In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

Summary

Med sin lille transparent kropp, veldokumentert nevroanatomi og en rekke mottagelig genetiske teknikker og reagenser,<em> C. elegans</em> Gjør en ideell modell organisme for<em> In vivo</em> Neuronal bildebehandling ved hjelp av relativt enkle, rimelige teknikker. Her beskriver vi enkelt Nevron bildebehandling innen intakte voksne dyr ved hjelp genetisk kodet fluorescerende kalsium indikatorer.

Abstract

Hvalkveisen ormen C. elegans er en ideell modell organisme for relativt enkel, rimelig neuronal bildebehandling in vivo. Sine små transparent kropp og enkel, tillater godt karakterisert nervesystemet identifikasjon og fluorescens bildebehandling av enhver Nevron innenfor intakt dyret. Enkle immobilisering teknikker med minimal innvirkning på dyrets fysiologi gir ekstra time-lapse imaging. Utviklingen av genetisk kodede kalsium sensitive fluoroforer som Cameleon ¹ og GCaMP ² tillater in vivo avbildning av neuronal kalsium knyttet både celle fysiologi og neuronal aktivitet. Tallrike transgene stammer som uttrykker disse fluoroforer i bestemte nevroner er lett tilgjengelig eller kan bli konstruert ved hjelp av veletablerte teknikker. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for måling kalsium dynamikk innenfor en enkelt nervecelle i vivo ved hjelp av både GCaMP og Cameleon. Vi diskuterer fordeler og disadvantalderen både samt ulike metoder for prøveopparbeidelse (dyr immobilisering) og bildeanalyse. Endelig, presenterer vi resultater fra to eksperimenter: 1) Ved hjelp av GCaMP å måle sensorisk responsen for en spesifikk nervecelle til en ekstern elektrisk felt og 2) Bruk Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons av en nervecelle til traumatisk laser skade. Kalsium imaging teknikker som disse er brukt mye i C. elegans og har blitt utvidet til målinger i fritt bevegelige dyr, flere nevroner samtidig og sammenligning på tvers av genetiske bakgrunn. C. elegans presenterer en robust og fleksibelt system for in vivo neuronal avbildning med fordeler fremfor andre modellsystemer i teknisk enkelhet og kostnadseffektivitet.

Introduction

Her presenterer vi praktiske metoder for in vivo kalsium bildebehandling i C. elegans nerveceller. Utviklingen av genetisk kodede kalsium-sensitive fluoroforer med høyt signal-til-støy-forhold gjør C. elegans en forholdsvis grei og kostnadseffektivt system for måling av nevrofysiologi og aktivitet. Vår bildebehandling er gjort med en standard forbindelse mikroskop med wide-feltet fluorescens avbildning av lett tilgjengelige fluoroforer. Vi presenterer flere teknikker ansette ulike fluoroforer og ulike eksempler preparater, diskutere styrker og svakheter ved hver. Data blir deretter presentert fra to eksempel eksperimenter. En utmerket ytterligere ressurs på teknikkene som er beskrevet her kan bli funnet i WormBook, "Imaging aktiviteten av nevroner og muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

To store klasser av genetisktisk kodet fluorescerende kalsium journalister er ofte brukt i C. elegans: enkelt kanal GCaMP og FRET-baserte Cameleon. Vi vil beskrive metoder og vise eksempler for data generert av hver.

GCaMP er basert på en modifisert grønt fluorescerende protein (GFP) som er følsom for den omgivende kalsiumkonsentrasjon. Dette oppnås ved fusjon av GFP og den høye kalsium affinitet protein kalmodulin, slik at bindingen av kalsium ved kalmodulin bringer GFP molekylet til en effektiv fluorescerende bekreftelse ^2. De siste fremskritt i disse fluoroforer generere eksepsjonell signal størrelse med opptil 500% økning i fluorescens intensitet over en fysiologisk spekter av kalsium og rimelig rask kinetikk ~ 95 msek økning tid og ~ 650 msek desintegrasjonstid ^4. Over relativt korte tidsperioder (minutter), kan disse store signaler tillate lavere oppløsning imaging (lavere forstørrelse), og gitt en veloppdragen initial baseline måling, negere nødvendigheten for kontinuerlig baseline eller komparative målinger.

Cameleon har fordelen av å være en FRET-basert fluorofor som genererer en Proporsjonal måling sammenligner to uavhengige kanaler eller bølgelengder ^1. Den består av to separate fluoroforer (cyan-og gul-utslipp selvlysende proteiner, CFP og YFP) forbundet med en calmodulin protein. Komplekset er belyst med blått lys (440 nm) som interesserer CFP. Bindingen av kalsium bringer fluoroforer tettere sammen, øker fluorescens resonans energi overføring (FRET) fra CFP (donor) til YFP (akseptorfasen) og forårsaker CFP utslipp (480 nm) for å redusere og YFP utslipp (535 nm) for å øke . Relative kalsiumnivåer måles som forholdet mellom den YFP / CFP intensitet. Cameleon kinetikk er tregere enn GCaMP, målt in vivo for å ha en stigningstid på ~ 1 sekund og en desintegrasjonstid på ~ 3 sek ^5. Imidlertidforholdet motsatt bevegelige signaler øker signalet størrelse og kompenserer for en rekke mulige artefakter som skyldes endringer i fluorofor konsentrasjon, bevegelse eller fokus avdrift og bleking.

