Summary

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

Published: April 10, 2013
doi:

Summary

Med sin lilla transparent kropp väldokumenterad neuroanatomi och en mängd mottagliga genetiska tekniker och reagens,<em> C. elegans</em> Är en idealisk modell organism för<em> In vivo</em> Neuronal avbildning med relativt enkla, billiga tekniker. Här beskriver vi enda neuron avbildning inom intakta vuxna djur med genetiskt kodade fluorescerande kalcium indikatorer.

Abstract

Den nematod mask C. elegans är en idealisk modell organism för relativt enkla, billiga neuronal avbildning in vivo. Dess små genomskinlig kropp och enkla, gör väl karakteriserade nervsystemet identifiering och fluorescens avbildning av en neuron i det intakta djuret. Enkla immobiliseringstekniker med minimal påverkan på djurets fysiologi tillåter längre tid-lapse avbildning. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium känsliga fluoroforer som cameleon 1 och GCaMP 2 tillåter in vivo avbildning av neuronala kalcium om både cell-fysiologi och nervaktivitet. Talrika transgena stammar som uttrycker dessa fluoroforer i specifika neuroner är lätt tillgängliga eller kan konstrueras med användning av väletablerade tekniker. Här beskriver vi detaljerade förfaranden för att mäta kalcium dynamik i en enda neuron in vivo med både GCaMP och cameleon. Vi diskuterar fördelar och disadvantåldrar såväl samt olika metoder för provberedning (djur immobilisering) och bildanalys. Slutligen, presenterar vi resultaten från två experiment: 1) Använda GCaMP att mäta sensoriska svaret hos en särskild neuron till en extern elektrisk fält och 2) Använda cameleon att mäta den fysiologiska kalcium svaret hos en neuron till traumatisk laserskada. Kalcium avbildningstekniker som dessa används i stor utsträckning i C. elegans och har utvidgats till att mätningar i fritt rörliga djur, flera neuroner samtidigt och jämförelse mellan genetisk bakgrund. C. elegans presenterar ett robust och flexibelt system för in vivo neuronala avbildning med fördelar jämfört med andra modellsystem i teknisk enkelhet och kostnad.

Introduction

Här presenterar vi praktiska metoder för in vivo-kalcium avbildning i C. elegans nervceller. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium-känsliga fluoroforer med högt signal-till-brus-förhållande gör C. Elegans en jämförelsevis okomplicerad och kostnadseffektivt system för mätning av neurofysiologi och aktivitet. Vår avbildning görs med en vanlig förening mikroskop med brett fält fluorescens avbildning av allmänt tillgängliga fluoroforer. Vi presenterar flera tekniker som utnyttjar olika fluoroforer och olika preparat prov, diskutera styrkor och svagheter för varje. Data presenteras sedan från två exempel experiment. En utmärkt extra resurs på de tekniker som beskrivs här kan hittas i WormBook, "Imaging aktiviteten hos nervceller och muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.

Två huvudklasser av genetiskttiskt kodade fluorescerande kalcium reportrar används ofta i C. elegans: en kanal GCaMP och FRET-baserade cameleon. Vi kommer att beskriva metoder och visa exempel på data som genereras av varje.

GCaMP baseras på en modifierad grönt fluorescerande protein (GFP) som är känslig för omgivande kalciumkoncentrationen. Detta åstadkommes genom fusion av GFP och den höga kalcium affinitetsprotein kalmodulin, så att bindningen av kalcium från kalmodulin bringar GFP molekylen till en effektiv fluorescerande bekräftelse 2. De senaste framstegen inom dessa fluoroforer genererar exceptionell signal storlek med upp till 500% ökning i fluorescensintensitet över ett fysiologiskt område av kalciumnivåer och rimligt snabb kinetik ~ 95 ms stigtid och ~ 650 ms avklingningstid 4. Under relativt korta tidsperioder (min), kan dessa stora signaler möjliggöra lägre upplösning avbildning (lägre förstoring) och med tanke på en väluppfostrad initIAL referensnivåberäkning, förneka behovet av kontinuerlig baslinje eller jämförande mätningar.

Cameleon har fördelen av att vara en FRET-baserad fluorofor som genererar en ratiometrisk mätning jämför två oberoende kanaler eller våglängder 1. Den består av två separata fluoroforer (cyan-och gul-utsläpp fluorescerande proteiner, GFP och YFP) länkade med en calmodulin protein. Komplexet belyses med blått ljus (440 nm) som väcker den gemensamma fiskeripolitiken. Bindning av kalcium ger fluoroforerna närmare varandra, ökar fluorescens resonansenergiöverföring (FRET) från GFP (donator) till YFP (acceptom) och bringar GFP emissionen (480 nm) för att minska och YFP emissionen (535 nm) för att öka . Relativa kalciumnivåer mäts som förhållandet mellan YFP / fiskeripolitiken intensitet. Cameleon kinetik är långsammare än GCaMP, mätt in vivo för att ha en stigtid på ~ 1 sek och en avklingningstid av ~ 3 sekunder 5. Emellertidförhållandet av motsatt rörliga signaler ökar signal storlek och kompenserar för ett antal möjliga artefakter på grund av förändringar i fluorofor koncentration, rörelse eller fokus drift och blekning.

Genetiskt kodade fluorescerande reportrar förnekar mycket av provberedning krävs med exogent administrerade sonder och C. elegans liten genomskinlig kropp tillåter avbildning inom den intakta djuret med enkla brett fält fluorescens. Den viktigaste tekniska utmaningen i provberedningen är därför att på ett säkert sätt immobilisera djuren. Det finns ett antal olika vanliga tekniker vardera fördelar och nackdelar. Med hjälp av en farmakologiskt medel att förlama djuren är enkel att implementera och tillåter montering av flera djur på en beredning (Levamisol, en kolinerg agonist som orsakar muskelvävnaden att gripa används typiskt 6). C. elegans kan också fysiskt immobiliseras genom att montera dempå hård 10% agaros 7, 8. Detta minimerar inverkan på djurens fysiologi, medger en långsiktig avbildning (timmar) och återvinning av flera djur men är mer tekniskt svårt. Båda dessa tekniker begränsar fysisk tillgång till djuren (som är under ett täckglas) och kan därför bara användas med vissa experimentella stimuli (t.ex. ljus, temperatur, elektriskt fält eller laser skada). För stimuli där fysisk åtkomst krävs, såsom beröring eller administration av kemikalier, har många studier limmade framgångsrikt C. elegans på plats (med hjälp veterinär klass lim) 9. Detta är tekniskt mer utmanande, är ett enda djur förberedelse och tillåter inte djur återhämtning. Slutligen har många mikrofluidikanordningar använts som fysiskt hindra C. elegans, kan bevara djurens fysiologi, vilket exponering för de flesta typer av stimuli (beroende på enheten design) och möjliggöra snabbt utbyte och återvinning av djuren <sup> 10, 11. Men mikrofluidik kräver ytterligare tekniska kompetens och kapacitet inom design, tillverkning och implementering. I immobiliserade djur aktivitet och stimulans svar kan i allmänhet mätas i sensoriska och interneuronen. Aktivitet av motoriska nervceller kräver mer sofistikerade tekniker för avbildning i rörliga djur. Här kommer vi att lägga fram detaljerade metoder som använder de två mest okomplicerade tekniker för farmakologisk lamslås och immobilisering med hård agaros.

De metoder som presenteras här kan användas för att mäta neuronal aktivitet och cellfysiologi i C. elegans. Vi ger ett exempel på varje: med GCaMP att mäta den sensoriska svar ASJ neuron till en extern elektriskt fält, och använder cameleon för att mäta den fysiologiska kalcium svaret på laserskada av en neuron. Dessa exempel visar fördelarna och nackdelarna med de två typerna av fluoroforer och illustrerar vad som är möjligt med systemet.

Protocol

1. Optisk inställning Använd en vanlig förening mikroskop med epifluorescens bildfunktioner. Vi använder en Nikon Eclipse Ti-U inverterat mikroskop med en Intensilight HG Illuminator. För bästa bild-och signalkvalitet använda hög förstoring, hög numerisk apertur mål. Vi använder vanligtvis en Nikon X60 1,4 NA oljeimmersionsobjektivet. I vissa fall är det möjligt att använda lägre förstoring (X40, X20) beroende på expressionsnivån av fluoroforen och signalstyrkan. Använd…

Representative Results

Här presenterar vi resultaten från två separata experiment. Den första utnyttjar GCaMP att mäta svaret hos en särskild sensorisk neuron till en definierad yttre stimulans, vilket ger ett bra exempel på hur fluorescerande kalcium reportrar kan användas för att optiskt övervaka neuronal aktivitet i intakt C. elegans. Den andra använder cameleon att mäta intracellulärt kalcium övergående visas inom en neuron som svar på specifika laserskada, vilket visar hur kalcium fysiologi kan mätas inom en end…

Discussion

Genetiskt kodade kalcium indikatorer har allmänt används i C. elegans neurobiologi. Många grupper har använt dessa tekniker för att studera svar av primära sensoriska neuroner på yttre stimuli såsom visas här med ASJ svar på ett elektriskt fält. Framträdande exempel inkluderar känsla av mekanisk beröring, specifika kemikalier, temperatur och ett elektriskt fält 12, 16-19. Aktiviteten av interneuron och muskelceller har också följts både som svar på stimuli och kontroll över djuren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Flera personer har bidragit till det arbete som beskrivs i detta dokument. CVG byggde experimentuppställning, och LS, SHK, och CVG utfört försöken. CVG och SHK skrev manuskriptet. Alla författare tog därefter del i översynen och godkände den slutliga kopian av manuskriptet. Vi tackar Paul Sternberg för GCaMP stammen. Vissa nematoder stammar som används i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). MATLAB bildanalysprogram anpassades från den som används i 18. Författarna stöddes av Boston University och Massachusetts Life Sciences Center.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Eclipse Ti-U inverted
microscope
Nikon    
Intensilight HG Illuminator Nikon C-HGFI Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil Nikon    
Optical table or 3’X3′ optical
grade breadboard
Thor Labs   If an optical table is not used an
optical grade breadboard on a
solid laboratory bench should
suffice.
Clara Interline Camera Andor
Technology
  High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission Chroma Technology
Corp.
41015 GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm Chroma D440/20x EX excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm
longpass
Chroma 455DCLP BS microscope dichroic for cameleon
imaging
Dichroic mirror > 515 nm
longpass
Chroma 515DCLP BS dichroic mirror for cameleon
imaging
Filter 535 +/- 15 nm Chroma D535/30m EM YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm Chroma D485/40m EM CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat Thor Labs AC508-200-A1 Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror Thor Labs ME2S-P01 FRET optics (2)
NGM buffer      
Levamisole Sigma    
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 08691-10, 2.5% by
volume, 50 nm
diameter
polystyrene nanoparticles for C.
elegans immobilization
Transgenic strain, Strain
gpa-9::GCaMP3(in pha-1;
him-5 bkg)
Sternberg Lab Strain PS6388  
Transgenic strain, mec-
4::YC3.60
Gabel Lab Strain CG1B  

References

  1. Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
  3. Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
  6. Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
  7. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
  8. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
  9. Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  10. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  11. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  12. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
  13. Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
  14. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  15. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
  16. Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
  17. Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
  18. Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
  19. Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
  20. Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
  21. Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).

Play Video

Cite This Article
Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. (74), e50357, doi:10.3791/50357 (2013).

View Video