Summary
Denna artikel fokuserar på identifiering av hög säker interaktion datamängder mellan värd och patogen proteiner med hjälp av en kombination av två ortogonala metoder: jäst två-hybrid följt av en hög genomströmning interaktion analys i däggdjursceller heter HT-GPCA.
Abstract
Betydande insatser har samlats för att skapa storskaliga omfattande protein-protein kartor interaktion nätverk. Detta är avgörande för att förstå patogen-värd relationer och var i huvudsak utförs av genetiska filmvisningar i jäst två-hybrid-system. Den senaste tidens förbättring av protein-protein växelverkan upptäckt av en Gaussia luciferas-baserad fragmentkomplettering analysen ger nu möjlighet att utveckla integrativa jämförande interactomic metoder som behövs för att noggrant jämföra Interaktionsprofilerna av proteiner från olika patogener stamvarianter mot en gemensam uppsättning av cellulära faktorer.
Denna uppsats fokuserar särskilt på nyttan av att kombinera två ortogonala metoder att generera protein-protein växelverkan dataset: jäst två-hybrid (Y2H) och en ny analys, hög genomströmning Gaussia princeps protein komplettering analys (HT-GPCA) utförs i däggdjursceller.
nt "är> En storskalig kartläggning av cellulära partners en patogen protein utförs av parning-baserade jäst två-hybrid screening av cDNA-bibliotek med flera varianter patogen stam. En delmängd av samverkande parter som valts på ett högt förtroende statistisk scoring är vidare validerats i däggdjursceller för parvisa interaktioner med hela uppsättningen av patogener varianter proteiner med HT-GPCA. Denna kombination av två kompletterande metoder förbättrar robustheten i samspelet dataset, och tillåter utförandet av en stringent komparativ interaktion analys. Sådana jämförande interactomics utgör en tillförlitlig och kraftfull strategi för att dechiffrera några patogen-värd samspelar.Introduction
Den ökande mängden data som samlas för att generera protein-protein växelverkan kartorna öppnar perspektiv för att ytterligare förstå patogena infektioner. Som global förståelse av patogener infektioner börjar dyka upp, det ger tillgång till olika störningar inducerade av patogener proteiner när du ansluter den mänskliga proteomet 1. Det finns därmed ett sätt att förstå hur patogener manipulera maskinen värdcellen. I synnerhet visade kartläggningen av flera virus-värd interaktioner nätverk som virala proteiner företrädesvis målvärden proteiner som är starkt kopplade i mobilnätet (hubbar), eller som är central för många vägar i ett nätverk (flaskhalsar proteiner) 2-4. Dessa interaktioner kan virus att manipulera viktiga cellulära processer, vilket är avgörande för att replikera och producera infektiös avkomma. Jämförande interaktioner kartläggning har nyligen genomförts på besläktade virus med målet att få fram information i förhållande tillpatogenes 4. Vidare har studier av värd-patogener interaktioner landskap utökats till många patogener 5. Målcellen faktorer identifiering ger insikter i de strategier som används av patogener att infektera celler och medger detektering av potentiellt patogena markörer.
Jästen två-hybrid systemet är den mest populära metoden för att identifiera binära interaktioner eftersom genetisk screening är ett effektivt och känsligt verktyg för high-throughput kartläggning av protein-protein interaktioner. Den metod som föreslås här ytterligare förbättrar enskilda Y2H filmvisningar genom att bedöma ett protein av flera patogener stamvarianter, vilket ger tillgång till en jämförande översikt av patogen-värd protein-protein interaktioner. Dessutom ligger en stor begränsning av jäst två-hybrid-screening i en hög falskt negativa takt, eftersom det återvinner cirka 20% av det totala interaktioner 6. Detta innebär att interaktioner detekterade med endast en delmängd av patogens varianter kan ha undgått upptäckt med de andra. Därför är enskilda partner dyker upp från alla två-hybrid filmvisningar ytterligare utmanas för interaktion med ett komplett sortiment av studerade stammar, som ger komparativa interaktion datamängder. Eftersom det visades att kombinera olika metoder kraftigt ökar robustheten av protein-protein växelverkan dataset 7, är denna validering utförs i däggdjursceller genom en nyutvecklad protein-fragmentkomplettering analysen heter HT-GPCA 8. Denna cell-baserade system möjliggör detektion av proteininteraktioner genom komplementering av Gaussia princeps split luciferas och har utformats för att vara förenliga med en hög genomströmning format. Tack vare dess luminiscens-baserad teknik och dess låga bakgrundsljud jämfört med andra fluorescens-baserad analys, visar HT-GPCA en påfallande hög känslighet.