Genetisk kodet fluorescerende reportere negere mye av prøveopparbeidelse nødvendig med eksogent administrert prober og C. elegans liten gjennomsiktig kroppen tillater bildebehandling i intakt dyret ved hjelp av enkle bredt felt fluorescens. De viktigste tekniske utfordringen i prøveopparbeidelse er derfor å trygt immobilisere dyrene. Det finnes en rekke forskjellige brukte teknikker hver med fordeler og ulemper. Ved hjelp av en farmakologisk middel å lamme dyrene er lett å implementere og tillater montering av flere dyr på en prepareringsåpning (Levamisole, et kolinerg agonist som forårsaker muskelvev å gripe brukes typisk ^6). C. elegans kan også være fysisk immobilisert ved monterer dempå stiv 10% ^{7 agarose, 8.} Dette minimerer tyngre dyrefysiologi, tillater langvarig imaging (timer) og gjenvinning av flere dyr, men er mer teknisk vanskelig. Begge disse teknikkene begrense fysisk tilgang til dyrene (som er under et dekkglass) og kan derfor bare brukes med visse eksperimentelle stimuli (slik som lys, temperatur, elektrisk felt eller laser skade). For stimuli der fysisk tilgang kreves, for eksempel berøring eller administrasjon av kjemikalier, har mange studier hell limt C. elegans på plass (med veterinær klasse lim) ^9. Dette er teknisk mer krevende, er et enkelt dyr forberedelse og tillater ikke dyr utvinning. Endelig har mange microfluidic enheter vært ansatt som fysisk begrense C. elegans, kan bevare dyr fysiologi, slik eksponering for de fleste typer stimuli (avhengig av enheten design) og muliggjøre rask utveksling og gjenvinning av dyrene <sup> 10, 11. Men MicroFluidics krever flere tekniske ferdigheter og evner innen design, fabrikasjon og gjennomføring. I immobilisert dyr aktivitet og stimulans respons kan vanligvis måles i sensorisk og interneurons. Aktivitet av motoriske nevroner krever mer sofistikerte teknikker for bildebehandling i bevegelse dyr. Her vil vi presentere detaljerte metoder ansette de to mest enkle teknikker for farmakologisk paralyzation og immobilisering med stiv agarose.

Metodene som presenteres her kan brukes til å måle neuronal aktivitet og cellefysiologi i C. elegans. Vi gir et eksempel på hver: bruke GCaMP å måle den sensoriske respons av ASJ nervecelle til en ekstern elektrisk felt, og bruke Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons laser skade av et nevron. Disse eksempler viser de fordeler og ulemper ved de to typene fluoroforer og illustrere hva som er mulig med systemet.

Protocol

1. Optisk oppsett Bruk en standard forbindelse mikroskop med epifluorescence imaging evner. Vi bruker et Nikon Eclipse Ti-U invertert mikroskop med en Intensilight HG Illuminator. For beste bilde og signalkvalitet bruke en høy forstørrelse, høy numerisk apertur mål. Vi bruker vanligvis en Nikon X60 1,4 NA neddyppingsobjektivet. I noen tilfeller er det mulig å bruke lavere forstørrelse (X40, X20) avhengig ekspresjon nivå av fluoroforen og signalstyrke. Bruk en høy følsomhet avkjøl…

Representative Results

Her presenterer vi resultater fra to separate eksperimenter. Den første benytter GCaMP å måle responsen av en spesifikk sensorisk nevron til en definert ytre stimuli, noe som gir et godt eksempel på hvordan fluorescerende kalsium reportere kan brukes til optisk overvåke neuronal aktivitet i intakte C. elegans. Den andre benytter Cameleon å måle intracellulær kalsium forbigående utløst innenfor et nevron i respons til spesifikke laser skade, og dermed viser hvordan kalsium fysiologi kan måles innenfor…

Discussion

Genetisk kodet kalsium indikatorer har vært mye brukt i C. elegans nevrobiologi. Tallrike grupper har anvendt disse teknikkene for å studere respons av primære sensoriske nevroner på ytre stimuli som demonstrert her med ASJ responsen til et elektrisk felt. Prominent eksempler er følelsen av mekanisk berøring, bestemte kjemikalier, temperatur og en elektrisk ^{12 felt, 16-19.} Aktivitet av interneuron og muskelceller har også blitt overvåket både som reaksjon på stimuli og i kontroll av dyrs at…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B