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Biology

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l'esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

Intercellulare Ca

Abstract

Comunicazione intercellulare è essenziale per il coordinamento dei processi fisiologici tra le cellule in una varietà di organi e tessuti, compreso il cervello, fegato, retina, coclea e vascolare. In impostazioni sperimentali, intercellulare Ca 2 +-onde possono essere provocato applicando uno stimolo meccanico a una singola cella. Ciò conduce al rilascio delle molecole di segnalazione intracellulare IP 3 e Ca 2 + che avviare la propagazione del Ca 2 +-onda concentricamente dal cellulare stimolata meccanicamente alle cellule vicine. I principali meccanismi molecolari che controllano intercellulare Ca 2 +-propagazione dell'onda sono forniti da gap canali di giunzione attraverso il trasferimento diretto di IP 3 e dal hemichannels attraverso il rilascio di ATP. Identificazione e caratterizzazione delle proprietà e la regolazione dei diversi connessina e isoforme pannexin come canali gap junction e hemichannels sono consentiti dalla quantification della diffusione del intercellulare Ca 2 +-onda, siRNA, e l'uso di inibitori di canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-onda in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie caricato con Fluo4-AM in risposta ad uno stimolo meccanico controllata e localizzata provocata da un acuto deformazione, di breve durata della cellula come risultato di toccare la membrana cellulare con una micropipetta di vetro micromanipolatore controllato con un diametro di punta di meno di 1 um. Abbiamo anche descrivono l'isolamento delle specie bovina cellule endoteliali corneali primarie e il suo utilizzo come sistema modello per valutare l'attività Cx43-hemichannel come la forza guidato per intercellulare Ca 2 +-onde attraverso il rilascio di ATP. Infine, si discute l'uso, i vantaggi, i limiti e le alternative di questo metodo nel contesto di apertura di canale di giunzione e di ricerca hemichannel.

Introduction

Comunicazione e di segnalazione intercellulare sono essenziali per il coordinamento dei processi fisiologici in risposta ad agonisti extracellulari al tessuto e il livello di 1,2 intera-organo. Il modo più diretto di comunicazione intercellulare è creato dalla presenza di giunzioni. Giunzioni gap sono placche di canali gap junction, che sono i canali proteici formati da docking testa a testa di due connessine (Cx) hemichannels delle celle adiacenti 3,4 (Figura 1). Giunzioni permettono il passaggio di piccole molecole di segnalazione con un peso molecolare di meno di 1,5 kDa, comprese Ca 2 + 3 o 5 IP, causando e modulando Ca 2 +-liberazione dalle riserve intracellulari delle cellule vicine 6 (Figura 2). Canali gap junction sono strettamente regolati dalle interazioni delle proteine ​​intra-ed intermolecolari e da processi di segnalazione cellulare, come la modifica redox efosforilazione 7. GJs facilitano la risposta coordinata delle celle collegate, agendo quindi come un prodotto chimico e sincizio elettrico. Per esempio, la diffusione di potenziale cardiaco di tutti i miociti atriali e ventricolari è mediato da canali GJ Cx basate 85. Cxs non solo hanno un ruolo come canali giunzioni gap, ma anche formano hemichannels spaiati, così funzionando come canali in membrane similmente a canali ionici regolari 8-10 (Figura 1). Hemichannels partecipano segnalazione paracrina tra cellule adiacenti controllando lo scambio di ioni e molecole di segnalazione tra l'ambiente intra ed extracellulare.

