Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

Intercellulaire Ca

Abstract

Intercellulaire communicatie is essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen tussen cellen in diverse organen en weefsels zoals de hersenen, lever, retina, cochlea en vaatstelsel. In experimentele opstellingen, intracellulaire Ca2 +-golven worden opgewekt door een mechanische prikkel een enkele cel. Dit leidt tot de afgifte van de intracellulaire signalerende moleculen IP3 en Ca2 + die de voortplanting van de Ca 2 +-golf inleiding concentrisch van de mechanisch gestimuleerde cel om de naburige cellen. De belangrijkste moleculaire pathways die intercellulaire Ca2 +-golven controle worden geleverd door gap junction kanalen via de rechtstreekse overdracht van IP-3 en door hemikanalen door het vrijkomen van ATP. Identificatie en karakterisering van de eigenschappen en de regelgeving van de diverse connexin en pannexin isovormen als gap junction kanalen en hemikanalen zijn toegestaan ​​door de quantification van de verspreiding van de intercellulaire Ca 2 +-golf, siRNA, en het gebruik van remmers van gap junction kanalen en hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca2 +-golf in monolagen van primaire corneale endotheliale cellen met Fluo4-vm in antwoord op een gecontroleerde en gelokaliseerde mechanische stimulus veroorzaakt door een acuut en kortdurend vervorming van de cel te meten als gevolg het aanraken van de celmembraan met een micromanipulator gecontroleerde glazen micropipet met een tip diameter van minder dan 1 urn. Ook beschrijven de isolatie van primaire boviene corneale endotheelcellen en het gebruik ervan als modelsysteem voor Cx43 hemichannel activiteit uitoefent als de aangedreven kracht intracellulaire Ca 2 +-golven door het vrijkomen van ATP. Tenslotte bespreken we het gebruik, voordelen, beperkingen en alternatieven van deze werkwijze in het kader van gap junction kanaal en hemichannel onderzoek.

Introduction

Intercellulaire communicatie en signalering zijn essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen in reactie op extracellulaire agonisten op weefsel en hele-orgaan level 1,2. De meest directe manier intercellulaire communicatie wordt door het optreden van gap junctions. Gap junctions zijn plaquettes van gap junction kanalen, die eiwitachtige kanalen gevormd door de head-to-head couperen van twee connexine (Cx) hemichannels van aangrenzende cellen 3,4 (figuur 1) zijn. Gap junctions doorlaten kleine signaalmoleculen met een molecuulgewicht van minder dan 1,5 kDa, zoals Ca2 + of IP 3 5, waardoor modulerende Ca2 +-afgifte uit de intracellulaire opslagplaatsen van de naburige cellen 6 (figuur 2). Gap junction kanalen zijn strak gereguleerd door intra-en intermoleculaire eiwit interacties en door cellulaire signalering processen, zoals redox wijziging enfosforylering 7. GJS vergemakkelijken de gecoördineerde respons van de aangesloten cellen, waardoor die als een chemische en elektrische syncytium. Bijvoorbeeld, de verspreiding van cardiale actiepotentiaal in de atriale en ventriculaire myocyten wordt gemedieerd door Cx-based GJ kanalen 85. Cxs niet alleen een rol van gap junction kanalen, maar ook vormen ongepaarde hemichannels, daardoor functioneren als kanalen in membranen eveneens regelmatig ionenkanalen 8-10 (Figuur 1). Hemichannels deelnemen aan paracrienen tussen naburige cellen door het regelen van de uitwisseling van ionen en signaalmoleculen tussen de intra-en extracellulaire milieu.