Sammantaget utgör detta tillvägagångssätt en effektivverktyg för att generera en omfattande kartläggning av värdpatogen samspelar, vilket är det första steget mot en global förståelse av värdcellen kapning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Jäst två-hybrid Rastreringar
- Gör följande obligatoriska lösningar:
- Komplett Syntetiska Drop Out (SD): lös upp 26,7 g av minimal SD bas med glukos i 1 liter vatten. Tillsätt 2 g aminosyrablandning framställdes enligt följande: 2 g Adenin hemisulfat, 2 g Arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g isoleucin, 4 g leucin, 2 g lysin HCI, 2 g Metionin, 3 g Fenylalanin, 2 g L -serin, 2 L-Treonin g, 3 g tryptofan, 2 g Tyrosin, 1,2 g uracil, 9 g Valin.
- Selektiv Drop Out SD-L/-W/-H: SD innehåller alla viktiga aminosyror förutom de angivna (-L:-Leucin,-W:-tryptofan,-H:-histidin).
- YPGLU: För 1 L, vikt 10 g jästextrakt, 10 g baktopepton och 20 g glukos. Komplett med 25 g Bacto agar för fasta medier.
- YCM: Samma som YPGLU, men pH justerades till 4,5.
- Parning och sprida
- Använda frysta portioner av pre-transformed Y187 jäststammen (parningstyp α) innehållande ett cDNA-bibliotek klonat i pACT2. Kontrollera cellviabiliteten med plätering serieutspädningar på SD-L-plattor.
- Klon patogenen ORF in pGBKT7 vektor, och omvandla den rekombinanta plasmiden med hjälp av ett standardförfarande i AH109 jäststam (parningstyp a).
- Spread pGBKT7-transformerade AH109 jäst på SD-W plattor. Inkubera i minst två dagar 30 ° C i en fuktad inkubator. Plattorna kan lagras vid 4 ° C till dess att två-hybrid screening.
- Använd 3-aminotriazol (3-AT), en kompetitiv inhibitor av HIS3 enzymet, för att motverka den potentiella själv-transaktivering av HIS3-reportergenen av patogener "proteiner. Gör en automatisk aktivering test genom bestämning av koncentrationen av 3-AT, som förhindrar tillväxt av pGBKT7-transformerad jäst på SD-W/-H plattor.
- Seed 30 ml av SD-W med få kolonier av pGBKT7-transformerade AH109. Inkubera 30 timmar vid 30 ° C med rotation.
- Seed 200 ml SD-W med 30 mlav de AH109 kulturer. Inkubera med rotation runt 20 h vid 30 ° C.
- Inkubera tinade cDNA-bibliotek-transformerade Y187 i 20 ml YPGLU, inkubera 10 min vid 30 ° C med rotation.
- Centrifugera en volym av pGBKT7 transformerad-AH109 kultur motsvarande en ekvivalent mängd av livskraftiga Y187 jästceller i 5 min vid 3500 rpm vid 20 ° C. Försiktigt bort supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml YPGLU.
- Blanda den suspenderade AH109 jästen med Y187 innehållande bibliotek. Överföring i ett 50 ml rör. Centrifugera i 5 minuter vid 3500 rpm vid 20 ° C, dra försiktigt supernatanten (bräckliga pellet).
