Med sin lille transparent kropp, veldokumentert nevroanatomi og en rekke mottagelig genetiske teknikker og reagenser,<em> C. elegans</em> Gjør en ideell modell organisme for<em> In vivo</em> Neuronal bildebehandling ved hjelp av relativt enkle, rimelige teknikker. Her beskriver vi enkelt Nevron bildebehandling innen intakte voksne dyr ved hjelp genetisk kodet fluorescerende kalsium indikatorer.
Hvalkveisen ormen C. elegans er en ideell modell organisme for relativt enkel, rimelig neuronal bildebehandling in vivo. Sine små transparent kropp og enkel, tillater godt karakterisert nervesystemet identifikasjon og fluorescens bildebehandling av enhver Nevron innenfor intakt dyret. Enkle immobilisering teknikker med minimal innvirkning på dyrets fysiologi gir ekstra time-lapse imaging. Utviklingen av genetisk kodede kalsium sensitive fluoroforer som Cameleon 1 og GCaMP 2 tillater in vivo avbildning av neuronal kalsium knyttet både celle fysiologi og neuronal aktivitet. Tallrike transgene stammer som uttrykker disse fluoroforer i bestemte nevroner er lett tilgjengelig eller kan bli konstruert ved hjelp av veletablerte teknikker. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for måling kalsium dynamikk innenfor en enkelt nervecelle i vivo ved hjelp av både GCaMP og Cameleon. Vi diskuterer fordeler og disadvantalderen både samt ulike metoder for prøveopparbeidelse (dyr immobilisering) og bildeanalyse. Endelig, presenterer vi resultater fra to eksperimenter: 1) Ved hjelp av GCaMP å måle sensorisk responsen for en spesifikk nervecelle til en ekstern elektrisk felt og 2) Bruk Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons av en nervecelle til traumatisk laser skade. Kalsium imaging teknikker som disse er brukt mye i C. elegans og har blitt utvidet til målinger i fritt bevegelige dyr, flere nevroner samtidig og sammenligning på tvers av genetiske bakgrunn. C. elegans presenterer en robust og fleksibelt system for in vivo neuronal avbildning med fordeler fremfor andre modellsystemer i teknisk enkelhet og kostnadseffektivitet.
Her presenterer vi praktiske metoder for in vivo kalsium bildebehandling i C. elegans nerveceller. Utviklingen av genetisk kodede kalsium-sensitive fluoroforer med høyt signal-til-støy-forhold gjør C. elegans en forholdsvis grei og kostnadseffektivt system for måling av nevrofysiologi og aktivitet. Vår bildebehandling er gjort med en standard forbindelse mikroskop med wide-feltet fluorescens avbildning av lett tilgjengelige fluoroforer. Vi presenterer flere teknikker ansette ulike fluoroforer og ulike eksempler preparater, diskutere styrker og svakheter ved hver. Data blir deretter presentert fra to eksempel eksperimenter. En utmerket ytterligere ressurs på teknikkene som er beskrevet her kan bli funnet i WormBook, "Imaging aktiviteten av nevroner og muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
To store klasser av genetisktisk kodet fluorescerende kalsium journalister er ofte brukt i C. elegans: enkelt kanal GCaMP og FRET-baserte Cameleon. Vi vil beskrive metoder og vise eksempler for data generert av hver.
GCaMP er basert på en modifisert grønt fluorescerende protein (GFP) som er følsom for den omgivende kalsiumkonsentrasjon. Dette oppnås ved fusjon av GFP og den høye kalsium affinitet protein kalmodulin, slik at bindingen av kalsium ved kalmodulin bringer GFP molekylet til en effektiv fluorescerende bekreftelse 2. De siste fremskritt i disse fluoroforer generere eksepsjonell signal størrelse med opptil 500% økning i fluorescens intensitet over en fysiologisk spekter av kalsium og rimelig rask kinetikk ~ 95 msek økning tid og ~ 650 msek desintegrasjonstid 4. Over relativt korte tidsperioder (minutter), kan disse store signaler tillate lavere oppløsning imaging (lavere forstørrelse), og gitt en veloppdragen initial baseline måling, negere nødvendigheten for kontinuerlig baseline eller komparative målinger.