In molti tipi di cellule (come le cellule epiteliali, cellule osteoblastiche, astrociti, cellule endoteliali, ecc) e di organi (come il cervello, il fegato, la retina, coclea e il sistema vascolare), intercellulare Ca 2 +-onde sono fondamentali per il coordinamento delle risposte pluricellulari Ca2 + intracellulare livelli in una certa cella non sono limitati a questa cella, ma propagano alle cellule vicine circostanti, stabilendo così un intercellulare Ca 2 +-wave 12,13. Questi intercellulare Ca 2 +-onde sono importanti per il normale regolazione fisiologica di strati di cellule come un sincizio e loro disregolazione è stato associato a processi fisiopatologici 11. Nel endotelio corneale e l'epitelio, diversi gruppi di 14-24, compreso il nostro 25-33, hanno studiato i meccanismi ei ruoli della comunicazione intercellulare. In cellule non eccitabili, come le cellule endoteliali corneali, due distinte modalità di comunicazione intercellulare verificano 28,29, cioè gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Gap giunzionale comunicazione intercellulare comporta uno scambio diretto di molecole di segnalazione tramite gap giunzioni 7. Gap giunzionecomunicazione intercellulare zionale è fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti, il controllo della proliferazione cellulare, e stabilendo una risposta sincronizzata allo stress extracellulare 10,34,35. In un certo numero di patologie, gap accoppiamento giunzione è ridotta a causa di CXS difettosi, e con la presente colpisce gap giunzionale comunicazione intercellulare 36. Questo sottolinea l'importanza e l'influenza del gap giunzionale comunicazione intercellulare negli organismi multicellulari. In contrasto gap giunzionale comunicazione intercellulare, comunicazione intercellulare paracrina non dipende apposizione cellula-cellula, in quanto comporta il rilascio di messaggeri extracellulari diffusibili (Figura 2). Diversi tipi di molecole di segnalazione vengono rilasciati nello spazio extracellulare dalle cellule segnalazione. La molecola viene quindi trasportato alla cellula bersaglio dove viene rilevato da una proteina recettore specifico. Successivamente il complesso recettore-segnale induce una risposta cellulare, cheviene terminato dalla rimozione del segnale, inattivazione o desensibilizzazione. Usciti lipofile messaggeri di segnalazione extracellulare penetrano la membrana e agiscono sui recettori intracellulari. In contrasto, messaggeri idrofile non attraversano la membrana plasmatica della cellula rispondere, ma agiscono come un ligando che si lega a proteine ​​recettori di superficie espresse, che poi trasmettere il segnale per l'ambiente intracellulare. Tre grandi famiglie di proteine ​​recettori di superficie delle cellule partecipano a questo processo: canale ionico-linked, enzyme-linked, e G-proteine ​​legate. La molecola messaggero rilasciato può agire sui recettori della stessa cella (autocrina), su cellule bersaglio in prossimità (paracrina) o su cellule bersaglio distanti che richiedono il sistema circolatorio (endocrino).

In molti tipi cellulari, tra endotelio corneale 28,29, ATP è uno dei principali fattori paracrini idrofili, che guidano la propagazione di intercellulare Ca 2 +-onde 37-40. During deformazione meccanica, ipossia, infiammazione o stimolazione da vari agenti, ATP possono essere rilasciati dalle cellule sane 41-44 in risposta alle sollecitazioni di taglio, allungamento, o rigonfiamento osmotico 44,45. Meccanismi ATP-rilascio diverse sono state postulate, tra esocitosi vescicolare 44 e una pletora di meccanismi di trasporto, come ad esempio cassette (ABC) trasportatori ATP-binding, plasmalemmal canali anionici voltaggio-dipendenti, 46 canali del recettore P2X7 47,48, così come connessina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracellulare può essere rapidamente idrolizzato ad ADP, AMP, adenosina 54,55 da ectonucleotidases che sono presenti nell'ambiente extracellulare. L'ATP extracellulare rilasciato e il suo metabolita ADP 56 si diffonderanno in diffusione. La successiva interazione di questi nucleotidi con recettori purinergici nelle cellule vicine è stata implicata nella propagation di intercellulare Ca 2 +-onde 28,37,51. Due differenti classi di recettori purinergici sono presenti: adenosina è il ligando naturale principale per P1-recettori purinici, mentre sia purina (ATP, ADP) e pirimidine (UTP, UDP) nucleotidi agiscono su più recettori purinici P2-57.

Comunicazione intercellulare può essere indagato con metodi diversi, come carico raschiare, il trasferimento di colore, uncaging locale di agonisti come IP 3 e Ca 2 +, la stimolazione meccanica, ecc. Qui si descrive lo studio di Ca 2 +-propagazione dell'onda suscitata da stimolazione meccanica di una singola cellula. Il vantaggio di studiare Ca 2 +-propagazione delle onde di stimolazione meccanica è che fornisce un facile strumento per quantificare la diffusione del Ca 2 +-onda nel tempo e permette confrontando quantitativamente diversi pretrattamenti delle cellule. Nell'endotelio corneale, questi intercellulare Ca 2 +-onde consentire un corisposta coordinata dal monostrato, con la presente in qualità di un possibile meccanismo di difesa del non-rigenerativa dell'endotelio corneale aiutando l'endotelio a resistere alle sollecitazioni extracellulari durante l'intervento chirurgico intraoculare, o in caso di esposizione di mediatori infiammatori durante rigetto immunitario o uveite 58,59.

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Protocol

1. Isolamento di cellule endoteliali corneali

Prima di iniziare: Isolare le cellule dagli occhi freschi, ottenuti da un macello locale, il più presto possibile dopo enucleare l'occhio. Assicurarsi che l'occhio è stato enucleato da una mucca di massimi 18 mesi di età, a cinque minuti post mortem e conservate in soluzione salina bilanciata di Earle - soluzione di iodio 1% a 4 ° C per il trasporto al laboratorio.

  1. Prendete l'occhio di soluzione salina bilanciata del Earle - soluzione di iodio 1% e metterlo in una capsula di Petri (100 x 20 mm).
  2. Sterilizzare l'occhio con una soluzione contenente 70% di etanolo e sciacquare con soluzione salina bilanciata di Earle contenente 1% di iodio.
  3. Da questo punto in poi, lavorare in una cappa sterile. Sezionare con cura la cornea dall'occhio e metterla in una piastra di Petri (35 x 10 mm) contenente soluzione salina bilanciata di Earle, con lo strato di cellule epiteliali verso l'alto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo sti tessuto dell'iridell attaccato alla cornea, se necessario.
  4. Trasferire la cornea di soluzione salina bilanciata di Earle contenente un'altra piastra di Petri con lo strato di cellule endoteliali verso l'alto e lavare due volte con soluzione salina bilanciata di Earle.
  5. Trasferire la cornea con lo strato endoteliale rivolta verso l'alto ad una clessidra, che è un piatto a forma di coppa, e coprire con terreno di crescita. Il mezzo di crescita consiste Medio Dulbecco Modified Eagle contenente 25 glucosio mM, 10% di siero fetale bovino, 6,6% di L-glutammina, 2,5 ug / ml di amfotericina-B e 1% miscela antibiotico-antimicotico contenente 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mcg / ml di streptomicina, e 25 ug / ml di amfotericina B.
  6. Rimuovere il terreno con una pipetta di aspirazione.
  7. Applicare 300 microlitri di una soluzione di tripsina (0,5 g / L) per lo strato endoteliale della cornea (tutti i passaggi che includono tripsina sono fatte utilizzando la stessa concentrazione).
  8. Posizionare la clessidra contenente la cornea in una capsula di Petri coperta e metterlo nel incubator per 30 min a 37 ° C e 5% di CO 2.
  9. Raschiare delicatamente le cellule endoteliali lontano dalla cornea con un incendio lucidato a gancio pipetta Pasteur di vetro in una cappa sterile.
  10. Succhiare la soluzione contenente le cellule endoteliali ed aggiungerlo alla fiasche di coltura (25 cm 2) contenenti 4 ml di terreno di coltura.
  11. Applicare 300 ml di terreno di crescita alla cornea e ripetere la raschiatura e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al pallone cultura.
  12. Ripetere questo passaggio finale (1.11) ancora una volta.
  13. Posizionare la cultura flaconi contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di coltura in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  14. Dopo due giorni, aggiungere 6 ml di terreno di coltura.
  15. Aggiornare il terreno di crescita ogni due giorni.

2. Colture Cellulari

  1. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina bilanciata di Earle, quando viene raggiunta la confluenza (entro about 10 giorni dopo l'isolamento).
  2. Aggiungere 1,5 ml di soluzione di tripsina per le cellule per staccarli e mettere il pallone in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 3-4 min.
  3. Aggiungere 12 ml di mezzo di crescita. Pipettare le medie tre volte dentro e fuori per disperdere le cellule e contare le cellule.
  4. Seed le cellule con una frazione variabile a seconda della densità cellulare e metterle in incubatrice. Preparare due vetrini ben a camera (con una superficie di 4,2 cm 2) con una conta cellulare di 165.000 cellule (densità cellulare 39.286 per cm 2). Preparare 80 centimetri due fiasche di coltura per un nuovo passaggio ad una densità di 6.250 per cm 2, e aggiungere mezzo di coltura fresco fino ad un volume totale di 25 ml.
  5. Aggiornare la media ogni due giorni.
  6. Confluenza dello strato di cellule viene raggiunto dopo 3 o 4 giorni. Utilizzare le cellule per gli esperimenti.
  7. Quando confluenza dello strato di cellule nelle beute viene raggiunto, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6. Colture cellulari fino al passaggio 2 può essere utilizzato fo esperimenti.

