In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans
Summary
Med sin lilla transparent kropp väldokumenterad neuroanatomi och en mängd mottagliga genetiska tekniker och reagens,<em> C. elegans</em> Är en idealisk modell organism för<em> In vivo</em> Neuronal avbildning med relativt enkla, billiga tekniker. Här beskriver vi enda neuron avbildning inom intakta vuxna djur med genetiskt kodade fluorescerande kalcium indikatorer.
Abstract
Den nematod mask C. elegans är en idealisk modell organism för relativt enkla, billiga neuronal avbildning in vivo. Dess små genomskinlig kropp och enkla, gör väl karakteriserade nervsystemet identifiering och fluorescens avbildning av en neuron i det intakta djuret. Enkla immobiliseringstekniker med minimal påverkan på djurets fysiologi tillåter längre tid-lapse avbildning. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium känsliga fluoroforer som cameleon 1 och GCaMP 2 tillåter in vivo avbildning av neuronala kalcium om både cell-fysiologi och nervaktivitet. Talrika transgena stammar som uttrycker dessa fluoroforer i specifika neuroner är lätt tillgängliga eller kan konstrueras med användning av väletablerade tekniker. Här beskriver vi detaljerade förfaranden för att mäta kalcium dynamik i en enda neuron in vivo med både GCaMP och cameleon. Vi diskuterar fördelar och disadvantåldrar såväl samt olika metoder för provberedning (djur immobilisering) och bildanalys. Slutligen, presenterar vi resultaten från två experiment: 1) Använda GCaMP att mäta sensoriska svaret hos en särskild neuron till en extern elektrisk fält och 2) Använda cameleon att mäta den fysiologiska kalcium svaret hos en neuron till traumatisk laserskada. Kalcium avbildningstekniker som dessa används i stor utsträckning i C. elegans och har utvidgats till att mätningar i fritt rörliga djur, flera neuroner samtidigt och jämförelse mellan genetisk bakgrund. C. elegans presenterar ett robust och flexibelt system för in vivo neuronala avbildning med fördelar jämfört med andra modellsystem i teknisk enkelhet och kostnad.
Introduction
Här presenterar vi praktiska metoder för in vivo-kalcium avbildning i C. elegans nervceller. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium-känsliga fluoroforer med högt signal-till-brus-förhållande gör C. Elegans en jämförelsevis okomplicerad och kostnadseffektivt system för mätning av neurofysiologi och aktivitet. Vår avbildning görs med en vanlig förening mikroskop med brett fält fluorescens avbildning av allmänt tillgängliga fluoroforer. Vi presenterar flera tekniker som utnyttjar olika fluoroforer och olika preparat prov, diskutera styrkor och svagheter för varje. Data presenteras sedan från två exempel experiment. En utmärkt extra resurs på de tekniker som beskrivs här kan hittas i WormBook, "Imaging aktiviteten hos nervceller och muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
Två huvudklasser av genetiskttiskt kodade fluorescerande kalcium reportrar används ofta i C. elegans: en kanal GCaMP och FRET-baserade cameleon. Vi kommer att beskriva metoder och visa exempel på data som genereras av varje.
GCaMP baseras på en modifierad grönt fluorescerande protein (GFP) som är känslig för omgivande kalciumkoncentrationen. Detta åstadkommes genom fusion av GFP och den höga kalcium affinitetsprotein kalmodulin, så att bindningen av kalcium från kalmodulin bringar GFP molekylen till en effektiv fluorescerande bekräftelse 2. De senaste framstegen inom dessa fluoroforer genererar exceptionell signal storlek med upp till 500% ökning i fluorescensintensitet över ett fysiologiskt område av kalciumnivåer och rimligt snabb kinetik ~ 95 ms stigtid och ~ 650 ms avklingningstid 4. Under relativt korta tidsperioder (min), kan dessa stora signaler möjliggöra lägre upplösning avbildning (lägre förstoring) och med tanke på en väluppfostrad initIAL referensnivåberäkning, förneka behovet av kontinuerlig baslinje eller jämförande mätningar.
