקב שינויים בריכוז fluorophore, תנועה או להיסחף פוקוס וההלבנה.
כתבי ניאון מקודד גנטי לשלול הרבה של הכנת המדגם הנדרש עם בדיקות מנוהלות exogenously וג גוף שקוף קטן elegans מאפשר הדמיה תוך שימוש בבעלי החיים בשלמות פלואורסצנטי שדה הרחב פשוט. האתגר הטכני העיקרי בהכנת מדגם לכן, כדי לשתק את החיות בשלום. ישנן מספר טכניקות שונות נפוצים כל אחד עם יתרונות וחסרונות. שימוש תרופתי לשתק את בעלי החיים הוא קל לביצוע ומאפשר הרכבה של חיות מרובות בהכנה אחד (Levamisole, אגוניסט כולינרגית שגורם לרקמת שריר לתפוס הוא בדרך כלל בשימוש 6). ג elegans גם יכול להיות משותק מבחינה פיזית על ידי הרכבתםעל נוקשה 10% agarose 7, 8. השפעה זו מצמצמת בפיזיולוגית בעלי חיים, מאפשרת הדמיה לטווח ארוך (שעות) והתאוששות של בעלי חיים רבים, אבל הוא יותר קשה מבחינה טכנית. שתי הטכניקות האלה להגביל את הגישה פיזית לבעלי החיים (שהם תחת תלוש כיסוי) ולכן יכולים לשמש רק עם גירויים ניסיוניים מסוימים (כמו אור, טמפרטורת שדה, חשמלי או ניזק ליזר). לגירויים שבו גישה פיזית נדרשת, כגון מגע או ממשל של כימיקלים, מחקרים רבים דבוקים בהצלחה ג elegans במקום (באמצעות דבק כיתת וטרינרית) 9. זה יותר מאתגר מבחינה טכנית, הוא תכשיר בהמה אחת ולא מאפשר התאוששות של בעלי חיים. לבסוף, מכשירי microfluidic רבים להיות מועסקים כי פיזי לרסן ג elegans, שימור פיזיולוגית בעלי חיים, המאפשר חשיפה למרבית סוגי גירויים (תלוי בעיצוב המכשיר) ויכול לאפשר חליפין והתאוששות מהירים של בעלי החיים <sup> 10, 11. עם זאת מיקרופלואידיקה דורשת כישורים טכניים נוספים ויכולות בעיצוב, ייצור ויישום. בפעילות וגירוי חיות משותקות תגובה כלל ניתן למדוד בחושי וinterneurons. פעילות של תאי עצב מוטורי דורשת טכניקות מתוחכמות יותר עבור הדמיה בחיות נעות. כאן אנחנו נציג שיטות מפורטות המעסיקות את שתי טכניקות הפשוטות ביותר של השבתה וקיבוע עם agarose הנוקשה תרופתיות.
השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש למדידת פעילות עצבית ופיזיולוגיה של תא בג elegans. אנחנו נותנים דוגמה לכל אחד: שימוש GCaMP למדוד את התגובה החושית של ASJ נוירון לשדה חשמלי חיצוני, ובאמצעות Cameleon כדי למדוד את התגובה הפיזיולוגית לסיד ניזק ליזר של תא עצב. דוגמאות אלו מראות את היתרונות וחסרונות של שני סוגים של fluorophores ולהמחיש מה אפשרי עם המערכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינדיקטורים סיד מקודד גנטי כבר נוצלו באופן נרחב בג elegans נוירוביולוגיה. קבוצות רבות שהעסיקו הטכניקות הללו כדי ללמוד תגובה של תאי עצב התחושתי העיקרי לגירויים חיצוניים כפי שמודגם כאן בתגובת ASJ לשדה חשמלי. דוגמאות בולטות כוללות תחושת המגע מכאני, כימיקלים מסוימים, ט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כמה אנשים תרמו לעבודה מתוארת במאמר זה. CVG נבנה מערך הניסוי, וLS, הא"ס, וCVG בצעו את הניסויים. CVG והא"ס כתבו את כתב היד. כל המחברים לאחר מכן לקחו חלק בתהליך השינוי ואשרו את העותק הסופי של כתב היד. אנו מודים לפול סטרנברג למתח GCaMP. כמה זנים נמטודות משמשים בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז (CGC), אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). תכנית ניתוח תמונת MATLAB עובדת מזה המשמש בגיל 18. המחברים נתמכו על ידי אוניברסיטת בוסטון ומסצ'וסטס חי מרכז המדעים.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
