Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans
Summary
Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos,<em> C. elegans</em> Hace que un organismo modelo ideal para<em> In vivo</em> Imagen neuronal utilizando relativamente simples y de bajo costo técnicas. Aquí se describe imagen única neurona dentro de animales adultos intactos utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio fluorescente.
Abstract
El gusano nematodo C. elegans es un organismo modelo ideal para relativamente simple, formación de imágenes de bajo coste neuronal in vivo. Su pequeño cuerpo transparente y simple, bien caracterizado sistema nervioso permite la identificación y obtención de imágenes de fluorescencia de cualquier neurona en el animal intacto. Técnicas sencillas de inmovilización con un impacto mínimo sobre la fisiología del animal permitir extendido time-lapse de imágenes. El desarrollo de los fluoróforos de calcio genéticamente codificados sensibles como cameleon 1 y 2 GCaMP permitir la formación de imágenes in vivo de calcio neuronal relacionada tanto fisiología celular y la actividad neuronal. Numerosas cepas transgénicas que expresan estos fluoróforos en neuronas específicas están fácilmente disponibles o se pueden construir utilizando técnicas bien establecidas. A continuación, se describen los procedimientos detallados para medir la dinámica del calcio dentro de una sola neurona in vivo utilizando tanto GCaMP y cameleon. Se discuten las ventajas y disadvantedades de ambos, así como varios métodos de preparación de la muestra (inmovilización animal) y análisis de imagen. Finalmente, se presentan los resultados de dos experimentos: 1) Usando GCaMP para medir la respuesta sensorial de una neurona específica a un campo eléctrico externo y 2) Utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológico de una neurona a daño traumático láser. Técnicas de formación de imágenes de calcio tales como éstos se utilizan ampliamente en C. elegans y se han extendido a las mediciones en los animales que se desplazan libremente, neuronas de forma simultánea y la comparación entre fondos genéticos. C. elegans presenta un sistema robusto y flexible para imágenes in vivo neuronal con ventajas sobre otros sistemas modelo de sencillez técnica y coste.
Introduction
Aquí presentamos métodos prácticos para la formación de imágenes in vivo del calcio en C. Elegans neuronas. El desarrollo de las codificadas genéticamente sensibles calcio-fluoróforos con alta relación de señal a ruido hace C. elegans un sistema efectivo comparativamente sencillo y rentable para la medición de la neurofisiología y la actividad. Nuestra formación de imágenes se realiza con un microscopio compuesto estándar utilizando amplio campo de imágenes de fluorescencia de los fluoróforos disponibles comúnmente. Se presentan varias técnicas que emplean diferentes fluoróforos y preparaciones diferentes de la muestra, discutir las fortalezas y debilidades de cada uno. Los datos se presentan a continuación, a partir de dos experimentos de ejemplo. Un excelente recurso adicional sobre las técnicas descritas aquí se pueden encontrar en WormBook, "Imagen de la actividad de las neuronas y los músculos" por R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
Dos clases principales de genéticamentecamente codificados reporteros fluorescentes de calcio se utilizan comúnmente en C. elegans: GCaMP solo canal y cameleon FRET basada. Vamos a describir los métodos y ejemplos para mostrar los datos generados por cada uno.
GCaMP se basa en una modificación de la proteína verde fluorescente (GFP) que es sensible a la concentración de calcio circundante. Esto se logra mediante la fusión de GFP y la calmodulina calcio de alta afinidad de proteína, de tal manera que la unión del calcio por la calmodulina lleva la molécula de GFP en una confirmación eficiente fluorescente 2. Los recientes avances en estos fluoróforos generar tamaño de la señal excepcional con hasta 500% de aumento en la intensidad de fluorescencia en un rango fisiológico de los niveles de calcio y la cinética razonablemente rápidos de ~ 95 ms tiempo de subida y el tiempo de decaimiento ~ 650 mseg 4. Durante períodos de tiempo relativamente cortos (minutos), estas señales pueden permitir grandes para obtener imágenes de resolución más baja (menor magnificación) y, dado un buen comportamiento initmedida de referencia ial, niega la necesidad de línea de base continua o mediciones comparativas.
Cameleon tiene la ventaja de ser un fluoróforo FRET basada en el que genera una medición radiométrica comparando dos canales independientes o longitudes de onda 1. Se compone de dos fluoróforos diferentes (proteínas fluorescentes cian y amarillo, emisores de PPC y YFP) unidos por una proteína calmodulina. El complejo está iluminado con luz azul (440 nm) que excita la PPC. La unión de calcio trae los fluoróforos más juntos, aumentando la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) de la PPC (donante) a la YFP (aceptor) y provocando la emisión PPC (480 nm) para disminuir la emisión y YFP (535 nm) para aumentar . Los niveles relativos de calcio se mide como la relación de la intensidad YFP / CFP. Cinética Cameleon son más lentas que la de GCaMP, medido in vivo para tener un tiempo de subida de ~ 1 sec y un tiempo de desintegración de 3 ~ 5 seg. Sin embargo,la relación de las señales que se mueven opuestamente aumenta el tamaño de la señal y compensa un número de posibles artefactos debido a los cambios en la concentración de fluoróforo, el movimiento o la deriva enfoque y blanqueo.
Codificados genéticamente reporteros fluorescentes negar gran parte de la preparación de la muestra requiere exógenamente con sondas administrados y C. elegans pequeño cuerpo transparente permite visualizar imágenes en el animal intacto utilizando fluorescencia sencilla de campo amplio. El principal reto técnico en preparación de la muestra es por lo tanto, para inmovilizar de forma segura a los animales. Hay un número de diferentes técnicas comúnmente utilizadas cada uno con ventajas y desventajas. El uso de un agente farmacológico para paralizar a los animales es fácil de implementar y permite el montaje de múltiples animales en una preparación (Levamisol, un agonista colinérgico que hace que el tejido muscular para aprovechar se utiliza típicamente 6). C. elegans también puede ser físicamente inmovilizada mediante el montaje de losen 10% de agarosa rígido 7, 8. Esto minimiza el impacto en la fisiología del animal, permite a largo plazo de imágenes (horas) y la recuperación de varios animales, pero es más difícil técnicamente. Ambas técnicas restringir el acceso físico a los animales (que están bajo un cubreobjetos) y, por tanto, sólo pueden utilizarse con ciertos estímulos experimentales (tal como luz, temperatura, campo eléctrico o daño láser). Para los estímulos que se requiere acceso físico, como el tacto o la administración de los productos químicos, muchos estudios han pegado con éxito C. elegans en su lugar (el uso de pegamento de grado veterinario) 9. Esto es técnicamente más difícil, es una preparación solo animal y no permite la recuperación de los animales. Por último, numerosos dispositivos de microfluidos han sido empleados que físicamente restringir C. elegans, preservando la fisiología animal, permitiendo la exposición a la mayoría de los tipos de estímulos (dependiendo del diseño del dispositivo) y puede permitir el intercambio rápido y la recuperación de los animales <sup> 10, 11. Sin embargo microfluidos adicionales requieren habilidades técnicas y capacidades en diseño, fabricación e implementación. En actividad inmovilizado animales y estímulo respuesta generalmente se puede medir en sensorial y interneuronas. Actividad de las neuronas motoras requiere de técnicas más sofisticadas para la formación de imágenes en movimiento en los animales. Aquí vamos a presentar métodos detallados que emplean las dos técnicas más sencillas de paralización e inmovilización farmacológica con rigidez de agarosa.
Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para medir la actividad neuronal y la fisiología celular en C. elegans. Damos un ejemplo de cada uno de: el uso de GCaMP para medir la respuesta de la neurona sensorial ASJ a un campo eléctrico externo, y utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológica a la lesión con láser de una neurona. Estos ejemplos muestran las ventajas y los inconvenientes de los dos tipos de fluoróforos e ilustran lo que es posible con el sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genéticamente codificados indicadores de calcio se han utilizado ampliamente en C. elegans neurobiología. Numerosos grupos han empleado estas técnicas para estudiar la respuesta de las neuronas sensoriales primarias a estímulos externos como se demuestra aquí con la respuesta ASJ a un campo eléctrico. Ejemplos destacados incluyen sensación del tacto mecánico, productos químicos específicos, la temperatura y un campo eléctrico 12, 16-19. Actividad de interneuronas y células musculares tamb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Varias personas contribuyeron al trabajo descrito en este documento. CVG construyó el montaje experimental, y LS, SHC, y CVG realizado los experimentos. CVG y SHC escribió el manuscrito. Todos los autores participaron posteriormente en el proceso de revisión y aprobó la versión final del manuscrito. Damos las gracias a Paul Sternberg para la cepa GCaMP. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). El programa de análisis de imagen MATLAB se adaptó del que se utiliza en 18. Los autores recibieron el apoyo de la Universidad de Boston y el Massachusetts Life Sciences Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
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