Cameleon har fordelen av å være en FRET-basert fluorofor som genererer en Proporsjonal måling sammenligner to uavhengige kanaler eller bølgelengder 1. Den består av to separate fluoroforer (cyan-og gul-utslipp selvlysende proteiner, CFP og YFP) forbundet med en calmodulin protein. Komplekset er belyst med blått lys (440 nm) som interesserer CFP. Bindingen av kalsium bringer fluoroforer tettere sammen, øker fluorescens resonans energi overføring (FRET) fra CFP (donor) til YFP (akseptorfasen) og forårsaker CFP utslipp (480 nm) for å redusere og YFP utslipp (535 nm) for å øke . Relative kalsiumnivåer måles som forholdet mellom den YFP / CFP intensitet. Cameleon kinetikk er tregere enn GCaMP, målt in vivo for å ha en stigningstid på ~ 1 sekund og en desintegrasjonstid på ~ 3 sek 5. Imidlertidforholdet motsatt bevegelige signaler øker signalet størrelse og kompenserer for en rekke mulige artefakter som skyldes endringer i fluorofor konsentrasjon, bevegelse eller fokus avdrift og bleking.
Genetisk kodet fluorescerende reportere negere mye av prøveopparbeidelse nødvendig med eksogent administrert prober og C. elegans liten gjennomsiktig kroppen tillater bildebehandling i intakt dyret ved hjelp av enkle bredt felt fluorescens. De viktigste tekniske utfordringen i prøveopparbeidelse er derfor å trygt immobilisere dyrene. Det finnes en rekke forskjellige brukte teknikker hver med fordeler og ulemper. Ved hjelp av en farmakologisk middel å lamme dyrene er lett å implementere og tillater montering av flere dyr på en prepareringsåpning (Levamisole, et kolinerg agonist som forårsaker muskelvev å gripe brukes typisk 6). C. elegans kan også være fysisk immobilisert ved monterer dempå stiv 10% 7 agarose, 8. Dette minimerer tyngre dyrefysiologi, tillater langvarig imaging (timer) og gjenvinning av flere dyr, men er mer teknisk vanskelig. Begge disse teknikkene begrense fysisk tilgang til dyrene (som er under et dekkglass) og kan derfor bare brukes med visse eksperimentelle stimuli (slik som lys, temperatur, elektrisk felt eller laser skade). For stimuli der fysisk tilgang kreves, for eksempel berøring eller administrasjon av kjemikalier, har mange studier hell limt C. elegans på plass (med veterinær klasse lim) 9. Dette er teknisk mer krevende, er et enkelt dyr forberedelse og tillater ikke dyr utvinning. Endelig har mange microfluidic enheter vært ansatt som fysisk begrense C. elegans, kan bevare dyr fysiologi, slik eksponering for de fleste typer stimuli (avhengig av enheten design) og muliggjøre rask utveksling og gjenvinning av dyrene <sup> 10, 11. Men MicroFluidics krever flere tekniske ferdigheter og evner innen design, fabrikasjon og gjennomføring. I immobilisert dyr aktivitet og stimulans respons kan vanligvis måles i sensorisk og interneurons. Aktivitet av motoriske nevroner krever mer sofistikerte teknikker for bildebehandling i bevegelse dyr. Her vil vi presentere detaljerte metoder ansette de to mest enkle teknikker for farmakologisk paralyzation og immobilisering med stiv agarose.
Metodene som presenteres her kan brukes til å måle neuronal aktivitet og cellefysiologi i C. elegans. Vi gir et eksempel på hver: bruke GCaMP å måle den sensoriske respons av ASJ nervecelle til en ekstern elektrisk felt, og bruke Cameleon å måle den fysiologiske kalsium respons laser skade av et nevron. Disse eksempler viser de fordeler og ulemper ved de to typene fluoroforer og illustrere hva som er mulig med systemet.
Genetisk kodet kalsium indikatorer har vært mye brukt i C. elegans nevrobiologi. Tallrike grupper har anvendt disse teknikkene for å studere respons av primære sensoriske nevroner på ytre stimuli som demonstrert her med ASJ responsen til et elektrisk felt. Prominent eksempler er følelsen av mekanisk berøring, bestemte kjemikalier, temperatur og en elektrisk 12 felt, 16-19. Aktivitet av interneuron og muskelceller har også blitt overvåket både som reaksjon på stimuli og i kontroll av dyrs at…
The authors have nothing to disclose.
Flere personer bidratt i arbeidet er beskrevet i denne artikkelen. CVG bygget eksperimentelle oppsett, og LS, SHC, og CVG utført forsøkene. CVG og SHC skrev manuskriptet. Alle forfatterne senere deltok i revisjonsprosessen og godkjent den endelige kopien av manuskriptet. Vi takker Paul Sternberg for GCaMP belastning. Noen nematode stammer som brukes i dette arbeidet ble gitt av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR). MATLAB bildeanalyse programmet ble tilpasset fra det som brukes i 18. Forfatterne ble støttet av Boston University og Massachusetts Life Sciences Center.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
NGM buffer | |||
Levamisole | Sigma | ||
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |