मेजबान पैथोजन प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता के लैंडस्केप विशेषताएँ एक तुलनात्मक दृष्टिकोण
Summary
यह लेख मेजबान और दो orthogonal तरीकों का एक संयोजन का उपयोग रोगज़नक़ प्रोटीन के बीच उच्च आश्वस्त बातचीत डेटासेट की पहचान पर केंद्रित है: खमीर दो संकर एचटी-GPCA बुलाया स्तनधारी कोशिकाओं में एक उच्च throughput बातचीत परख द्वारा पीछा किया.
Abstract
महत्वपूर्ण प्रयास बड़े पैमाने पर व्यापक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के नक्शे उत्पन्न करने के लिए एकत्र हुए थे. इस रोगज़नक़ मेजबान रिश्तों को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और अनिवार्य रूप से खमीर दो संकर प्रणालियों में आनुवंशिक स्क्रीनिंग के द्वारा किया गया था. एक Gaussia luciferase आधारित टुकड़ा पूरक परख द्वारा प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के हाल ही के सुधार अब कड़ाई से सेलुलर कारकों में से एक आम सेट के खिलाफ विभिन्न रोगज़नक़ तनाव वेरिएंट से प्रोटीन की बातचीत प्रोफाइल की तुलना करने के लिए आवश्यक एकीकृत तुलनात्मक interactomic दृष्टिकोण विकसित करने का अवसर प्रदान करता है.
इस कागज विशेष रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डेटासेट उत्पन्न करने के लिए दो orthogonal विधियों के संयोजन की उपयोगिता पर केंद्रित है: खमीर दो संकर (Y2H) और एक नई परख, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रदर्शन उच्च throughput Gaussia princeps प्रोटीन पूरक परख (एच टी-GPCA).
NT के "एक रोगज़नक़ प्रोटीन की सेलुलर भागीदारों के> एक बड़े पैमाने पर पहचान कई रोगज़नक़ तनाव वेरिएंट का उपयोग कर सीडीएनए पुस्तकालयों की दो संकर चोकर संभोग आधारित खमीर द्वारा किया जाता है. एक उच्च आत्मविश्वास सांख्यिकीय स्कोरिंग पर चयनित बातचीत भागीदारों की एक सबसेट आगे है हिंदुस्तान टाइम्स-GPCA उपयोग कर रोगज़नक़ वेरिएंट प्रोटीन के पूरे सेट के साथ जोड़ी के लिहाज से बातचीत के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मान्य है. दो पूरक तरीकों का यह मिश्रण बातचीत डाटासेट की मजबूती में सुधार, और एक कड़े तुलनात्मक बातचीत के विश्लेषण के प्रदर्शन की अनुमति देता है. इस तरह की तुलनात्मक interactomics पढ़ना किसी भी रोगज़नक़ मेजबान interplays के लिए एक विश्वसनीय और शक्तिशाली रणनीति बनाते हैं.Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नक्शे उत्पन्न करने के लिए एकत्र डेटा की बढ़ती मात्रा आगे रोगज़नक़ संक्रमण को समझने के लिए दृष्टिकोण को खोलता है. रोगज़नक़ संक्रमण की वैश्विक समझ में उभरने के लिए शुरू होता है, यह मानव proteome 1 जोड़ने जब रोगजनकों प्रोटीन से प्रेरित perturbations की सीमा तक पहुँच प्रदान करता है. यह इस प्रकार रोगजनकों मेजबान सेल मशीनरी हेरफेर कैसे समझने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. विशेष रूप से, कई वायरल मेजबान बातचीत नेटवर्क की मैपिंग वायरल प्रोटीन अधिमान्यतया अत्यधिक (हब) सेलुलर नेटवर्क में जुड़े हुए हैं, या एक नेटवर्क (बाधाओं प्रोटीन) 2-4 में कई रास्ते के लिए केंद्रीय हैं कि मेजबान प्रोटीन है कि लक्ष्य का पता चला. इन मुलाकातों संक्रामक संतान दोहराने के लिए और निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो वायरस महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं. तुलनात्मक बातचीत मानचित्रण हाल ही के सापेक्ष जानकारी निकालने के लिए लक्ष्य के साथ संबंधित वायरस पर आयोजित की गईरोगजनन 4. इसके अलावा, मेजबान रोगजनकों बातचीत परिदृश्य की पढ़ाई कई रोगजनकों 5 के लिए बढ़ा दिया गया है. लक्षित सेल कारकों की पहचान की कोशिकाओं को संक्रमित करने के रोगजनकों द्वारा इस्तेमाल किया रणनीतियों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और संभावित रोगजनक मार्कर का पता लगाने की अनुमति देता है.
खमीर दो संकर प्रणाली आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के उच्च throughput मानचित्रण के लिए एक कुशल और संवेदनशील उपकरण है के बाद से बाइनरी बातचीत की पहचान करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीका है. दृष्टिकोण आगे इस प्रकार रोगज़नक़ मेजबान प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक तुलनात्मक अवलोकन करने के लिए पहुँच प्रदान करने, कई रोगजनकों तनाव वेरिएंट की एक प्रोटीन का आकलन करने से व्यक्ति Y2H भूसी को बेहतर बनाता है यहाँ का प्रस्ताव रखा. यह कुल बातचीत 6 के बारे में 20% ठीक हो जाए क्योंकि इसके अलावा, खमीर दो संकर स्क्रीनिंग के एक प्रमुख सीमा, एक उच्च झूठी नकारात्मक दर में निहित है. इस patho का केवल एक सबसेट से पता चला है कि बातचीत का तात्पर्यजेन्स वेरिएंट दूसरों के साथ पता लगाने बच सकता. इसलिए, सभी दो संकर भूसी से उभरते व्यक्ति भागीदारों आगे तुलनात्मक बातचीत डेटासेट प्रदान करने, अध्ययन उपभेदों की पूरी रेंज के साथ बातचीत के लिए चुनौती दी है. यह अलग तरीके के संयोजन दृढ़ता से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत डेटासेट 7 की मजबूती बढ़ जाती है कि प्रदर्शन किया गया था, इस मान्यता एचटी-GPCA 8 नामक एक नव विकसित प्रोटीन टुकड़ा complementation परख द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में किया जाता है. इस सेल आधारित प्रणाली Gaussia princeps के पूरक द्वारा प्रोटीन बातचीत का पता लगाने luciferase विभाजित है और एक उच्च throughput प्रारूप के साथ संगत होना करने के लिए डिजाइन किया गया है की अनुमति देता है. इसके luminescence आधारित प्रौद्योगिकी के लिए शुक्रिया और अपनी कम पृष्ठभूमि शोर अन्य प्रतिदीप्ति आधारित परख के साथ तुलना में, एच टी GPCA एक strikingly उच्च संवेदनशीलता दिखाता है.
कुल मिलाकर, इस दृष्टिकोण एक कुशल गठनअपहरण मेजबान सेल की वैश्विक समझ की ओर पहला कदम का प्रतिनिधित्व करता है जो मेजबान रोगज़नक़ interplays की एक व्यापक मानचित्रण, उत्पन्न करने के लिए उपकरण.
Protocol
Representative Results
Discussion
स्वतंत्र रूप से, खमीर दो ऐसे जीएसटी पुल से नीचे, Lumier या MAPPIT के रूप में संकर और स्तनधारी बातचीत assays है,, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए प्रभावी औजार साबित किया है, लेकिन झूठी सकारात्मक और झूठी नका?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम Institut पाश्चर से धन के द्वारा और लीग Nationale contre ले कैंसर (अनुदान R05/75-129 और RS07/75-75), एसोसिएशन डालना ला Recherche सुर ले कैंसर (/ अनुदान एआरसी A09 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया 1/5031 और 4867), और Agence Nationale डे ला Recherche (ANR07 माइम 009 02 और ANR09 चेहरे का भाव 026 01). एम.एम. एक MENRT फैलोशिप के प्राप्तकर्ता था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
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