3. La stimolazione meccanica per indurre Saluto di calcio

  1. Caricare le cellule nella diapositiva camerata con 10 mM Fluo-4:00 in PBS per 30 min a 37 ° C, mentre scuotendo delicatamente.
  2. Rimuovere il Fluo-04:00 soluzione, lavare le cellule cinque volte con tampone fosfato salino, incubare le cellule con PBS e lasciare le celle per almeno 5 minuti a temperatura ambiente prima della misurazione.
  3. Eccitano a 488 nm con Argon laser e uso divisore di fascio 488 HFT, raccogliere l'emissione di fluorescenza a 530 nm usando un filtro di emissione longpass LP 505, fissato il foro stenopeico al minimo. Utilizzare un olio di immersione obiettivo 40X (Aria, 1.2 NA). In esperimenti con ARL-67156, utilizzare un obiettivo 10X (Aria, 0.3 NA).
  4. Ricerca di un campo in cui le cellule sono confluenti sul microscopio confocale.
  5. Posizionare la pipetta in modo che sia a 45 ° rispetto alla slitta incamerata e toccando la membrana cellulare.Provocare un corto (≈ 1 sec) stimolazione meccanica ad una singola cella. La stimolazione meccanica consiste di una deformazione acuta, di breve durata della cella toccando brevemente meno dell'1% della membrana cellulare con una micropipetta di vetro (diametro in punta <1 um) accoppiato ad un cristallo piezoelettrico nanopositioner, operato tramite un amplificatore che è montato su un micro-manipolatore. Le micropipette di vetro sono realizzati con un estrattore microelettrodo. Assicurarsi che il nanopositioner è gestito da una tensione compresa tra 0,2 e 1,5 V durante la stimolazione meccanica. Una tensione superiore a 1,5 V può provocare danni alle cellule. Per ciascun tipo di cellula e condizione la tensione ottimale per la stimolazione meccanica senza danno cellulare deve essere accuratamente determinato applicando una serie di tensioni partire dal basso (0,2 V) ad alto (1,5 V) tensione. La tensione è una misura per la forza della stimolazione poiché questa tensione determina la sollecitazione meccanica e la tensione che vengono applicati alla membrana cellulare. Glivigore della stimolazione meccanica può essere calcolata moltiplicando la sollecitazione meccanica con la zona. Poiché sia l'area (<3,14 micron 2) e le sollecitazioni meccaniche sono molto bassi, la forza della stimolazione meccanica è basso. (Si noti che quando una cellula è danneggiata, le perdite di fluorescenza fuori della cellula e la cellula diventa scuro.)
  6. Misurare le variazioni spaziali in [Ca 2 +] i in seguito a stimolazione meccanica con il microscopio confocale.
  7. Raccogliere e conservare le immagini.
  8. Disegnare una regione poligonale di interesse per definire la superficie totale di cellule responsive (area attiva, AA) usando il software del microscopio confocale.

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Representative Results

Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione e il protocollo viene dimostrato viene eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e del Comitato utilizzo del KU Leuven.

Nelle cellule endoteliali corneali bovina (BCEC), giunzioni gap funzionali sono espresse e sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrine contribuiscono in modo significativo alla comunicazione intercellulare in modo interattivo, ma la via principale ha dimostrato di essere il paracrino percorso di comunicazione intercellulare mediata da ATP rilascio attraverso hemichannels Cx43 basati 28,29. ATP e ADP sono idrolizzato ad adenosina monofosfato (AMP) da parte del ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfato difosfoidrolasi 1, CD39 ATP difosfoidrolasi), e successivamente alla adenosina dal 5'-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP e ADP contribuisconoil Ca 2 +-propagazione delle onde legandosi a recettori P2Y1 e P2Y2 28,29. Entrambi recettori coppia a PLC tramite Gq e quindi evocare IP 3-indotta Ca 2 +-rilascio (Figura 2). In BCEC, la stimolazione dei recettori purinergici P2Y provoca un rapido aumento della [Ca 2 +] i, che è insensibile alla rimozione di [Ca 2 +] o 60. [Ca 2 +] i picchi evocati da stimolazione agonista sono seguiti da un [Ca 2 +] i diminuzione che può portare a una stalla, altezza agonista-dipendente, [Ca 2 +] o-e oscillazioni oscillatorie o da un ritorno alla linea di base 60-62. In BCEC, c'è stata la prova che Ca 2 +-release avviene tramite passaggio coinvolge PLC e IP 3 29. Svuotamento delle IP negozi 3-sensibili porta ad un picco iniziale di [Ca 2 +] i, successivamente seguito da un capacitative Ca 2 +-afflusso porta alla comparsa della fase di plateau 63.

Stimolazione meccanica provoca un rapido aumento iniziale del Ca 2 + che ha origine dal punto della stimolazione e poi si diffonde in tutta la cellula stimolato meccanicamente. Infine, il intracellulare di Ca 2 +-livelli lentamente diminuire torna al livello di partenza. Dopo aver raggiunto i bordi delle celle, gli intercellulari Ca 2 +-onda si propaga verso le cellule circostanti vicini (NB) in modo ondulatorio come Ca 2 +-transitorio, che decade a livello basale (Figura 3). In condizioni di controllo, Ca 2 +-transitori sono stati osservati fino a circa 4-8 strati di cellule di distanza dal cellulare stimolata meccanicamente (Figura 3). Il grafico a linee (sul lato destro dei pannelli in figura 3) mostra l'andamento temporale del Ca 2 +-transienti (rappresentati come valori normalizzati di fluorescenza (NF)) inla cella stimolato meccanicamente e degli strati cellulari confinanti 04:59 (NB1, NB2, NB3, NB4 e NB5). Dalla Figura 3, è chiaro che le diminuzioni di fluorescenza normalizzato, mentre il ritardo di tempo per l'insorgenza di [Ca 2 +] i-aumento aumenta con l'aumentare della distanza dalla cellula stimolata meccanicamente. La fluorescenza massima normalizzata nella cella stimolato meccanicamente stato raggiunto in 0,95 ± 0,04 sec. Dopo aver raggiunto un valore di fluorescenza normalizzato massimo, la fluorescenza normalizzata mostrato un calo molto graduale e lento, tornando al valore basale 152 ± 6 sec dopo l'applicazione dello stimolo 25.

Inibizione del pathway paracrina comunicazione intercellulare utilizzando una combinazione di esogeno apyrase VI (5 U / ml per 30 min) e apyrase VII (5 U / ml per 30 min) ha causato una diminuzione 7,5 volte nell'area coperta dal Ca 2 +-wave, la cosiddetta area attiva (AA, P <0.001; N = 7, N = 35) (Figura 4A). Apyrase è noto per idrolizzare ATP e ADP. Apirasi VI ha un alto rapporto ATPasi / ADPase e apirasi VII preferenzialmente idrolizza l'ADP 56.

Dal paracrino comunicazione intercellulare nel endotelio corneale avviene in gran parte attraverso il rilascio di ATP, 28,29 e ATP viene idrolizzato nello spazio extracellulare da ectonucleotidases, noti per essere espresso nel endotelio corneale, 29,64,65 abbiamo studiato l'effetto sulla AA in condizioni dove idrolisi dell'ATP è inibita usando inibitori ectonucleotidase. Inibizione di ectonucleotidases con ARL-67156 (ARL, 100 mM per 30 min) ha determinato una forte valorizzazione del Ca 2 +-propagazione dell'onda, come è stato dimostrato in precedenza BCEC 25,26,28,29. L'esposizione di BCEC ad ARL causato un aumento di 3,5 volte della AA rispetto alle condizioni di controllo (p <0,001; N = 12, n = 60) (Figura 4B).

In precedenti studi nel nostro laboratorio, connessina peptidi mimetici (Gap26 e Gap27, Tabella 2) sono stati utilizzati per distinguere i contributi relativi di gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino per intercellulare Ca 2 +-propagazione dell'onda dopo stimolazione meccanica, con un peptide inattivo ( Tabella 2) come controllo 28,29.

L'inibizione dei canali di giunzione gap con Gap27 diminuito significativamente la propagazione del Ca 2 +-wave in BCEC 30. L'AA era significativamente ridotta su pretrattamento con Gap27 (300 mM per 30 min) (p <0,001; N = 8, n = 40) 25 (Tabella 1). L'inibizione della hemichannels connessina con la connessina-peptide mimetico Gap26 28,30 ridotto significativamente la propagazione del Ca 2 +-wave in BCEC 28. L'AA è stato notevolmente ridotto su di pretrattamento con Gap26 (300 mM per 30 min)(P <0,001; N = 8, n = 40) 25 (Tabella 1).

Abbiamo anche dimostrato che l'43-kDa Cx isoforma è stata una componente principale alla base del rilascio di ATP hemichannel-mediata che provoca intercellulare Ca 2 +-onde. L'uso di due molecole di siRNA progettati in modo indipendente di targeting Cx43, abbiamo scoperto che la AA è stato ridotto di circa il 65% 33 (Tabella 1). Ciò è stato ulteriormente favorita da esperimenti usando TAT-L2 (100 mM, 30 min), un peptide cellula permeabile corrispondente alla seconda metà del ciclo intracellulare di Cx43 (Tabella 2), che ha provocato una riduzione importante AA (P <0.001 , N = 3, n = 30) (Tabella 1). Importante, questa riduzione di AA da TAT-L2 incubazione non è stata osservata in assenza di segnalazione paracrini, sostenendo il concetto che TAT-L2 inibisce selettivamente hemichannels Cx43 basati ma non i canali giunzioni gap 33. Inoltre, un inattivo TAT-L2 mutante (TAT-L2 H126K/I130N) può essere utilizzato come controllo (Tabella 2).

Figura 1
Figura 1. Formazione di canali gap junction e hemichannels: rappresentazione schematica. A. Un connessina o pannexin hemichannel si forma quando sei connessine o pannexins, che sono proteine ​​quattro domini transmembrana-contenenti, sono radialmente disposte intorno a un poro centrale. Hemichannels si trovano nella membrana plasmatica. Essi possono consistere in sottotipi di proteine ​​identiche (hemichannels omomerici) oppure possono consistere in diversi sottotipi di proteine, quando due o più isoforme sono espresse nella stessa cella (hemichannels eteromerici). Un omotipica divario canale incrocio risulta dalla docking di due omomerici identico o hemichannels eteromerici. A eterotipiche divario di giunzione risultati canale dal dlocco di due diversi canali omomerici o eteromerico. B. Struttura schematica di connessina e pannexin canali gap junction che collegano due celle e hemichannels adiacenti.

(Parzialmente modificata da 66)

Questo dato è stato originariamente pubblicato nel BioEssays. Catheleyne d'Hondt, Raf Ponsaerts, Umberto De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, parenti lontani della famiglia connessina con specifiche funzioni cellulari. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. In cellule non eccitabili, l'intercellular Ca 2 +-propagazione dell'onda coinvolge sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Sotto stimolazione meccanica di una singola cella, un Ca 2 +-aumento si verifica nella cellula stimolato meccanicamente (MS) via Ca 2 +-afflusso e / o Ca 2 +-release. Successivamente, i Ca 2 + propaga-aumento dal meccanicamente stimolati alle cellule vicine (NB) in qualità di Ca 2 +-wave intercellulare. La propagazione intercellulare prevede due meccanismi, vale a dire la comunicazione intercellulare gap giunzionale e la comunicazione intercellulare paracrino. In gap giunzionale comunicazione intercellulare, uno scambio diretto di un mediatore (IP 3 e / o Ca 2 +) si verifica tra le citoplasma di cellule adiacenti tramite giunzioni gap (GJ). Nella comunicazione intercellulare paracrino, un messaggero (es. ATP) viene rilasciato nello spazio extracellulare, agendo quindi su recettori situati sulla °superficie e delle celle vicine. Hemichannels (HC) o altri meccanismi di mediare questo rilascio di ATP (vedi testo). Ectonucleotidases idrolizzano ATP a ADP e AMP. ATP e ADP agiscono su P2Y e / o recettori P2X sulle cellule vicine. (Tratto da 66.)

Questo dato è stato originariamente pubblicato nel BioEssays. Catheleyne d'Hondt, Raf Ponsaerts, Umberto De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, lontani parenti della famiglia connessina con specifiche funzioni cellulari. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays.

Figura 3
Figura 3. Calcio propagazione delle onde in condizioni di controllo nel BCEC. Stimolazione meccanica transienti di calcio indotti sono mostrati a diversi punti temporali in condizioni di controllo nel BCEC da immagini di fluorescenza pseudo-color rappresentativi. Il fluoreintensità scence prima della stimolazione sono mostrati nella prima immagine. La freccia bianca nella seconda immagine identifica il cellulare stimolata meccanicamente. L'onda si propaga di calcio a sei strati di cellule vicine con una superficie totale di cellule raggiunte dall'onda (area attiva: AA) di 62.870 micron 2.

Il pannello di destra con i grafici lineari mostra l'andamento temporale del valore normalizzato fluorescenza (NF) nella cella stimolato meccanicamente (MS) e il valore medio di NF nelle celle vicine (NB) 1 a 5 strati (NB1 a NB5). (Parzialmente modificata dal 25.)

Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Investigative Ophthalmology e Visual Science. Catheleyne d'Hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, e Bernard Himpens. La trombina inibisce intercellulare propagazione delle onde di calcio nelle cellule endoteliali corneali attraverso la modulazione di hemichannels e giunzioni gap. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.. 2007. Investigative Ophthalmology e Visual Science> 48 (1), 120-33 (2007)..

Figura 4
Figura 4. Cambiamenti significativi nella diffusione di intercellulare Ca 2 +-onde dopo il trattamento con nucleotidasi esogeni (a sinistra) e con inibitori ectonucleotidase (a destra) in BCEC. A. Significativa diminuzione AA dopo il trattamento di BCEC con apyrases esogeni (apirasi VI (5 U / ml) e apirasi VII (5 U / ml) per 30 minuti), che idrolizzano ATP e ADP, dichiara inibendo la paracrino percorso di comunicazione intercellulare (N = 7, n = 35). * Indica p <0.001 in presenza vs assenza di apirasi B. Significativo aumento AA dopo il trattamento di BCEC con un inibitore selettivo ectonucleotidase ARL-67156 (ARL; 100 mM per 30 min)., Erbaceo enhancing il percorso di comunicazione intercellulare paracrino (N = 12, n = 60). * Significa p <0.001 in presenza vs assenza di ARL.

Normalizzato AA San errore N n Statistiche
controllare 100 8.31 3 30
siScramble 87.97 9.3 3 30
siCx43-1 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7.06 3 30 *
Peptide di controllo 91.68 6.5 8 40
Gap 26 46.67 4.24 8 40 *
Gap 27 53 4.76 8 40 *
TAT-L2 6.99 0,71 3 30 *

Tabella 1. Effetto di molecole di siRNA di targeting Cx43, connessina peptidi mimetici e la cellula-permeabile peptide TAT-L2 sull'area attiva normalizzato (AA) in BCEC.
N rappresenta il numero di giorni di esperimenti, n rappresenta il numero di stimolazioni meccaniche. * Significa p <0.001 rispetto a condizioni di controllo.

<tr>
AA sequenza
Peptide di controllo SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

Tabella 2. Sequenze amminoacidiche dei peptidi utilizzati.

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Discussion

In questo manoscritto, si descrive un metodo semplice per misurare intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in monostrati di cellule endoteliali corneali bovina primarie, fornendo una stimolazione meccanica localizzato e controllato utilizzando una micropipetta. Cellule stimolate meccanicamente rispondono con un aumento locale della IP intracellulare 3 e Ca 2 +, che sono entrambi essenziali molecole di segnalazione intracellulare che guidano intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde 11,67. IP 3 viene trasferito direttamente cellule vicine tramite canali gap junction 5, mentre Ca 2 + provoca l'apertura della hemichannels e la liberazione di ATP 68,69, che innesca Ca 2 + segnali in celle vicine attraverso l'attivazione della proteina G accoppiata P2 recettori 37-40. Il contributo relativo dei canali gap junction e hemichannels in questo processo può essere caratterizzata dall'uso di Cx-mimeticopeptidi, enzimi ATP-degradanti (ectonucleotidases) e inibitori di ectonucleotisdases. Le proprietà meccaniche di stimolazione indotta intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in cellule endoteliali corneali bovina sono stati completamente caratterizzati nel nostro laboratorio 25-33. I nostri risultati indicano che la intercellulare Ca 2 +-propagazione dell'onda è determinata essenzialmente da una release Cx-hemichannel mediata da ATP, con Cx43 giocare un ruolo di primo piano. Come tale, questo metodo applicato alle cellule endoteliali corneali bovina primarie è particolarmente adatto per identificare o caratterizzare la regolazione della Cx43 hemichannels a livelli endogeni nelle cellule native. Usando questo metodo, abbiamo trovato che l'attività di Cx43 hemichannels è criticamente controllato dal citoscheletro actomiosina, che può servire come freno endogeno prevenire eccessivo, e quindi deleterio, Cx43 apertura hemichannel 25,31,32. Noi chiarire ulteriormente i meccanismi molecolari alla base di questo regolamento e troviamoun importante ruolo di interazioni loop / coda intramolecolari che sono essenziali per l'apertura di Cx43 hemichannels 33.

Chiaramente, questo sistema è molto adatto per studiare la funzione di Cx e Panx basata canali gap junction e hemichannels ed è sicuramente non limitata alle cellule endoteliali corneali bovina, ma è adattabile a qualsiasi tipo di cellula e anche i tessuti più complessi, come è stato dimostrato nel cervello dove stimolazione meccanica innescato grande intercellulare Ca 2 +-onde che comprende l'intero emisfero 70. Diversi strumenti sono presenti per valutare il contributo dei canali gap junction e hemichannels, tra cui peptidi Cx-mimetici, enzimi ATP-degradanti, inibitori di ectonucleotidases e composti farmacologici come carbenossolone e 10 Panx1 (Tabella 2) 49,50. Per determinare il contributo di un certo Cx o Panx isoforma in questo processo, le sonde siRNA accuratamente progettati targeting due regioni indipendenti del mRNA e un controllo scrambled dovrebbe essere usato. L'entità del knockdown dovrebbe essere determinato a livello proteico totale usando Western-blotting saggi e il livello di singola cellula usando la microscopia a fluorescenza. L'efficienza di trasfezione delle sonde siRNA nei monostrati cellulari sperimentali dovrebbe essere valutata mediante microscopia a fluorescenza. Per questo, si può sviluppare una siRNA duplex in cui una etichetta fluorescente è stato incorporato alla estremità 3 'del filamento senso. E 'importante notare che per una corretta analisi, una riduzione prominente della Cx o Panx isoforma (riduzione> 90%), così come una trasfezione omogenea delle siRNA duplex in monostrato cellulare (> 90% delle cellule trasfettate con siRNA sonda) dovrebbe essere ottenuto. La selettività delle sonde siRNA progettati verso l'obiettivo dovrebbe essere valutata 71. In breve, questi strumenti devono essere convalidati in modo che essi non pregiudichino l'espressione di altri Cx o isoforme Panx o altro com chiavenenti di guida intercellulare Ca 2 +-onde, come i recettori P2X o P2Y. Per valutare il contributo del Cx43 hemichannels, abbiamo collaborato con il laboratorio del Dr. Leybaert nello sviluppo di un peptide cellula permeabile corrispondente alla seconda metà del ciclo intracellulare di Cx43 (TAT-L2) che agisce come un selettivo, potente inibitore CX43 hemichannels mantenendo Cx43-divario di giunzione canale attività 33. Nei nostri studi, usiamo 100 mM TAT-L2 per ottenere una completa inibizione della Cx43 hemichannels, ma concentrazioni più basse possono essere sufficienti 72. TAT-L2H126K/I130N è raccomandato come un controllo negativo 73. Per valutare il contributo del Panx1 canali, il peptide 10Panx1 può essere applicata. Questi strumenti sono importanti non solo per l'esclusione della membrana plasmatica interruzione (vedi sotto), ma anche per dimostrare che i paracrini ATP media la segnalazione dei meccanismi di propagazione intracellulare Ca 2 +-wave da hemichannels e non da altri meccanismi (come mcanali axi-anione o il rilascio di vescicole contenenti ATP). Infine, come per tutti gli studi utilizzando cellule primarie, le condizioni di coltura cellulare e il numero di passaggi devono essere standardizzati, come le proprietà biologiche delle cellule e quindi il profilo di espressione delle diverse isoforme Panx Cx e possono variare nel tempo 26.

Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi a questo metodo. Uno svantaggio principale di questo metodo è che la stimolazione meccanica può innescare membrana plasmatica perturbazione, verso l'entrata di Ca 2 + extracellulare e il rilascio di molecole di segnalazione come ATP, entrambi i quali sottendono bona fide intercellulare Ca 2 +-onda di propagazione 11. Questo sicuramente complica l'analisi (quantitativa) del intercellulare Ca 2 +-wave. Pertanto, si raccomanda vivamente che si dovrebbe i) utilizzare adeguati controlli, vale a dire le linee cellulari che non hanno la espressione di Cx o Panx isoforme, e gli strumenti che interfere con la funzione di Cx e Panx come canali divario di giunzione e / o hemichannels e ii) standardizzare la procedura di stimolazione meccanica (assicurarsi che durante lo stimolo meccanico il nanopositioner è azionato da una tensione compresa tra 0,5 e 2 V).

Inoltre, è importante notare che questo metodo non sta in piedi da solo, ma deve essere sostenuta da approcci sperimentali complementari per studiare i canali Cx e Panx. Ciò può essere ottenuto utilizzando un aumento locale di molecole di segnalazione intracellulare che partecipano meccanico-stimolazione mediata intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde, come il uncaging intracellulare di IP 3 o Ca 2 + 11,74. Per avviare intercellulare Ca 2 +-wave indipendente stimolazione meccanica, si può usare micro-iniezione, come ricombinante pro-apoptotica Bax 11,75 e la foto-attivabile Ca 2 +-buffer come diazo-2 che causa una caduta locale in extracellulare [Ca 2 + 76, un trigger noto per l'apertura hemichannel. In alternativa, si può usare in elettroporazione in situ di molecole di segnalazione cellulare impermeabili che scatenano intracellulare di Ca 2 +-rilascio e intercellulare Ca 2 +-onde, come IP 3 67,68. Quest'ultima tecnica viene utilizzata anche per studiare la diffusione di morte cellulare 5,77. Questi stimoli non meccanici consentono una migliore valutazione della intensità dello stimolo-risposta. In aggiunta a questi metodi di propagazione Ca 2 +-onda, è importante determinare l'attività dei canali Cx o Panx utilizzando altri approcci, compresa la determinazione di assorbimento di colorante idrofilo (come Lucifero giallo) 78 e il rilascio di ATP non solo in risposta alla stimolazione meccanica, ma anche in risposta a extracellulare di Ca 2 +-buffer (come dell'EGTA) e Ca 2 + release molecole intracellulari (come il Ca 2 +-ionoforo A23187) 11,74. Inoltre, tegli prova migliore per la regolazione a livello del canale è fornito da esperimenti di elettrofisiologia, sia sistemi di bloccaggio a doppia tensione o clamp percorso a cellule di ovociti di Xenopus iniettati con Cx o Panx mRNA o di cellule HeLa ectopicamente esprimono isoforme Cx insieme con un marcatore come GFP 79-84.

Per concludere, l'uso della stimolazione meccanica per indurre intercellulare Ca 2 +-onde fornisce un metodo semplice e affidabile per indagare comunicazione intracellulare ed esaminare il contributo e le proprietà dei canali Cx e Panx.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il lavoro di ricerca svolto in laboratorio è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca - Fiandre (FWO; numeri di sovvenzione G.0545.08 e G.0298.11), il Interuniversitario attrazione polacchi Programma (Politica Scienza belga, numero di concessione P6/28 e P7/13) ed è incorporato in una comunità di ricerca FWO supportato. CDH è un borsista post-dottorato della Fondazione di Ricerca - Fiandre (FWO). Gli autori sono molto grati a tutti i membri attuali e precedenti del Laboratorio di Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), il laboratorio del Dr. Leybaert (Ghent University) e di Dr. Vinken (VUB) che ha fornito utili discussioni, ottimizzato procedure o sono stati coinvolti nello sviluppo di strumenti per lo studio della hemichannels connessina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

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Biologia Cellulare Numero 77 Biologia Molecolare Medicina Ingegneria Biomedica Biofisica Immunologia Oculistica Gap giunzioni connessine connessina 43 Calcium Signaling Ca La comunicazione cellulare Comunicazione Paracrine comunicazione intercellulare propagazione delle onde di calcio giunzioni hemichannels cellule endoteliali segnalazione cellulare cellulari isolamento coltura cellulare
La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali
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D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

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