In veel celtypen (zoals epitheelcellen, osteoblasten, astrocyten, endotheelcellen, enz.) en organen (zoals de hersenen, de lever, de retina, cochlea en het vaatstelsel), intercellulaire Ca2 +-golven zijn fundamenteel voor de coördinatie van meercellige reacties Ca2 + niveaus in een bepaalde cel zijn niet beperkt tot deze cel, maar doorgeven aan de omringende naburige cellen is, zodat de intracellulaire Ca 2 +-wave 12,13. Deze intercellulaire Ca2 +-golven zijn belangrijk voor de normale fysiologische regulering cellagen als syncytia en de dysregulatie is geassocieerd met pathofysiologische processen 11. In de hoornvliesendotheel en epitheel, verschillende groepen 14-24, inclusief onze eigen 25-33, bestudeerde de mechanismen en de rol van intercellulaire communicatie. In niet-exciteerbare cellen, zoals corneale endotheelcellen, twee verschillende modi van intercellulaire communicatie plaatsvinden 28,29, namelijk spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie. Spleetovergangen intercellulaire communicatie impliceert een directe uitwisseling van signaalmoleculen via gap junctions 7. Gap juncnale intercellulaire communicatie is van cruciaal belang voor het behoud van weefsel homeostase, het regelen van celproliferatie, en de oprichting van een gesynchroniseerde reactie op extracellulaire spanning 10,34,35. In een aantal pathologieën, wordt gap junction koppeling verminderd als gevolg van gebrekkige Cxs, en hierbij van invloed spleetovergangen intercellulaire communicatie 36. Dit benadrukt het belang en de invloed van spleetovergangen intercellulaire communicatie in meercellige organismen. In tegenstelling tot spleetovergangen intercellulaire communicatie paracriene intercellulaire communicatie is niet afhankelijk van cel-cel bijstelling, omdat impliceert de diffundeerbare extracellulaire messengers (figuur 2). Verschillende soorten signaalmoleculen worden uitgebracht in de extracellulaire ruimte door signalering cellen. Het molecuul wordt dan naar de doelcel, waar het wordt gedetecteerd door een specifiek receptoreiwit. Vervolgens wordt het receptor-complex signaal induceert een cellulaire reactie diewordt beëindigd door verwijdering van het signaal, inactivering of desensibilisatie. Uitgebracht lipofiele extracellulaire signalen boodschappers penetreren het membraan en handelen op intracellulaire receptoren. Daarentegen hebben hydrofiele boodschappers niet over de plasmamembraan van de reagerende cel, maar fungeren als een ligand dat bindt aan het oppervlak tot expressie gebrachte receptor eiwitten, die doorzenden het signaal naar de intracellulaire omgeving. Drie belangrijke families van celoppervlak receptor-eiwitten aan dit proces: ionkanaal-gekoppelde, enzyme-linked, en G eiwit-gekoppelde. De vrijgegeven boodschappermolecule kan handelen receptoren van dezelfde cel (autocriene) op doelwitcellen in de nabijheid (paracriene) of op verre doelcellen die de bloedsomloop (endocriene) vereist.

In vele celtypen, waaronder corneale endotheel 28,29, ATP is een van de belangrijkste hydrofiele, paracriene factoren die de voortplanting van intracellulaire Ca2 +-golven 37-40 drijven. During mechanische vervorming, hypoxie, ontsteking of stimulatie door verschillende agenten, kan ATP uit gezonde cellen 41-44 worden uitgebracht in reactie op shear stress, rek, of osmotische zwelling 44,45. Verschillende ATP-afgifte mechanismen geopperd, zoals vesiculaire exocytose 44 en een veelheid van transportmechanismen, zoals ATP-bindende cassette (ABC) transporters, plasmalemmal spanningsafhankelijke anion kanalen 46, P2X7 receptor kanalen 47,48, alsmede connexin hemichannels 49-52 en pannexin hemikanalen 43,49,53. Extracellulair ATP kan snel gehydrolyseerd ADP, AMP en adenosine 54,55 door ectonucleotidases die in het extracellulaire milieu. Het extracellulair vrijgegeven ATP en zijn metaboliet ADP 56 zal verspreiden via diffusie. De daaropvolgende interactie van deze nucleotiden purinerge receptoren in de naburige cellen is betrokken bij de propagation van intercellulaire Ca2 +-golven 28,37,51. Twee verschillende klassen van purinerge receptoren aanwezig zijn: adenosine is de voornaamste natuurlijke ligand voor P1-purinoceptoren, terwijl zowel purine (ATP, ADP) en pyrimidine (UTP, UDP) nucleotiden handelen meeste P2-purinoreceptoren 57.

Intercellulaire communicatie kan worden onderzocht door verschillende methoden, zoals schrapen loading, kleurstofoverdracht, lokale uncaging van agonisten zoals IP3 en Ca 2 +, mechanische stimulatie enz.. Hier beschrijven we de studie van Ca 2 +-golven opgewekt door mechanische stimulatie van een enkele cel. Het voordeel van het bestuderen van Ca 2 +-golven door mechanische stimulatie is dat het een eenvoudig hulpmiddel om de verspreiding van de Ca 2 +-golf in de tijd te kwantificeren en geeft kwantitatief vergelijken van verschillende voorbehandelingen van de cellen. In het corneale endothelium, die intracellulaire Ca 2 +-golven kunnen een cogecoördineerd antwoord van de monolaag, wordt als een mogelijke afweermechanisme van de niet-regeneratieve corneale endotheel helpen het endotheel aan extracellulaire spanningen tijdens intraoculaire chirurgie weerstaan, of na blootstelling aan ontstekingsmediatoren bij afstoting of uveitis 58,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolatie van corneale endotheelcellen

Voordat u begint: Isoleer de cellen van de frisse ogen, verkregen uit een lokaal slachthuis, zo spoedig mogelijk na enucleating het oog. Zorg ervoor dat het oog werd enucleated uit een koe van maximaal 18 maanden oud zijn, vijf minuten post mortem en bewaard in Earle's Balanced Salt Solution - 1% jodium oplossing bij 4 ° C voor het transport naar het laboratorium.