- Återsuspendera pelleten i YPGLU att få en total av 1,5 ml.
- Sprid jäst på 3 YCM-Agar 150 mm plattor, 0,5 ml / platta. Inkubera 4,5 h vid 30 ° C.
- Samla parade jäst från YCM plattor genom skrapning med en kratta glas i 10 ml SD-L/-W/-H. Skölj plattorna två gånger med 5 ml SD-L/-W/-H medellång och pool.
- Centrifugera 5 minuter vid 3500 rpm, 20° C. Kassera supernatanten och suspendera jästen pelleten i 5 ml SD-L/-W/-H mediet.
- Sprid paras jäst på 10 plattor (0,5 ml / platta) av SD-L/-W/-H Agar kompletterat med lämplig koncentration av 3-aminotriazol (3-AT) bestäms i auto-aktivering testet. Inkubera vid 30 ° C i en fuktig atmosfär under 6-10 dagar.
- Bestäm diploid (2n) takt för att utvärdera parning effektivitet genom att sprida 250 | il av serieutspädningar (10 -4 till 10 -6) hos parade jästsuspension på SD-L/-W plattor. Inkubera plattorna vid 30 ° C under två dagar. Räkna kolonierna odlade på SD-L/-W, och härleda det totala diploida antalet närvarande i den ursprungliga volymen av parade jäst. Rapportera det här diploida antalet till livskraftiga bibliotek innehållande jäst numret för att beräkna den diploida takt. Det skall variera runt 10-25%.
- 6-10 dagar efter inkubering vid 30 ° C, plocka parade jästkolonier i färsk SD-L/-W/-H + 3-AT plattor. [Tips: För jästen i en ordning med 8körfält av 12 brunnar återger en platta med 96 brunnar så att det blir lättare efteråt för sekvensering]. Låt jästkolonier växa under 4-5 dagar vid 30 ° C i en fuktad atmosfär.
- Screening av his3 positiva kloner genom PCR och sekvensering
Målet är att PCR-amplifiera den ORF som finns i de pACT2 vektorerna jästkolonier odlas på selektiva SD-L/-H/-W plattor.- Sätt en 96 väl PCR-plattan på is.
- För att lysera jästceller, tillsätt 50 | il per brunn av en Zymolase 20T-lösning (2,5 mg / ml i 10 mM HEPES-buffert pH 7,7).
- Försiktigt resuspendera en koloni per brunn.
- Inkubera 15 minuter vid 37 ° C och 15 minuter vid 95 ° C.
- Sätt plattan tillbaka på is. Lägg 50 il destillerat vatten per brunn. Blanda väl genom att pipettera upp och ned.
- Centrifugera i 5 minuter vid 3500 rpm och 4 ° C.
- PCR amplifiering 10 il att detektera en insats med hjälp av primers glödgning båda sidor av ORF härledda från cDNA i pACT2 vektorer. Protokollet är gftersom för amplifiering av 96 lyserade jästkolonier med ExTaq polymeras. Förbered följande mix: 525 pl 10X ExTaq buffert, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 pl Forward Primer (1 mikrogram / l), 10,5 pl Reverse Primer (1 mikrogram / l), 31,5 pl ExTaq (5 U / l ) och 3202,5 il H 2 0. Fördela 40 ul av blandningen per brunn i en 96-brunnars PCR-platta. Tillsätt 10 l av lyserat jäst per brunn. Utför amplifiering enligt följande: 94 ° C under 3 minuter, därefter 35 cykler vid 94 ° C under 30 sekunder, 60 ° C under 1 min, 72 ° C under 4 min, och avslutas med 72 ° C under 7 min. Körning 3 pl av PCR-produktema på en 1,2% agarosgel för att detektera PCR-positiva kloner. Observera att användning av pre-cast 96 väl agarosgeler rekommenderas.