Cameleon har fördelen av att vara en FRET-baserad fluorofor som genererar en ratiometrisk mätning jämför två oberoende kanaler eller våglängder 1. Den består av två separata fluoroforer (cyan-och gul-utsläpp fluorescerande proteiner, GFP och YFP) länkade med en calmodulin protein. Komplexet belyses med blått ljus (440 nm) som väcker den gemensamma fiskeripolitiken. Bindning av kalcium ger fluoroforerna närmare varandra, ökar fluorescens resonansenergiöverföring (FRET) från GFP (donator) till YFP (acceptom) och bringar GFP emissionen (480 nm) för att minska och YFP emissionen (535 nm) för att öka . Relativa kalciumnivåer mäts som förhållandet mellan YFP / fiskeripolitiken intensitet. Cameleon kinetik är långsammare än GCaMP, mätt in vivo för att ha en stigtid på ~ 1 sek och en avklingningstid av ~ 3 sekunder 5. Emellertidförhållandet av motsatt rörliga signaler ökar signal storlek och kompenserar för ett antal möjliga artefakter på grund av förändringar i fluorofor koncentration, rörelse eller fokus drift och blekning.
Genetiskt kodade fluorescerande reportrar förnekar mycket av provberedning krävs med exogent administrerade sonder och C. elegans liten genomskinlig kropp tillåter avbildning inom den intakta djuret med enkla brett fält fluorescens. Den viktigaste tekniska utmaningen i provberedningen är därför att på ett säkert sätt immobilisera djuren. Det finns ett antal olika vanliga tekniker vardera fördelar och nackdelar. Med hjälp av en farmakologiskt medel att förlama djuren är enkel att implementera och tillåter montering av flera djur på en beredning (Levamisol, en kolinerg agonist som orsakar muskelvävnaden att gripa används typiskt 6). C. elegans kan också fysiskt immobiliseras genom att montera dempå hård 10% agaros 7, 8. Detta minimerar inverkan på djurens fysiologi, medger en långsiktig avbildning (timmar) och återvinning av flera djur men är mer tekniskt svårt. Båda dessa tekniker begränsar fysisk tillgång till djuren (som är under ett täckglas) och kan därför bara användas med vissa experimentella stimuli (t.ex. ljus, temperatur, elektriskt fält eller laser skada). För stimuli där fysisk åtkomst krävs, såsom beröring eller administration av kemikalier, har många studier limmade framgångsrikt C. elegans på plats (med hjälp veterinär klass lim) 9. Detta är tekniskt mer utmanande, är ett enda djur förberedelse och tillåter inte djur återhämtning. Slutligen har många mikrofluidikanordningar använts som fysiskt hindra C. elegans, kan bevara djurens fysiologi, vilket exponering för de flesta typer av stimuli (beroende på enheten design) och möjliggöra snabbt utbyte och återvinning av djuren <sup> 10, 11. Men mikrofluidik kräver ytterligare tekniska kompetens och kapacitet inom design, tillverkning och implementering. I immobiliserade djur aktivitet och stimulans svar kan i allmänhet mätas i sensoriska och interneuronen. Aktivitet av motoriska nervceller kräver mer sofistikerade tekniker för avbildning i rörliga djur. Här kommer vi att lägga fram detaljerade metoder som använder de två mest okomplicerade tekniker för farmakologisk lamslås och immobilisering med hård agaros.
De metoder som presenteras här kan användas för att mäta neuronal aktivitet och cellfysiologi i C. elegans. Vi ger ett exempel på varje: med GCaMP att mäta den sensoriska svar ASJ neuron till en extern elektriskt fält, och använder cameleon för att mäta den fysiologiska kalcium svaret på laserskada av en neuron. Dessa exempel visar fördelarna och nackdelarna med de två typerna av fluoroforer och illustrerar vad som är möjligt med systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetiskt kodade kalcium indikatorer har allmänt används i C. elegans neurobiologi. Många grupper har använt dessa tekniker för att studera svar av primära sensoriska neuroner på yttre stimuli såsom visas här med ASJ svar på ett elektriskt fält. Framträdande exempel inkluderar känsla av mekanisk beröring, specifika kemikalier, temperatur och ett elektriskt fält 12, 16-19. Aktiviteten av interneuron och muskelceller har också följts både som svar på stimuli och kontroll över djuren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Flera personer har bidragit till det arbete som beskrivs i detta dokument. CVG byggde experimentuppställning, och LS, SHK, och CVG utfört försöken. CVG och SHK skrev manuskriptet. Alla författare tog därefter del i översynen och godkände den slutliga kopian av manuskriptet. Vi tackar Paul Sternberg för GCaMP stammen. Vissa nematoder stammar som används i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). MATLAB bildanalysprogram anpassades från den som används i 18. Författarna stöddes av Boston University och Massachusetts Life Sciences Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