  1. Neem het oog uit het Earle's Balanced Salt Solution - 1% jodium-oplossing en plaats deze in een petrischaal (100 x 20 mm).
  2. Steriliseer het oog met een oplossing die 70% ethanol en spoel met Earle's gebalanceerde zoutoplossing bevattende 1% jodium.
  3. Vanaf deze stap over, werken in een steriele kap. Ontleden voorzichtig het hoornvlies van het oog en plaats deze in een petrischaal (35 x 10 mm) met Earle's Balanced Salt Solution, de epitheliale cellaag naar boven. Verwijder zorgvuldig alle resterende irisweefsel still indien nodig aan de cornea.
  4. Breng de cornea andere Earle's Balanced Salt Solution bevattende petrischaal met de endotheliale cellaag omhoog en spoel tweemaal met Earle's Balanced Salt Solution.
  5. Breng het hoornvlies met de endotheellaag naar boven in een zandloper, een komvormig schotel, en bedekken met groeimedium. Het groeimedium bestaat uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium bevattende 25 mM glucose, 10% foetaal runderserum, 6,6% L-glutamine, 2,5 ug / ml amfotericine-B en 1% antibioticum-antimycoticum mengsel dat 10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B.
  6. Verwijder het medium een ​​zuigkracht pipet.
  7. Breng 300 pi van een trypsine-oplossing (0,5 g / L) de endotheliale laag van het hoornvlies (alle stappen die trypsine bevatten worden door met dezelfde concentratie).
  8. Plaats de zandloper met het hoornvlies in een overdekte petrischaal en zet het in de incubator gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Voorzichtig schrapen de endotheelcellen uit de buurt van het hoornvlies met een brand-gepolijste haakvormige glas Pasteur pipet in een steriele kap.
  10. Zuigen uit de oplossing die de endotheelcellen toevoegen aan kolven (25 cm2) met 4 ml kweekmedium.
  11. Breng 300 pi groeimedium aan het hoornvlies en herhaal het schrapen en voeg de oplossing die de endotheelcellen aan de kweekkolf.
  12. Herhaal deze laatste stap (1.11) eens te meer.
  13. Plaats de cultuur kolven met de corneale endotheelcellen in het groeimedium in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  14. Na twee dagen, voeg 6 ml kweekmedium.
  15. Vernieuw het groeimedium elke tweede dag.

2. Celkweek

  1. Verwijder het kweekmedium en twee keer was de cellen met Earle's Balanced Salt Solution, wanneer confluentie bereikt is (binnen about 10 dagen na isolatie).
  2. Voeg 1,5 ml trypsine oplossing om de cellen om ze los door de kolf in de incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 3 tot 4 min.
  3. Voeg 12 ml groeimedium. Pipetteer de middellange drie keer in en uit om de cellen te verspreiden en tel de cellen.
  4. Zaad van de cellen met een variabele fractie afhankelijk van de celdichtheid en zet ze in de couveuse. Bereid twee goed-kamer slides (met een oppervlakte van 4,2 cm 2) met een celgetal van 165.000 cellen (celdichtheid 39.286 per cm 2). Bereid 80 cm2 cultuur flessen een nieuwe passage in een dichtheid van 6.250 per cm2, door vers kweekmedium tot een totaal volume van 25 ml.
  5. Vernieuw het medium om de twee dagen.
  6. Confluentie van de cellaag wordt bereikt na 3 tot 4 dagen. Gebruik cellen voor experimenten.
  7. Wanneer confluentie van de cellaag in de kolven wordt bereikt, herhaalt u de stappen 2,1-2,6. Celculturen tot passage 2 kan worden fof experimenten.

3. Mechanische stimulatie voor Inducerende Calcium Wave

  1. Plaats de cellen in de chambered dia met 10 pM Fluo-4:00 in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
  2. Verwijder de TL 4:00 oplossing was de cellen vijf keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing, incubeer de cellen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing en laat de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur vóór de meting.
  3. Excite bij 488 nm met Argon laser en gebruik beam splitter HFT 488, het verzamelen van de fluorescentie-emissie bij 530 nm met behulp van een longpass emissiefilter LP 505, stellen de pinhole op minimum. Gebruik een olie-immersie 40X objectief (Air, 1.2 NA). In experimenten met ARL-67156, gebruik dan een 10X objectief (Air, 0.3 NA).
  4. Zoeken naar een veld waarin de cellen confluent de confocale microscoop.
  5. Plaats de pipet zodat deze op 45 ° ten opzichte van de chambered glijbaan en aanraken van de celmembraan.Leiden tot een korte (≈ 1 sec) mechanische stimulatie van een enkele cel. De mechanische stimulatie bestaat uit een acuut en kortdurend vervorming van de cel door kort minder dan 1% van het celmembraan aanraken met een glazen micropipet (tip diameter <1 pm) gekoppeld met een piëzo-elektrisch kristal nanopositioner, bediend via een versterker die gemonteerd op een micro-manipulator. De glazen micropipetten zijn gemaakt met een micro-elektrode trekker. Zorg ervoor dat de nanopositioner wordt bediend door een spanning tussen 0,2 en 1,5 V tijdens de mechanische stimulatie. Een spanning lager dan 1,5 V kunnen tot celbeschadiging. Voor elk type cel en conditie, moet de optimale spanning voor mechanische stimulatie zonder beschadiging van cellen zorgvuldig worden bepaald door toepassing van een reeks spanningen vanaf laag (0,2 V) naar hoog (1,5 V) spanning. De spanning is een maat voor de kracht van de stimulatie aangezien deze spanning bepaalt de mechanische spanning en spanning die worden toegepast op de celmembraan. Dewerking van de mechanische stimulatie kan worden berekend door de mechanische spanning te vermenigvuldigen met het gebied. Aangezien zowel de omgeving (<3,14 um 2) en de spanning zeer laag, de kracht van de mechanische stimulatie laag. (Merk op dat wanneer een cel wordt beschadigd, de fluorescentie lekt uit de cel en de cel wordt donker.)
  6. Meet ruimtelijke veranderingen in [Ca 2 +] i na mechanische stimulatie met de confocale microscoop.
  7. Verzamelen en opslaan van afbeeldingen.
  8. Teken een veelhoekig gebied van belang de totale oppervlakte van reagerende cellen (actief gebied AA) met de software van de confocale microscoop definiëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties en het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van het dier zorg en gebruik commissie van de KU Leuven.

In runder corneale endotheelcellen (BCEC) worden functionele gap junctions expressie en beide spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie aanzienlijk bijdragen aan intercellulaire communicatie op een interactieve manier, maar de belangrijkste route is aangetoond dat de paracriene intercellulaire communicatie route via zijn ATP-afgifte via Cx43 hemikanalen 28,29. ATP en ADP zijn gehydrolyseerd tot monofosfaat (AMP) adenosine door ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfaat diphosphohydrolase 1, CD39 diphosphohydrolase ATP) en vervolgens door de adenosine 5'-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP en ADP bijdragen totde Ca 2 +-golven door te binden aan P2Y1 en P2Y2 receptoren 28,29. Beide receptoren paar om PLC via Gq en daarmee IP roepen 3-geïnduceerde Ca 2 +-release (Figuur 2). In BCEC, de stimulatie van de purinerge P2Y receptoren leidt tot een snelle stijging van [Ca 2 +] i, dat ongevoelig voor de verwijdering van [Ca 2 +] o 60. [Ca 2 +] i opgewekt door pieken agonist stimulatie wordt gevolgd door een [Ca 2 +] i afname die kan leiden tot een stabiele, agonist-afhankelijke verhoging, [Ca 2 +] o-afhankelijke fluctuaties oscillerende of een terugkeer naar de basislijn 60-62. In BCEC, is er bewijs dat de Ca 2 +-afgifte gebeurt via een route met PLC-en IP-3 29. Legen van de IP3-gevoelig winkels leidt tot een eerste piek in [Ca 2 +] i, vervolgens gevolgd door een capacitative Ca2 +-influx leidt tot het ontstaan ​​van de plateaufase 63.

Mechanische stimulatie leidt tot een snelle aanvankelijke stijging van Ca2 + die afkomstig is van de punt van de stimulatie en vervolgens verspreidt door de cel mechanisch gestimuleerd. Tenslotte, de intracellulaire Ca2 +-niveaus verminderen langzaam terug naar het basisniveau. Bij het ​​bereiken van de cel grenzen, de intercellulaire Ca2 +-voortplant naar de omringende naburige cellen (NB) op een golfachtige wijze als Ca2 +-voorbijgaande, dat vervalt op basisniveau (Figuur 3). In controle-omstandigheden, Ca 2 +-transiënten waargenomen tot ongeveer 4-8 cellagen van het mechanisch gestimuleerde cellen (figuur 3). De lijngrafiek (aan de rechterzijde van de panelen in figuur 3) toont het tijdsverloop van de Ca 2 +-transiënten (weergegeven als genormaliseerde fluorescentie (NF) waarden) inhet mechanisch gestimuleerde cel en in de naburige cel lagen 1-5 (NB1, NB2, NB3, NB4 en NB5). Uit figuur 3 blijkt dat de genormaliseerde fluorescentie afneemt, terwijl de vertraging van het begin van [Ca 2 +] i-rise toeneemt met toenemende afstand van de mechanisch gestimuleerde cel. De maximale genormaliseerde fluorescentie in het mechanisch gestimuleerde cel werd bereikt in 0.95 ± 0.04 sec. Na het bereiken van een maximale genormaliseerde fluorescentie waarde, de genormaliseerde fluorescentie vertoonde een zeer geleidelijk en langzaam verval, terug naar de basiswaarde 152 ± 6 seconden na het aanbrengen van de stimulus 25.

Remming van de paracriene intercellulaire communicatiepad door een combinatie van exogene apyrase VI (5 U / ml gedurende 30 min) en apyrase VII (5 U / ml gedurende 30 min) veroorzaakte een 7,5-voudige verlaging in het gebied waarop de Ca2 +-golf, de zogenaamde actieve gebied (AA, p <0,001, N = 7, N = 35) (figuur 4A). Apyrase is bekend dat ATP en ADP hydrolyseren. Apyrase VI heeft een hoge ATPase / ADPase verhouding en apyrase VII voorkeur hydrolyseert ADP 56.

Aangezien paracriene intercellulaire communicatie in het corneale endotheel hoofdzakelijk gebeurt door ATP release, 28,29 en ATP wordt gehydrolyseerd in de extracellulaire ruimte door ectonucleotidases, bekend worden uitgedrukt in het corneale endothelium, 29,64,65 we het effect onderzocht van AA in omstandigheden waar ATP hydrolyse wordt geremd met behulp ectonucleotidase remmers. Remming van ectonucleotidases met ARL-67156 (ARL, 100 uM gedurende 30 min) resulteerde in een sterke verhoging van de Ca 2 +-golven, zoals eerder is aangetoond in BCEC 25,26,28,29. De blootstelling van BCEC aan Arl veroorzaakte een 3,5-voudige toename van de AA vergeleken toestand (P <0,001, n = 12, n = 60) te regelen (figuur 4B).

In prevoorgaande studies in ons laboratorium connexine mimetische peptiden (Gap26 en Gap27, tabel 2) werden gebruikt om de relatieve bijdrage van spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie kunnen onderscheiden intracellulaire Ca 2 +-golven na mechanische stimulatie met een inactieve peptide ( tabel 2) als een controle 28,29.

Remming van gap junction kanalen met Gap27 verminderde significant de propagatie van de Ca 2 +-golf in BCEC 30. De AA was significant verminderd na voorbehandeling met Gap27 (300 uM gedurende 30 min) (P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabel 1). Remming van connexine hemikanalen met connexine-mimetisch peptide Gap26 28,30 significant de propagatie van de Ca 2 +-golf in BCEC 28. De AA was significant verminderd na voorbehandeling met Gap26 (300 uM gedurende 30 min)(P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabel 1).

We toonden ook aan dat het 43-kDa Cx isovorm was een hoofdbestanddeel grondslag liggen aan de hemikanaal-gemedieerde ATP release die intercellulaire Ca2 +-golven provoceert. Met behulp van twee onafhankelijk gemaakt siRNA moleculen richten Cx43, vonden we dat de AA werd verminderd met ongeveer 65% 33 (tabel 1). Dit werd verder ondersteund door experimenten met TAT-L2 (100 uM, 30 min), een cel-permeabele peptide overeenkomend met de tweede helft van de intracellulaire lus van Cx43 (tabel 2), dat een belangrijke vermindering van AA (P <0,001 uitgelokt , N = 3, n = 30) (Tabel 1). Belangrijk is dat deze vermindering van AA door TAT-L2 incubatie niet waargenomen in de afwezigheid van paracrienen, het concept ondersteunt dat TAT-L2 remt selectief Cx43 hemikanalen maar niet gap junction kanalen 33. Bovendien kan een inactieve TAT-L2 mutant (TAT-L2 H126K/I130N) kan worden gebruikt als een controle (tabel 2).

Figuur 1
Figuur 1. Vorming van gap junction kanalen en hemikanalen: schematische voorstelling. A. Een connexine of pannexin hemichannel wordt gevormd wanneer zes connexines of pannexines, dat vier transmembraan-domein-bevattende eiwitten, radiaal rond een centrale porie. Hemichannels zijn in de plasmamembraan. Ze kunnen uit identieke eiwit subtypes (homomere hemichannels) of ze kunnen bestaan ​​uit verschillende eiwitten subtypes, wanneer twee of meer isovormen in dezelfde cel (heteromere hemichannels). Een homotypische gap junctie kanalen resulteert uit het couperen van twee identieke homomere of heteromere hemichannels. Een heterotypische gap junctie kanalen resultaten van de docking van twee verschillende homomere of heteromere kanalen. B. Schematische structuur van connexine en pannexin gap junction kanalen verbinden van twee aangrenzende cellen en hemikanalen.