[Tips: plattan kan lagras vid -20 ° C för ett par månader och återanvändas för nya PCR] - Sekvens PCR förstärkta fragment isolerade från HIS3 positiva kloner. Utför en BLAST-analys för att identifiera cellulära ORF. Låg-förtroende väglinjer (E värde >, 10 -10, identitet <80%, peptidlängd <20 aminosyror) kastas liksom frameshifted och förtida stoppkodonet innehåller sekvenser.
2. Matrix byggnad för HT-GPCA
HT-GPCA är en däggdjurscell-baserad analys där både patogen och värd proteiner uttrycktes övergående smält till komplementära fragment av den delade Gaussia princeps luciferas. Vid samverkan mellan parterna, är detta enzym bereds tillåta mått på dess enzymatiska aktivitet. Samspelet intensitet alltså härledas ur ett normaliserat Luminescence Ratio (se nedan och figur 1)
- Val av partner värdcellens
- Välj proteiner som identifieras mer än tre gånger i Y2H filmvisningar för ytterligare validering i däggdjursceller att öka datamängden förtroendet 9.
- Lägg kända samverkande partners av patogenen proteiner som positive kontroller.
- Överföring till HT-GPCA kompatibla vektorer
- Klon varje patogen protein ORF i en pSPICA-N2 vektor för att generera patogena proteiner med aminosyrorna 110-185 av de humaniserade Gaussia princeps luciferas sammansmälta vid sina N-terminal (GL2-patogen proteinfusioner).
- PCR förstärka cellulärt protein ORF direkt från Y2H positiva kloner eller från andra ORF resurser (Human ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) och överföra dem till pSPICA-N1 vektorer för att generera proteiner smält vid N-terminalen med aminosyrorna 18-109 av humaniserad Gaussia princeps luciferas (GL1-värd proteinfusioner).
[Tips: För storskalig kloning är Gateway kloning systemet rekommenderas. I så fall, för PCR-amplifiering, använder primers utformade för att innehålla Gateway kompatibla webbplatser]. - Sekvens alla expressionsvektorer. Sekvenser av den pSPICA-N1 och pSPICA-N2återfinns i referens 8.
Observera att plasmidkonstruktioner kan inverteras, dvs sjukdomsalstrande proteiner i pSPICA-N1 och värdprotein in pSPICA-N2.
Tre. Högkapacitet Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Komplettering analys (HT-GPCA)
- Cell Transfektion
- Seed 293T celler vid 350.000 celler / ml i DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS) utan antibiotika. Fördela 100 l / brunn i sterila vita odlingsplattor. Överskrid inte 10 plattor i ett enda experiment. Låt celler växa under 24 h vid 37 ° C med 5% CO2.
[Tips:. Eftersom pSPICA plasmider innehåller ett SV40, tillåter användning av 293T-celler deras replikation i transfekterade celler och därmed leder till överexpression av de två fragmenten luciferas] - Följande dag, transfektera celler med användning av vilken som helst lämplig transfektion protokollet. Observera att för vissa transfektionsreagens, den number av celler seedade kan behöva anpassas. Använd 100 ng per brunn av både den patogen och värd ORF plasmidkonstruktioner. Co-transfektera 10 ng per brunn i en av CMV-Eldflugeluciferas plasmid att normalisera för transfektion effektivitet. Varje punkt testas i triplikat.
[Tips:. DNA mixar kan utföras dagen före transfektion och lagrades vid -20 ° C med förslutning] - Överför transfektion mix till plattor av odlade 293T celler. Var noga med att försiktigt deponera DNA mix på cellerna, eftersom 293T är inte starkt vidhäftande och lätt lossnar från botten av brunnen. Inkubera i en cellkultur inkubator för 24-30 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Seed 293T celler vid 350.000 celler / ml i DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS) utan antibiotika. Fördela 100 l / brunn i sterila vita odlingsplattor. Överskrid inte 10 plattor i ett enda experiment. Låt celler växa under 24 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Cellys och Gaussia luciferas dosering
- Tvätta cellerna med PBS (100 pl / brunn). Tillsätt 40 l 1X buffert Renilla lys. Inkubera under 30 min vid rumstemperatur under omrörning.
- Spara 10 il cellysat i en annan vit plate för efterföljande dosering av Firefly luciferasaktiviteten. Förvara vid 4 ° C eller alternativt vid -20 ° C med tätning.
- Mät Gaussia aktiviteten på de återstående 30 ul av cellysater genom att tillsätta 100 ul Renilla luciferasanalys reagens och räknar luminiscens i 10 sekunder med en luminometer. Dosering av en 96 brunnars platta tar ungefär en halvtimme. Utför mätningen med färska cellextrakt eftersom frysning eller långtidslagring kan påverka interaktionen-medierad Gaussia aktivitet.
- Mätning av Firefly aktivitet
- Mät Firefly aktiviteten på den sparade 10 | il cellysat genom tillsats av 50 | il av Eldflugeluciferas analysreagens och räkning luminiscens i 10 sek. Dosering av en 96 brunnars platta tar ungefär en halvtimme. [Tips: Doseringen av Eldflugeluciferas kan utföras dagen efter den frusna lysates.]
- NLR Beräkningar
- Att övervaka samverkan, uppskatta ett normaliserat Luminescence Ratio (NLR) för varje patogen-värd paret. För att göra detta, dela upp den normaliserade Gaussia luminiscens aktivitet detekterades i närvaro av både patogen och proteiner värd med summan av de aktiviteter som uppmätts i kontroll brunnar (Figur 1 anpassad från referens 8). NLR cut-off värde för positiva interaktioner har uppskattats till cirka 3,5 8.
- Dataanalys
- Utför hierarkisk klustring med R statistik paketet. Först, grupp NLR data i kategorier, sedan beräkna en interaktion dendrogram med komplett koppling metoden. Visualisera dettadendrogram med JavaTreeView 10. Beräkna avståndet mellan interaktion dendrogram och fylogenetiskt träd med hjälp av en pearson korrelationskoefficient.
- För att skapa interaktion nätverk, väljer de positiva interaktioner från HT-GPCA dataset och använda Cytoscape programvaran 1. Extrahera grader för värdproteiner och rita deras distribution att komma åt nätverket lokala dynamiken. Host-patogener nätverk kan överlagras till värden interactome att ge en bedömning av de globala effekterna av patogener proteiner i den mottagande mobilnätet.
- Extrahera GO (Genontology) termer som förknippas med de riktade cellulära faktorer med David bioinformatik databasen 12 för att bedöma den funktionella anrikning av datamängden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stor styrka av HT-GPCA ligger i dess höga känslighet, vilket illustreras av bedömningen av falskt positiva och falskt negativa resultat för HPV E2-proteinet i figur 2 (anpassad från referens 13). För att bestämma den falskt negativa, var kända interaktioner av E2 från HPV16 bedömas av HT-GPCA (Figur 2A). Fyra av 18 interaktioner har inte återhämtat sig (motsvarande en 22% falskt negativa resultat). De falska positiva interaktioner uppmättes till 5,8% med användning av 12 HPV-E2-proteiner mot en slumpmässig uppsättning av cellulära proteiner (Figur 2B). Vidare är den starka metodens specificitet markerad i figur 2C visar att en enda punktmutation kända för att interferera med E2-bindning till dess cell partner BRD4 tillintetgör NLR-förhållande (figur 2C).
Denna storskaliga jämförande interactomic tillvägagångssätt har nyligen framgångsrikt tillämpats på tre tidig proproteiner av humant papillomvirus (HPV): E2, E6 och E7 med ursprung från olika genotyper representativa för HPV naturliga mångfalden i tropisms och patologier 13,14. För var och en av de tidiga proteinerna, hierarkisk klustring av Interaktionsprofilerna mestadels recapitulates HPV fylogeni, bevisar robustheten i tillvägagångssätt och relevansen av interaktion datamängder (Figur 3 anpassas från referenserna 13 och 14). Den kan användas för att korrelera specifika virus-värd interaktioner profiler med patologiska drag, och därmed ge ledtrådar om medverkan av virala proteiner i patogenes. Genotyp-specifika interaktioner kan utvinnas, vilket potentiellt motsvarar tropism eller patogena biomarkörer såsom visas i figur 4 för de E6-proteiner av HPV (figur 4 anpassat från referens 14).
Vidare kan funktionella insikter ur sådana storskaliga analyser. Till exempel i den interactomic studiet avHPV-E2-proteiner, den funktionella anrikning analys ledde till identifieringen av en framstående familj som består i cellulära transkriptionsfaktorer, i linje med den primära roll E2 som en viral transkriptionsregulator. Den avslöjade också en oväntad funktionell inriktning av den intracellulära människohandel maskiner, öppnar nya perspektiv för roll E2 i HPV patogenes 13.
Överlag är de jämförande interatomära studier utförda med HPV tidiga proteinerna kraftigt förbättra förståelsen av HPV patogenes genom att korrelera specifika interaktioner profiler fenotypiska skillnader.
Figur 1. Identifiering av protein-proteininteraktioner med HT-GPCA. Både patogen och värd proteiner är fuserade till en inactiv halvan av Gaussia princeps luciferas (GL2 och GL1 delar, respektive). När proteinerna interagerar, är en luciferasaktiviteten framkallad av närheten av de båda halvorna av enzymet. Den restaurerade Gaussia luciferasaktivitet beräknas utifrån en normaliserad Luminescence Ratio (NLR) som visas till höger. Figur anpassad från referens 8. Klicka här att visa en större bild .
Figur 2. HT-GPCA egenskaper. (A) 18 interaktioner extraherats från litteraturen inbegriper E2-proteinet från HPV16 och cellulära proteiner testades genom HT-GPCA för att uppskatta den falska-negativa som är associerad med denna t echnique. NLR förhållande representeras som en färg gradient (värme map) med en skala från svart (ingen interaktion) till ljusblå (stark växelverkan). Fyra kända interaktioner har inte återhämtat sig (röda pilar) ger en grov uppskattning av falskt negativa ränta runt 22%. (B) 12 HPV E2-proteiner testades med 10 slumpmässigt utvalda cellulära proteiner, motsvarande a priori negativa interaktioner, för att bestämma den falska positiva hastigheten för HT-GPCA, som scored omkring 5,8%. (C) Samverkan mellan det BRD4 cellulära proteinet och HPV16 eller HPV18 E2-proteiner är känd för att bero på aminosyrorna I73 och I77 respektive. När dessa aminosyror är muterade, sjunker HT-GPCA NLR med en 5-tiden minskning visar en hög specificitet för att upptäcka interaktioner. Figur anpassad från referens 13. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Jämförelse mellan experimentella interaktion-baserade dendrograms och HPV fylogenetiska träd. Fylogeni HPV bygger på tidiga proteinerna E2 (A), E6 (B) eller E7 (C) sekvenser representeras till vänster på varje graf. Interaktion dendrograms erhölls genom hierarkisk klustring av Interaktionsprofilerna av varje protein och finns representerade på den högra. En betydande kongruens observerades mellan de båda trädslag, med liknande kluster av patologiska typer (färgade rektanglar), styrker relevansen av interaktionen datamängder. Figur anpassad från referenserna 13 och 14. Klicka här för att se större bildure.
Figur 4. Schematisk representation av de E6 viktigaste cellulära mål. Cellulära mål sorterades utifrån samspelet intensitet och grupperade enligt interagerande HPV-typ. Denna representation möjliggör identifiering av specifika biomarkörer såsom FADD, som interagerar endast med E6 proteiner av onkogen HPV. Sådan inriktning ska vara avgörande för den cancerframkallande drag av alla onkogen HPV och utgör därmed en bra kandidat som kan användas antingen som ett surrogat markör för HPV-infektion eller som ett terapeutiskt mål. Figur anpassad från referens 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oberoende, jäst-två hybrid och däggdjur interaktion analyser, såsom GST pull-down, Lumier eller MAPPIT, har visat sig vara effektiva verktyg för att upptäcka protein-protein interaktioner, men begränsas av den höga andelen falskt positiva och falskt negativa interaktioner förknippade med dessa tekniker 15. Dessutom bevisar växer att kombinera ortogonala metoder ökar tillförlitligheten av den erhållna interaktionen dataset 7. Den senaste utvecklingen av HT-GPCA teknik som beskrivs här har inte bara förbättrat känsligheten för detektion av binära protein-protein interaktion i däggdjursceller, men har också erbjudas möjlighet att hantera en stor mängd interaktioner på en gång.
Strategin beskrivs här förbättrar täckningen av enskilda Y2H filmvisningar genom sondering interaktioner av flera stamvarianter. Dessutom testa om interaktioner med en ortogonal detektering metod ger stränga jämförande interaktionning datamängder, genom att övervinna begränsningar och flyr artefakter inneboende till två-hybrid metod. I själva verket, eftersom HT-GPCA sker i däggdjursceller, de post-translationella modifieringar och naturlig subcellulär lokalisering av proteinerna är opåverkade. Vår metod kan därför producera ett enda kartor steg interaktion som är förbättrade jämfört med dem i första hand baserade på jäst två-hybrid för interaktion avkänning 4.
Vid denna punkt även om, skulle vi rekommenderar att vara försiktig när man studerar trans-membranproteiner, eftersom detektion av interaktioner kan bero på lokaliseringen av de Gaussia fragmenten på vardera sidan av membranet. I dessa fall kan det vara nödvändigt för att smälta Gaussia fragmenten i den C-terminala änden av en eller båda parter. Dessutom skulle den luciferasuttryck påverkas av talrika parametrar såsom transfektionseffektivitet och cellantal. Därför rekommenderar vi starkt follgrund av normalisering som beskrivs i protokollet avsnittet för att ta hänsyn till experimentella variationer.
Genom att använda ordnade arrangemang av ORF tagna från den ökande samling av mänskliga ORFeome, förutser vi en punkt i en nära framtid där HT-GPCA kan användas direkt som en screeningmetod. Det första bör drastiskt förbättra screening täckning eftersom varje protein paren skulle sedan testas, och andra, bör det underlätta automatisering. Bör dock en mer drastisk hög genomströmning utbyggnad av denna analys tas genom utveckling av ett in vitro HT-GPCA analysen med expression in vitro system baserade på humana cell extrakt. Detta bör även göra det möjligt att övervaka protein-protein-interaktioner i en kontrollerad biokemiska omgivningen.
Slutligen, är kommande utvecklingen förväntas förbättra visualisering av komplexa-medierad luminiscens i levande celler. I så fall kunde HT-GPCA varaanvänds för att detektera dynamiska interaktioner i samband med tillsättningen av droger eller komplexa hämmare vilket möjliggör live-övervakning av avbrott i en interaktion.
Sammantaget utgör detta tillvägagångssätt en effektiv disposition för eventuella studier av patogen-värd samspel och vi känner att jämförande interactome analyser kan ge en stabil ram för att förstå mikrob kapningen av värdceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av medel från Institut Pasteur och genom bidrag från Ligue nationale contre le Cancer (bidrag R05/75-129 och RS07/75-75), Association pour la Recherche sur le Cancer (bidrag ARC A09 / 1/5031 och 4867), och den Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 och ANR09 MIEN 026 01). MM var en mottagare av ett MENRT gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