(Gedeeltelijk gewijzigd van 66)

Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, en Bernard Himpens. Pannexines, verre verwanten van de connexine familie met specifieke cellulaire functies. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. In niet-exciteerbare cellen, in hettercellular Ca 2 +-golven betreft zowel spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie. Bij mechanische stimulatie van een enkele cel, een Ca2 +-stijging optreedt in het mechanisch gestimuleerde cellen (MS) via Ca2 +-influx en / of Ca 2 +-release. Vervolgens, de Ca 2 +-rise voortplant vanaf de mechanisch gestimuleerd om de naburige cellen (NB) als intercellulaire Ca2 +-golf. De intercellulaire voortplanting omvat twee mechanismen, namelijk spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracrine intercellulaire communicatie. In spleetovergangen intercellulaire communicatie, een directe uitwisseling van een mediator (IP 3 en / of Ca 2 +) optreedt tussen de cytoplasma's van naburige cellen via gap junctions (GJS). In paracrine intercellulaire communicatie, wordt een boodschapper (bijv. ATP) vrijgelaten in de extracellulaire ruimte, waardoor op receptoren op the oppervlak van naburige cellen. Hemichannels (HC's) of andere mechanismen bemiddelen deze ATP-versie (zie tekst). Ectonucleotidases hydrolyseren ATP naar ADP en AMP. ATP en ADP handelen op P2Y en / of P2X receptoren op naburige cellen. (Genomen uit 66.)

Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, en Bernard Himpens. Pannexines, verre verwanten van de connexine familie met specifieke cellulaire functies. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays.

Figuur 3
Figuur 3. Calcium golfvoortplanting in controle omstandigheden in BCEC. Mechanische stimulatie geïnduceerde calcium transiënten worden getoond op verschillende tijdstippen in controle omstandigheden in BCEC door de vertegenwoordiger van pseudo-gekleurde fluorescentie beelden. De fluorescence intensiteiten voordat stimulatie worden getoond in de eerste afbeelding. De witte pijl in het tweede beeld identificeert de mechanisch gestimuleerde cel. De calcium voortplant tot zes naburige cel lagen met een totale oppervlakte van cellen bereikt door de golf (actief gebied: AA) van 62.870 um 2.

Het rechter paneel aan de lijn grafieken toont het tijdsverloop van de genormaliseerde fluorescentie waarde (NF) in het mechanisch gestimuleerde cel (MS) en de gemiddelde waarde van NF in de naburige cellen (NB) lagen 1 tot 5 (NB1 naar NB5). (Gedeeltelijk gewijzigd van 25.)

Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in Investigative Ophthalmology en Visual Science. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, en Bernard Himpens. Trombine remt intercellulaire calcium golfvoortplanting in corneale endotheelcellen door modulatie van hemikanalen en gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. Investigative Ophthalmology en Visual Science.

Figuur 4
Figuur 4. Significante veranderingen in de verspreiding van intercellulaire Ca2 +-golven na behandeling met exogeen nucleotidases (links) en met ectonucleotidase remmers (rechts) BCEC. A. Significante afname AA na behandeling van BCEC met exogeen apyrases (apyrase VI (5 U / ml) en apyrase VII (5 U / ml) gedurende 30 min) die ATP en ADP hydrolyseren, wordt het remmen van de paracriene intercellulaire communicatiepad (N = 7, n = 35). * Geeft P <0.001 in aanwezigheid versus afwezigheid van apyrase B. Aanzienlijke stijging van AA na behandeling van BCEC met een selectieve ectonucleotidase inhibitor ARL-67156 (ARL; 100 uM gedurende 30 min)., Kruidige enhancing de paracrine intercellulaire communicatie traject (N = 12, n = 60). * Geeft P <0,001 in aanwezigheid versus afwezigheid van ARL.

Genormaliseerde AA St. fout N n Statistiek
controle 100 8.31 3 30
siScramble 87.97 9.3 3 30
siCx43-1 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7.06 3 30 *
Controle peptide 91.68 6.5 8 40
Gap 26 46.67 4.24 8 40 *
Gap 27 53 4.76 8 40 *
TAT-L2 6.99 0.71 3 30 *

Tabel 1. Effect van siRNA moleculen richten Cx43, connexin mimetische peptiden en de cel-permeabele peptide TAT-L2 op de genormaliseerde actieve gebied (AA) in BCEC.
N het aantal dagen experimenten, n het aantal mechanische stimulatie. * Geeft P <0,001 vs controle omstandigheden.

<tr>
AA sequence
Controle peptide SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

Tabel 2. Aminozuur sequenties van de gebruikte peptiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode om intracellulaire Ca2 +-golven meten monolagen van primaire boviene corneale endotheelcellen door een lokale en gecontroleerde mechanische stimulatie met behulp van een micropipet. Mechanisch gestimuleerde cellen reageren met een lokale toename van intracellulaire IP3 en Ca2 +, die beide essentiële intracellulaire signalerende moleculen die rijden intracellulaire Ca 2 +-golven 11,67. IP3 wordt direct overgebracht naar naburige cellen via gap junction kanalen 5, terwijl Ca2 + veroorzaakt de opening van hemichannels en de afgifte van ATP 68,69, die Ca2 + signalen in naburige cellen activeert door de activering van G-proteïne gekoppelde P2 receptoren 37-40. De relatieve bijdrage van gap junction kanalen als hemikanalen hierin kunnen worden gekenmerkt door het gebruik van Cx-mimetischepeptiden, ATP-afbrekende enzymen (ectonucleotidases) en remmers van ectonucleotisdases. De eigenschappen van mechanische stimulatie-geïnduceerde intracellulaire Ca2 +-golven in runderen corneale endotheelcellen zijn grondig gekarakteriseerd in ons lab 25-33. Onze resultaten geven aan dat de intracellulaire Ca 2 +-golven voornamelijk gedreven door een Cx-hemichannel-gemedieerde afgifte van ATP, met Cx43 een prominente rol speelt. Als zodanig is deze methode toegepast op primaire boviene corneale endotheelcellen is bijzonder geschikt voor de regulering van Cx43 hemikanalen op endogene niveaus oorspronkelijke cellen te identificeren of te karakteriseren. Met deze methode, hebben we gevonden dat de activiteit van Cx43 hemikanalen kritisch wordt gecontroleerd door de actomyosine cytoskelet, die kunnen dienen als endogene rem waardoor buitensporige en dus schadelijke, Cx43 hemichannel opening 25,31,32. We verder te ontrafelen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze regelgeving en vindeneen belangrijke rol van intramoleculaire lus / staart interacties die essentieel zijn voor de opening van Cx43 hemikanalen 33 zijn.

Duidelijk is dit systeem zeer geschikt voor het bestuderen van de functie van Cx en Panx gebaseerde gap juncties en hemikanalen en is zeker niet beperkt tot runderen corneale endotheelcellen maar kan worden aangepast aan vrijwel elk celtype en ook complexer weefsels, zoals aangetoond in de hersenen waar mechanische stimulatie veroorzaakt grote intracellulaire Ca 2 +-golven waaronder het gehele halfrond 70. Verschillende gereedschappen zijn aanwezig om de bijdrage van gap junction kanalen en hemikanalen, waaronder Cx-mimetische peptiden, ATP-afbrekende enzymen, remmers van ectonucleotidases en farmacologische verbindingen zoals carbenoxolon en 10 Panx1 (tabel 2) 49,50 beoordelen. Om de bijdrage van een bepaalde Cx of Panx isovorm dit proces bepalen zorgvuldig ontworpen siRNA probes targeting twee onafhankelijke gebieden van het mRNA en een gecodeerd controle zijn. De omvang van de knock-down moet worden bepaald op het totale eiwitgehalte met Western-blotting assays en het eencellige niveau met behulp van fluorescentie microscopie. De transfectie-efficiëntie van de siRNA probes in de experimentele cel monolagen worden beoordeeld door fluorescentiemicroscopie. Hiervoor kan men een duplex siRNA waarin een fluorescent label is opgenomen aan het 3'-uiteinde van de sense streng ontwikkelen. Het is belangrijk op te merken dat voor een goede analyse een belangrijke vermindering van de Cx of Panx isoform (> 90% reductie), en een homogene transfectie van de siRNA duplexen in de cel monolaag (> 90% van de cellen getransfecteerd met siRNA probe) worden verkregen. De selectiviteit van de ontworpen siRNA sondes naar het doel moet worden beoordeeld 71. Kortom, deze tools zo worden gevalideerd dat ze niet van invloed op de expressie van andere Cx of Panx isovormen of andere belangrijke comcomponenten een intercellulaire Ca2 +-golven, zoals P2X receptoren of P2Y. Om de bijdrage van Cx43 hemikanalen beoordelen, hebben we samen met het laboratorium van Dr Leybaert het ontwikkelen van een cel-permeabele peptide overeenkomend met de tweede helft van de intracellulaire lus van Cx43 (TAT-L2) dat fungeert als een selectieve, krachtige remmer van Cx43 hemikanalen behoud Cx43 gap junction kanalen activiteit 33. In onze studies, maken we gebruik van 100 uM TAT-L2 om een volledige remming van Cx43 hemikanalen verkrijgen, maar lagere concentraties kan voldoende zijn 72. TAT-L2H126K/I130N wordt aanbevolen als een negatieve controle 73. Om de bijdrage van Panx1 kanalen beoordelen, kan de 10Panx1 peptide worden toegepast. Deze gereedschappen zijn niet alleen belangrijk voor exclusief plasmamembraan verstoring (zie hieronder), maar ook het aantonen paracriene ATP medieert de signalerende mechanismen van intracellulaire Ca2 +-golven door hemichannels en niet door andere mechanismen (zoals maxi-anion kanalen of de vrijlating van ATP-bevattende blaasjes). Tot slot, als voor alle studies met behulp van primaire cellen, de celcultuur condities en het aantal passages moet gestandaardiseerd zijn, aangezien de biologische eigenschappen van de cellen en dus de expressie profiel van de verschillende Cx en Panx isovormen kunnen veranderen in de tijd 26.

Toch zijn er een aantal nadelen aan deze methode. Een groot nadeel van de methode is dat mechanische stimulatie kan plasmamembraan verstoring veroorzaken, waardoor de binnenkomst van extracellulair Ca2 + en de afgifte van signalerende moleculen zoals ATP, beide ten grondslag bona fide intracellulaire Ca 2 +-golven 11. Dit maakt zeker de (kwantitatieve) analyse van de intracellulaire Ca 2 +-golf. Daarom is het sterk aanbevolen dat men moet i) gebruik van de juiste controles, dwz cellijnen die de expressie van Cx of Panx isovormen missen, en tools die interfere met de functie van Cx en Panx als gap junction kanalen en / of hemikanalen en ii) de standaardisering van de mechanische stimulatie procedure (zorg ervoor dat tijdens de mechanische prikkel de nanopositioner wordt bediend door een spanning tussen 0,5 en 2 V).

Verder is het van belang op te merken dat deze methode staat niet op zichzelf, maar moet worden ondersteund door aanvullende experimentele benaderingen van Cx en Panx kanalen te bestuderen. Dit kan worden bereikt door een locale toename van intracellulaire signalerende moleculen die deelnemen aan mechanische stimulatie-gemedieerde intercellulaire Ca2 +-golven, zoals uncaging van intracellulaire IP3 of Ca 2 + 11,74. Het initiëren intercellulaire Ca2 +-golf onafhankelijke mechanische stimulatie, kan micro-injectie, zoals recombinante pro-apoptotische Bax 11,75 en foto-activeerbare Ca 2 +-buffers gebruiken zoals diazo-2 dat een lokale daling veroorzaakt extracellulaire [Ca 2 + 76, een bekende trigger voor hemikanaal opening. Als alternatief kan men gebruik in situ elektroporatie van cellen ondoordringbare signaalmoleculen die leiden tot intracellulaire Ca2 +-afgifte en intercellulaire Ca2 +-golven, zoals IP3 67,68. Deze laatste techniek wordt ook gebruikt om te onderzoeken de verspreiding van celdood 5,77. Deze niet-mechanische stimuli een betere beoordeling van de stimulus intensiteit-respons. Naast deze Ca 2 +-golven methoden, is het belangrijk om de activiteit van de Cx of Panx kanalen van andere benaderingen, het bepalen van hydrofiele vlamwerendheid (zoals Lucifer geel) 78 en de afgifte van ATP niet alleen bepalen reactie op mechanische stimulatie maar ook in reactie op extracellulair Ca2 +-buffers (zoals EGTA) en intracellulaire Ca2 +-afgifte moleculen (zoals de Ca 2 +-ionofoor A23187) 11,74. Bovendien, thij het beste bewijs voor de regelgeving op het kanaal niveau wordt geleverd door elektrofysiologische experimenten, ofwel dubbel voltage clamp systemen of whole-cell weg clamp van Xenopus oöcyten geïnjecteerd met Cx of Panx mRNA of van HeLa-cellen ectopisch tot expressie Cx isovormen samen met een marker, zoals GFP 79-84.

Tot slot, het gebruik van mechanische stimulatie voor het induceren van intercellulaire Ca2 +-golven biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om intracellulaire communicatie onderzoeken en onderzoeken van de bijdrage en de eigenschappen van de Cx en Panx kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Onderzoek uitgevoerd in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO; subsidie ​​nummers G.0545.08 en G.0298.11), de Interuniversitaire attractiepolen Program (Federaal Wetenschapsbeleid; toekenningsnummer P6/28 en P7/13) en is ingebed in een FWO-ondersteund onderzoeksgemeenschap. CDH is een post-doctoraal onderzoeker van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO). De auteurs zijn erg dankbaar voor alle huidige en voormalige leden van het Laboratorium voor Moleculaire en Cellulaire Signalering (KU Leuven), dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometrie, USA), het laboratorium van Dr Leybaert (Universiteit Gent) en van Dr Vinken (VUB) die behulpzaam discussies verstrekt, geoptimaliseerde procedures of betrokken waren bij de ontwikkeling van instrumenten voor de studie van connexine hemikanalen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Tags

Cellular Biology Moleculaire Biologie Geneeskunde Biomedische Technologie Biofysica Immunologie Oogheelkunde Gap Knooppunten connexins Connexin 43 Calcium Signalering Ca Cel Communicatie Paracriene Communicatie Intercellulaire communicatie calcium golfpropagatie gap junctions hemichannels endotheelcellen cell signaling cel isolatie celkweek
Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter