Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

Intercellulär Ca

Abstract

Intercellulär kommunikation är avgörande för samordningen av fysiologiska processer mellan celler i olika organ och vävnader, inklusive hjärnan, lever, retina, cochlea och kärlsystemet. I experimentella inställningar, intercellulär Ca 2 +-vågor kan framkallas genom att applicera en mekanisk stimulans till en enda cell. Detta leder till frisättning av de intracellulära signalmolekyler IP 3 och Ca 2 + att initiera propagering av Ca 2 +-våg koncentriskt från den mekaniskt stimulerad cell till de angränsande cellerna. De huvudsakliga molekylära vägar som kontrollerar intercellular Ca2 +-vågutbredning tillhandahålls av kanaler gap junction genom direkt överföring av IP 3 och hemichannels genom frisättning av ATP. Identifiering och karaktärisering av egenskaper och regleringen av olika connexin och pannexin isoformer såsom kanaler gap junction och hemichannels tillåts av quantification för spridning av den intercellulära Ca 2 +-våg, siRNA, och användningen av inhibitorer av kanaler gap junction och hemichannels. Här beskriver vi en metod för att mäta intercellulär Ca 2 +-våg i monoskikt av primära korneala endotelceller laddad med Fluo4-AM som svar på ett kontrollerat och lokaliserad mekanisk stimulering som framkallats av en akut, kortvarig deformation av cellen som en följd av att peka på cellmembranet med en mikromanipulator kontrollerad glasmikropipett med en spets diameter av mindre än 1 | im. Vi beskriver också isoleringen av primära nötkreatur hornhinnan endotelceller och dess användning som modell för att bedöma Cx43-hemichannel aktivitet som den drivna kraft för intercellular Ca2 +-vågorna genom frisättning av ATP. Slutligen diskuterar vi användning, fördelar, begränsningar och alternativ av denna metod inom ramen för gap junction-kanal och hemichannel forskning.

Introduction

Kommunikationen mellan och signalering är avgörande för samordningen av fysiologiska processer som svar på extracellulära agonister vid vävnaden och hela-orgel nivån 1,2. Det mest direkta sättet att kommunikationen mellan skapas av förekomsten av kanalförbindelser. Kanalförbindelser är plack av kanaler gap junction, som är proteinhaltiga kanaler bildade av head-to-head dockning av två connexin (Cx) hemichannels av angränsande celler 3,4 (Figur 1). Kanalförbindelser tillåta passage av små signalmolekyler med en molekylvikt av mindre än 1,5 kDa, inklusive Ca 2 + eller IP 3 5, vilket leder till och modulera Ca2 +-frisättning från intracellulära förråd av de angränsande cellerna 6 (figur 2). Gap junction kanaler hårt reglerad av intra-och intermolekylära proteininteraktioner och cellulär signalering processer, liksom redox modifiering ochfosforylering 7. GJS underlätta ett samordnat svar på anslutna celler, och därmed utgöra en kemisk och elektrisk syncytium. Till exempel är spridningen av hjärtats aktionspotential över atriella och ventrikulära myocyter medieras av Cx-baserade GJ kanaler 85. CXS inte bara ha en roll som kanaler gap junction, men också bilda oparade hemichannels, fungerar därmed som kanaler i membran på samma sätt som vanliga jonkanaler 8-10 (Figur 1). Hemichannels deltar i parakrina signalering mellan angränsande celler genom att reglera utbytet av joner och signalmolekyler mellan intra-och extracellulära miljön.

I många celltyper (såsom epitelceller, osteoblastceller, astrocyter, endotelceller, etc.) och organ (som hjärna, lever, retina, cochlea och kärlsystemet), intercellulär Ca2 +-vågorna är grundläggande för samordningen av flercelliga svar Ca2 +-nivåer i en viss cell är inte begränsade till denna cell, men propagera till omgivande angränsande celler, varigenom det skapas en intercellulär Ca 2 +-våg 12,13. Dessa intercellulär Ca 2 +-vågor är viktiga för normal fysiologisk reglering av cellskikt som ett syncytium och deras dysreglering har associerats med patofysiologiska processer 11. I hornhinneendotel och epitel, studerade olika grupperna 14-24, inklusive vår egen 25-33, mekanismer och roller kommunikationen mellan. I icke-retbara celler, liksom hornhinnan endotelceller, två distinkta former av kommunikationen mellan inträffar 28,29, nämligen klyftan junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan. Gap junktional kommunikationen mellan innebär ett direkt utbyte av signalmolekyler via gap junctions 7. Gap juncnella kommunikationen mellan är avgörande för att upprätthålla vävnad homeostas, kontrollerar celltillväxt, och inrättande av en synkroniserad svar på extracellulära stressen 10,34,35. I ett antal sjukdomar, är gap junction koppling reducerad på grund av defekta CXS, och härmed påverka gap junktional kommunikationen mellan 36. Detta understryker vikten och påverkan av gapet junktional intracellulär kommunikation i flercelliga organismer. I motsats till gap junktional kommunikationen mellan, är parakrin kommunikationen mellan inte beroende av cell-cell apposition, eftersom det involverar frisättning av diffunderbara extracellulära budbärare (Figur 2). Olika typer av signalerande molekyler frigörs i det extracellulära utrymmet genom att signalera celler. Molekylen transporteras sedan till målcellen där den detekteras av en specifik receptorprotein. Därefter receptor-signalen komplex inducerar ett cellulärt svar, somavslutas genom avlägsnande av signalen, inaktivering eller hyposensibilisering. Släppt lipofila extracellulära signalsystem budbärare penetrera membranet och agera på intracellulära receptorer. Däremot korsar hydrofila budbärare inte plasmamembranet hos den svarande cellen, men fungera som en ligand som binder till ytuttryckta receptorproteiner, som sedan vidarebefordrar signalen till intracellulära miljön. Tre stora familjer av cellyteproteiner proteiner deltar i denna process: jon-kanal-kopplad, enzym-linked, och G-protein-kopplade. Den släpptes Budbärarmolekylen kan agera på receptorer i samma cell (autokrin), på målceller i närheten (parakrint), eller på avlägsna målceller som kräver cirkulationssystemet (endokrin).

I många celltyper, innefattande hornhinneendotel 28,29, är ATP en av de stora hydrofila, parakrina faktorer för förökning av intercellulär Ca 2 +-vågor 37-40. DurIng mekanisk deformation, hypoxi, inflammation eller stimulering av olika agenter, kan ATP frigöras från friska celler 41-44 som svar på skjuvspänning, stretch, eller osmotisk svullnad 44,45. Olika ATP-frigöringsmekanismer har förutsatts, inklusive vesikulär exocytos 44 och en uppsjö av transporttjänster mekanismer, såsom ATP-bindande kassett (ABC) transportörer, plasmalemmal spänningsberoende kanaler anjon 46, P2X7-receptorns 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 och pannexin hemichannels 43,49,53. Extracellulär ATP kan vara snabbt hydrolyseras till ADP, AMP och adenosin 54,55 genom ectonucleotidases som är närvarande i den extracellulära omgivningen. Den extracellulärt släppt ATP och dess metabolit ADP 56 kommer att spridas genom diffusion. Den efterföljande interaktion av dessa nukleotider med purinerga receptorer i de angränsande cellerna har varit inblandad i propagation av intercellulär Ca 2 +-vågor 28,37,51. Två olika klasser av purinerga receptorer finns: adenosin är den främsta naturliga liganden för P1-purinoceptorer, medan både purin (ATP, ADP) och pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider agera på de flesta P2-purinoceptorer 57.

Kommunikationen mellan kan undersökas med olika metoder såsom skrapa lastning, fargöverföring, lokal uncaging av agonister som IP 3 och Ca 2 +, mekanisk stimulering, osv. Här beskriver vi studiet av Ca 2 +-vågutbredning framkallade genom mekanisk stimulering av en enda cell. Fördelen med att studera Ca2 +-vågutbredning genom mekanisk stimulering är att det ger ett enkelt verktyg för att kvantifiera spridningen av Ca2 +-våg över tid och det gör att kvantitativt jämföra olika förbehandlingar av cellerna. I hornhinnans endotel, dessa intercellulära Ca2 +-vågor tillåta en coordinated svar från monolagret, härmed fungerar som en möjlig försvarsmekanism i icke-regenerativ hornhinneendotel hjälper endotelet att motstå extracellulära påkänningar under intraokulär kirurgi, eller vid exponering för inflammatoriska mediatorer under immunavstötning eller uveit 58,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Isolering av hornhinnan endotelceller

Innan du börjar: Isolera celler från friska ögon, som erhållits från ett lokalt slakteri, så snart som möjligt efter enucleating ögat. Se till att ögat var enukleation från en ko med maximalt 18 månader gammal, fem minuter efter slakt och bevaras i Earles Balanced Salt Solution - 1% jodlösning vid 4 ° C under transporten till laboratoriet.

  1. Ta ögat ur Earles balanserade saltlösning - 1% jodlösning och placera den i en petriskål (100 x 20 mm).
  2. Sterilisera ögat med en lösning innehållande 70% etanol och skölj med Earles balanserade saltlösning innehållande 1% jod.
  3. Från detta steg på, arbeta i en steril huva. Försiktigt dissekera hornhinnan från ögat och placera den i en petriskål (35 x 10 mm) innehållande Earles Balanced Salt Solution, med epitelceller skiktet uppåt. Ta försiktigt bort återstående iris vävnad still fäst på hornhinnan om det behövs.
  4. Överför hornhinnan till en annan Earles balanserade saltlösning innehållande Petriskål med endotelcellskikt uppåt och skölj två gånger med Earles balanserade saltlösning.
  5. Överför hornhinnan med endotelskiktet uppåt till ett timglas, vilket är ett skålformat maträtt, och täcka den med tillväxtmedium. Tillväxtmediet består av Dulbeccos modifierade Eagles medium innehållande 25 mM glukos, 10% fetalt bovinserum, 6,6% L-glutamin, 2,5 ng / ml amfotericin-B och 1% antibiotikum-antimykotikum blandning innehållande 10000 enheter / ml penicillin, 10.000 xg / ml streptomycin och 25 | ig / ml amfotericin B.
  6. Avlägsna mediet med en sug-pipett.
  7. Applicera 300 ul av en trypsinlösning (0,5 g / L) till den endothelial lagret av hornhinnan (alla steg som inkluderar trypsin görs med samma koncentration).
  8. Placera timglaset innehåller hornhinnan i en täckt petriskål och lägga den i incubator under 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
  9. Försiktigt skrapa endotelceller från hornhinnan med en brand-polerat krok-formade glas Pasteur pipett i en steril huva.
  10. Suck av lösningen innehållande endotelceller och lägga till odlingskolvar (25 cm 2) innehållande 4 ml odlingsmedium.
  11. Applicera 300 | il tillväxtmedium till hornhinnan och upprepa skrapning och tillsätta lösningen innehållande endotelcellerna till odlingskolven.
  12. Upprepa detta sista steg (1,11) en gång till.
  13. Placera kulturen kolvar innehållande de korneala endotelceller i tillväxtmediet i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
  14. Efter två dagar, tillsätt 6 ml odlingsmedium.
  15. Uppdatera tillväxtmediet varannan dag.

2. Cellodling

  1. Avlägsna odlingsmediet och tvätta cellerna två gånger med Earles balanserade saltlösning, när konfluens nås (inom About 10 dagar efter isolering).
  2. Tillsätt 1,5 ml trypsinlösning till cellerna för att lösgöra dem och placera kolven i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) under 3 till 4 min.
  3. Tillsätt 12 ml tillväxtmedium. Pipettera mediet tre gånger in och ut för att dispergera celler och räkna cellerna.
  4. Seed cellerna med en rörlig del beroende på cellens densitet och lägg dem i inkubatorn. Bered två väl-chambered slides (med en yta på 4,2 cm 2) med ett cellantal av 165.000 celler (celltäthet 39.286 per cm 2). Förbered 80 cm 2 odlingsflaskor för en ny passage vid en densitet av 6250 per cm 2, och tillsätt färskt odlingsmedium upp till en total volym av 25 ml.
  5. Uppdatera mediet varannan dag.
  6. Confluency av cellskiktet uppnås efter 3 till 4 dagar. Använd celler för experiment.
  7. När confluency av cellagret i kolvarna nås, upprepa steg från 2,1 till 2,6. Cellodlingar upp till passagen 2 kan användas feller experiment.

Tre. Mekanisk stimulering för Induktion Kalcium Wave

  1. Fyll på cellerna i chambered slide med 10 iM Fluo-4:00 i fosfatbuffrad saltlösning under 30 min vid 37 ° C under försiktig skakning.
  2. Avlägsna Fluo-04:00-lösning, tvätta cellerna fem gånger med fosfatbuffrad saltlösning, inkubera cellerna med fosfatbuffrad saltlösning och lämna batterierna i minst 5 min vid rumstemperatur före mätning.
  3. Excite vid 488 nm med Argon laser och användning stråldelaren HFT 488, samla fluorescensemissionen vid 530 nm med en longpass utsläpp filter LP 505, ställer hål på minimum. Använd en oljeimmersion 40X mål (Air, 1,2 NA). I experiment med ARL-67156, använd en 10X mål (Air, 0,3 NA).
  4. Sök efter ett område där cellerna är sammanflytande på konfokalmikroskop.
  5. Placera pipetten så att den är vid 45 ° i förhållande till chambered slide och som tangerar cellmembranet.Provocera en kort (≈ 1 sek) mekanisk stimulering till en enskild cell. Den mekaniska stimulering består av en akut, kortvarig deformering av cellen genom att kort röra mindre än 1% av cellmembranet med en glasmikropipett (spetsdiameter <1 ^ m) som är kopplad till en piezoelektrisk kristall nanopositioner, drivs genom en förstärkare som är monterad på en mikro-manipulator. Glaset mikropipetter är gjorda med en mikroelektrod avdragare. Kontrollera att nanopositioner drivs av en spänning mellan 0,2 och 1,5 V under den mekaniska stimulering. En spänning som är högre än 1,5 V kan leda till cellskador. För varje celltyp och villkor, måste den optimala spänningen för mekanisk stimulering utan cellskada noggrant fastställas genom att en serie av spänningar från och låg (0,2 V) till hög (1,5 V) spänningen. Spänningen är ett mått på kraften av stimulering eftersom denna spänning bestämmer den mekaniska spänning och töjning som tillämpas till cellmembranet. Denkraft mekanisk stimulering kan beräknas genom att multiplicera den mekaniska belastningen med området. Eftersom både området (<3,14 ^ m 2) och den mekaniska belastningen är mycket låg, är den kraft av den mekaniska stimuleringen låg. (Observera att när en cell är skadad, och slår av fluorescenserna ut ur cellen och cellen mörker.)
  6. Mät rumsliga förändringar av [Ca 2 +] i efter mekanisk stimulering med det konfokala mikroskopet.
  7. Samla och lagra bilder.
  8. Rita en polygonal region av intresse för att definiera den totala ytan av responsiva celler (aktivt område, AA) med hjälp av programmet av det konfokala mikroskopet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alla experiment utförs i enlighet med alla relevanta riktlinjer, föreskrifter och tillsynsmyndigheter och protokoll som demonstreras utförs under ledning och godkännande av djurets skötsel och användning kommitté av KU Leuven.

I nötkreatur hornhinnans endotelceller (BCEC), är funktionella kanalförbindelser uttrycks och både lucka junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan väsentligt bidra till kommunikationen mellan på ett interaktivt sätt, men det viktigaste smittvägen har visat sig vara den parakrina intercellulära kommunikationsväg förmedlas av ATP frisättning genom Cx43-baserade hemichannels 28,29. ATP och ADP hydrolyseras till adenosinmonofosfat (AMP) av ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase), och därefter till adenosin genom 5'-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP och ADP bidrar tillCa 2 +-vågutbredning genom att binda till P2Y1 och P2Y2-receptorer 28,29. Båda receptorer par till PLC via Gq och därigenom framkalla IP 3-inducerad Ca2 +-frisättning (Figur 2). I BCEC, stimulering av de purinerga P2Y receptorer resulterar i en snabb ökning av [Ca2 +] i, som är okänslig för avlägsnande av [Ca2 +] o 60. [Ca2 +] i-toppar framkallade av agoniststimulering följs av en [Ca2 +] i nedgång, som kan leda till en stabil, agonistberoende höjd, [Ca2 +] o-beroende oscillerande svängningar, eller en återgång till baslinjen 60-62. I BCEC har det funnits bevis för att Ca 2 +-frisättning sker via en bana som gäller PLC och IP 3 29. Tömning av IP 3-känsliga affärer leder till en initial topp i [Ca2 +] i, därefter följt av en capacitative Ca2 +-inflödet som leder till uppkomsten av platåfasen 63.

Mekanisk stimulering leder till en snabb ursprungliga ökningen i Ca 2 + som har hämtats från den punkt på den stimulans och sedan sprider sig i hela mekaniskt stimulerad cell. Slutligen, den intracellulära Ca2 +-nivåer sakta minska tillbaka till baslinjen nivå. När når cellgränserna, de intercellulära Ca2 +-våg utbreder sig till de omgivande närliggande celler (NB) i ett vågliknande sätt som en Ca2 +-transient, som sönderfaller till basal nivå (Figur 3). I kontrollbetingelser, +-transienter Ca 2 observerades upp till cirka 4-8 cellager bort från den mekaniskt stimulerad cell (Figur 3). Kurvan (vid den högra sidan av panelerna i fig. 3) visar tidsförloppet av Ca 2 +-transienter (representerade som normaliserade fluorescens (NF) värden) iden mekaniskt stimulerade cellen och angränsande cellskikten 04:59 (NB1, NB2, NB3, NB4 och NB5). Av figur 3, är det tydligt att de normaliserade fluorescens minskar, medan tidsfördröjningen för starten av [Ca 2 +] i-rise ökar med ökande avstånd från den mekaniskt stimulerad cell. Den maximala normaliserade fluorescens i mekaniskt stimulerade cellen nåddes 0,95 ± 0,04 sek. Efter att ha nått en maximal normaliserad fluorescens värde, visade den normaliserade fluorescens en mycket gradvis och långsam nedgång, återvänder till den basala värdet 152 efter tillämpningen av den stimulans 25 ± 6 sek.

Hämning av parakrina intercellulära kommunikationsväg genom att använda en kombination av exogen apyras VI (5 U / ml under 30 min) och apyras VII (5 U / ml under 30 min) orsakade en 7,5-faldig minskning i det område som omfattas av Ca2 +-våg, den så kallade aktiva området (AA, P <0,001, N = 7, N = 35) (Figur 4A). Apyras är känt för att hydrolysera ATP och ADP. Apyras VI har en hög ATPas / ADPase förhållandet och apyras VII preferentiellt hydrolyserar ADP 56.

Eftersom parakrin kommunikationen mellan i hornhinneendotel stor del sker genom ATP-frisättning, 28,29 och ATP hydrolyseras i det extracellulära utrymmet genom ectonucleotidases, kända för att uttryckas i hornhinnans endotel, 29,64,65 vi undersökt effekten på AA i förhållanden där ATP-hydrolys inhiberas med hjälp ectonucleotidase hämmare. Hämning av ectonucleotidases med ARL-67156 (ARL, 100 | iM under 30 min) resulterade i en stark förbättring av Ca 2 +-vågutbredning, vilket har visats tidigare i BCEC 25,26,28,29. Exponeringen av BCEC ÅRL orsakade en 3,5-faldig ökning av AA jämfört med kontroll förhållanden (P <0,001, N = 12, n = 60) (Figur 4B).

I pregare studier i vårt laboratorium, connexin mimetiska peptider (Gap26 och Gap27, tabell 2) användes för att särskilja de relativa bidragen från gap junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan till intracellulär Ca2 +-vågutbredning efter mekanisk stimulering, med en inaktiv peptid ( Tabell 2) som en kontroll 28,29.

Hämning av kanaler gap junction med Gap27 minskade signifikant förökning av Ca 2 +-våg i BCEC 30. AA var signifikant sänkt vid förbehandling med Gap27 (300 | iM under 30 min) (P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabell 1). Hämning av connexin hemichannels med connexin-mimetiska peptid Gap26 28,30 reducerade signifikant förökning av Ca 2 +-våg i BCEC 28. AA var signifikant sänkt vid förbehandling med Gap26 (300 | iM under 30 min)(P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabell 1).

Vi visade också att 43-kDa Cx isoformen var en huvudkomponent bakom hemichannel-medierad ATP frisättning som framkallar intercellular Ca2 +-vågorna. Med hjälp av två individuellt utformade siRNA-molekyler riktade Cx43, fann vi att AA reducerades med ca 65% 33 (tabell 1). Detta underbyggs ytterligare av experiment med TAT-L2 (100 iM, 30 min), en cellpermeabel peptid som motsvarar den andra halvan av den intracellulära slingan av Cx43 (tabell 2), vilket ledde till en kraftig minskning av AA (P <0,001 , N = 3, n = 30) (tabell 1). Huvudsakligen var denna minskning AA av TAT-L2 inkubation inte observerats i frånvaro av parakrina signalering, stödja idén om att TAT-L2 selektivt hämmar Cx43-baserade hemichannels men inte gap kanaler junction 33. Dessutom, en inaktiv TAT-L2-mutant (TAT-L2 H126K/I130N) kan användas som en kontroll (tabell 2).

Figur 1
Figur 1. Bildning av kanaler gap junction och hemichannels: schematisk representation. A. En connexin eller pannexin hemichannel bildas när sex connexiner eller pannexins, som är fyra-transmembran-domän-innehållande proteiner, är radiellt arrangerade runt en central por. Hemichannels är belägna i plasmamembranet. De kan bestå av identiska protein subtyper (homomeric hemichannels) eller de kan bestå av olika protein subtyper, när två eller flera isoformer uttrycks i samma cell (heteromera hemichannels). En homotypisk gap junction kanalresultat från dockning av två identiska homomeric eller heteromera hemichannels. En heterotypiska gap junction kanalresultat från docking av två olika homomeric eller heteromer kanaler. B. Schematisk struktur connexin och pannexin gap junction kanaler som förbinder två angränsande celler och hemichannels.

(Delvis ändrat från 66)

Denna siffra publicerades ursprungligen i BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, och Bernard Himpens. Pannexins, avlägsna släktingar till connexin familjen med specifika cellulära funktioner. Bioessays. 2009, 31, 953-974 (2009). Bioessays. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. I icke-retbara celler, den itercellular Ca 2 +-vågutbredning innebär både gap junktional intercellulär kommunikation och parakrina intercellulär kommunikation. Vid mekanisk stimulering av en enda cell, en Ca 2 +-rise sker i mekaniskt stimulerad cell (MS) via Ca2 +-inflöde och / eller Ca2 +-frisättning. Därefter Ca2 +-rise utbreder från mekaniskt stimuleras till angränsande celler (NB) som en intracellulär Ca2 +-vågen. Den intercellular förökning involverar två mekanismer, nämligen klyftan Junktional kommunikationen mellan och parakrin kommunikationen mellan. I spalten junktional kommunikationen mellan förekommer en direkt utbyte av en medlare (IP 3 och / eller Ca 2 +) mellan cytoplasmor av angränsande celler via kanalförbindelser (GJS). I parakrin kommunikationen mellan, är en budbärare (t.ex. ATP) släpps ut i det extracellulära utrymmet, vilket verkar på receptorer belägna på the ytan av angränsande celler. Hemichannels (HC) eller andra mekanismer förmedlar detta ATP-frisättning (se text). Ectonucleotidases hydrolyserar ATP till ADP och AMP. ATP och ADP verkar på P2Y och / eller P2X receptorer på angränsande celler. (Taget från 66.)

Denna siffra publicerades ursprungligen i BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, och Bernard Himpens. Pannexins, avlägsna släktingar i connexin familjen med specifika cellulära funktioner. Bioessays. 2009. 31, 953-974 (2009). Bioessays.

Figur 3
Figur 3. Kalcium vågutbredning i styrvillkor i BCEC. Mekanisk stimulering inducerade kalcium transienter visas vid olika tidpunkter under kontroll förhållanden i BCEC genom representativa pseudo-färgade fluorescens bilder. Den fluorescence intensitet före stimulering visas i den första bilden. Den vita pilen i den andra bilden identifierar mekaniskt stimulerad cell. Den kalcium vågen propagerar till sex angränsande cellager med en total yta av celler som nås av den våg (aktiv yta: AA) av 62.870 im 2.

Den högra panelen med linjediagram visar tidsförloppet av normaliserade fluorescens värde (NF) i mekaniskt stimulerade cellen (MS) och det genomsnittliga värdet av NF i närbelägna celler (NB) skikten 1 till 5 (NB1 till NB5). (Delvis modifierad från 25.)

Denna siffra publicerades ursprungligen i Investigative Ophthalmology and Visual Science. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, och Bernard Himpens. Trombin hämmar intercellular förökning kalcium våg i hornhinnan endotelceller genom modulering av hemichannels och korsningar gap. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. Investigative Ophthalmology and Visual Science.

Figur 4
Figur 4. Betydande förändringar i spridningen av intracellulär Ca2 +-vågorna efter behandling med exogena nucleotidases (vänster) och med ectonucleotidase hämmare (till höger) i BCEC. A. Signifikant minskning i AA efter behandling av BCEC med exogena apyrases (apyras VI (5 U / ml) och apyras VII (5 U / ml) under 30 min) som hydrolyserar ATP och ADP, härmed inhibera parakrina intercellulära kommunikationsväg (N = 7, n = 35). * Betecknar P <0,001 i närvaro kontra frånvaro av apyras B. Betydande ökning av AA efter behandling av BCEC med en selektiv ectonucleotidase hämmare ARL-67156 (ARL, 100 iM för 30 min)., Örtig enhancing den parakrina intercellulära kommunikationsväg (N = 12, n = 60). * Betecknar P <0,001 i närvaro kontra frånvaro av ARL.

Normaliserad AA St fel N n Statistik
styra 100 8,31 3 30
siScramble 87,97 9,3 3 30
siCx43-1 32,45 8,23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7,06 3 30 *
Kontroll peptid 91,68 6,5 8 40
Gap 26 46,67 4,24 8 40 *
Gap 27 53 4,76 8 40 *
TAT-L2 6,99 0,71 3 30 *

Tabell 1. Effekt av siRNA-molekyler riktade Cx43, connexin mimetiska peptider och cellpermeabel peptid TAT-L2 på den normaliserade aktiva området (AA) i BCEC.
N representerar antalet dagar av experiment, representerar n antalet mekaniska stimuleringar. * Betecknar p <0,001 jämfört med kontrollbetingelser.

<tr>
AA-sekvens
Kontroll peptid SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

Tabell 2. Aminosyrasekvenser för de använda peptiderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta manuskript, beskriver vi en enkel metod för att mäta intercellulär Ca 2 +-vågutbredning i monoskikt av primära bovina korneala endotelceller genom att tillhandahålla en lokaliserad och kontrollerad mekanisk stimulering med användning av en mikropipett. Mekaniskt stimulerade celler reagerar med en lokal ökning av intracellulär IP 3 och Ca 2 +, båda av vilket är väsentliga intracellulära signalerande molekylar som driver intercellulär Ca 2 +-vågutbredning 11,67. IP tre överförs direkt till neighboring celler via kanaler gap junction fem, medan Ca två + provocerar öppnandet av hemichannels och frisläppandet av ATP 68,69, som triggar Ca två +-signaler i neighboring celler genom aktivering av G-proteinkopplad P2 receptorer 37 till 40. Den relativa bidraget av kanaler gap junction och hemichannels i denna process kan kännetecknas av användningen av Cx-mimetiskapeptider, ATP-nedbrytande enzymer (ectonucleotidases) och hämmare av ectonucleotisdases. Egenskaperna hos mekanisk stimulering-inducerad intercellulär Ca 2 +-vågutbredning i bovina korneala endotelceller har blivit grundligt kännetecknad av vårt labb 25-33. Våra resultat indikerar att den intercellulära Ca 2 +-vågutbredning drivs främst av ett Cx-hemichannel-medierad frisättning av ATP, med Cx43 leka en framträdande roll. Som sådan, är denna metod tillämpas på primära bovina korneala endotelceller särskilt lämpliga att identifiera eller karakterisera regleringen av Cx43 hemichannels vid endogena nivåer i nativa celler. Använda denna metod, har vi funnit att aktiviteten av Cx43 hemichannels kritiskt styrs av den aktomyosin cytoskelettet, vilket kan tjäna som en endogen broms förebygga överdriven, och därmed deleterious, Cx43 hemichannel öppning 25,31,32. Vi klarlägga ytterligare de molekylära mekanismerna bakom denna reglering och hittaen viktig roll av intramolekylära loop / svans interaktioner som är väsentliga för öppningen av Cx43 hemichannels 33.

Är tydligt att detta systemet mycket lämplig för att studera funktionen av Cx och Panx-baserade kanaler gap junction och hemichannels och är definitivt inte begränsad till bovina korneala endotelceller men är anpassningsbar till praktiskt taget vilken celltyp och också mer komplexa vävnader, såsom har visats i hjärnan, där mekanisk stimulering utlöste stor intercellulär Ca två +-vågor som omfattar hela hemisfären 70. Olika verktyg är närvarande för att utvärdering av bidraget av kanaler gap junction och hemichannels, inbegripet Cx-mimetiska peptider, ATP-nedbrytande enzymer, inhibitorer av ectonucleotidases och farmakologiska föreningar gillar karbenoxolon och 10 Panx1 (Tabell 2) 49,50. För att bestämma bidraget av ett viss Cx eller Panx isoformen i denna process, omsorgsfullt utformade prober siRNA targeting två oberoende regioner av mRNA och krypteras en kontroll bör användas. Den Omfattningen av ÖVERVÄLDIGANDE bör bestämmas vid den totala proteinet nivå med hjälp av Western-blotting-assays och den enda cell nivå med hjälp fluorescent mikroskopi. Den transfektionseffektivitet av de siRNA sonder i de experimentella cellmonoskikten bör bedömas genom fluorescerande mikroskopi. För detta kan en utveckla en duplex siRNA i vilken en fluorescerande etiketten har inkorporeras vid tre-änden av senssträngen. Det är viktigt att notera att för korrekt analys, en framstående reduktion av Cx eller Panx isoformen (> 90% minskning), såväl som en homogen transfektion av de siRNA duplexar i cellen monoskiktet (> 90% av cellerna transfekterade med siRNA probe) bör erhållas. Den Selektiviteten av de utformade siRNA sonder mot målet bör bedömas 71. I Kort sagt, bör dessa verktyg vara valideras så att de inte påverkar uttrycket av andra Cx eller isoformer Panx eller annan nyckel comnenter vägbeskriving intercellulär Ca två +-vågor, gillar P2X eller P2Y receptorer. För att bedöma bidraget av Cx43 hemichannels, har vi samarbetat med labbet av Dr Leybaert i att utveckla ett cell-permeabel peptid motsvarande till den andra halvan av den intracellulära slingan av Cx43 (TAT-L2) som fungerar som en selektiv, potent inhibitor av Cx43 hemichannels samtidigt som upprätthållande Cx43-gap aktivitet junction kanal 33. I våra studier, använder vi 100 | iM TAT-L2 för att erhålla en fullständig inhibering av Cx43 hemichannels, men lägre koncentrationer kan vara tillräckligt 72. TAT-L2H126K/I130N rekommenderas som en negativ kontroll 73. För att utvärdering av bidraget av Panx1 kanaler, kan den 10Panx1-peptiden tillämpas. Dessa verktyg är viktigt inte bara för exklusive plasma-membransönderdelning (se nedan), men också påvisande av att parakrina ATP signalering medierar de mekanismer av intercellulär Ca 2 +-wave förökning genom hemichannels och inte genom andra mekanismer (liksom maxi-anjon-kanaler eller om frisläppandet av ATP-haltiga vesiklar). Slutligen, som för alla studier med användning av primära celler, måste de cellodlingssystem förhållandena och antalet av passagerna vara standardiseras, eftersom de biologiska egenskaperna hos de cellerna och sålunda den expressionen profilen av den olika Cx-och isoformer Panx kan förändras över tiden 26.

Trots det finns det ett antal nackdelar till denna metod. En stor nackdel till metoden är att mekanisk stimulering kan utlösa plasma membransönderdelning, vilket leder till införsel av extracellulär Ca 2 + och frisläppandet av signalmolekyler gillar ATP, som båda vilket låg till grund bona fide intercellulär Ca två +-vågutbredning elva. Detta komplicerar definitivt en (kvantitativ) analys av den intercellulära Ca 2 +-våg. Därför, är det starkt rekommenderat att man bör i) använda ordentliga kontroller, dvs cellinjer som saknar uttrycket av Cx eller Panx isoformer, och verktyg som integrerfere med funktionen av Cx-och Panx som kanaler gap junction och / eller hemichannels och ii) standardisera det mekanisk stimulering förfarandet (se till att under den mekaniska stimulus den nanopositioner drivs av ett spänning mellan 0,5 och 2 V).

Vidare, är det viktigt att notera att denna metod inte stå av sig själv, men bör underbyggas genom ytterligare experimentella metoder för att studera Cx och Panx-kanalerna. Detta kan uppnås genom att använda en lokal ökning av intracellulära signalerandemolekylar som deltar i mekanisk-stimulering-medierad intercellulär Ca 2 +-vågutbredning, i likhet med uncaging av intracellulär IP 3 eller Ca 2 + 11,74. För att initiera intercellulär Ca 2 +-våg oberoende av mekanisk stimulering, kan man använda mikro-injektion, såsom rekombinant proapoptotisk Bax 11,75 och foto-aktiverbar Ca2 +-buffertar som diazo-2 som orsakar en lokal nedgång i extracellulär [Ca två + 76, ett känd trigger för hemichannel öppning. Alternativt, kan man använda in situ elektroporering av cell-impermeabla signalerandemolekylar som utlösa intracellulär Ca 2 +-frisättning och intercellulär Ca 2 +-vågor, såsom IP 3 67,68. Den senare tekniken används också för att undersöka spridningen av celldöd 5,77. Dessa icke-mekaniska stimuli ger ett bättre bedömning av den stimulus intensiteten-respons. Utöver dessa Ca 2 +-vågutbredningsproblem metoder, är det viktigt att bestämma den aktiviteten hos de Cx eller Panx kanaler med hjälp andra tillvägagångssätt, inbegripet fastställandet av hydrofilt färgämnesupptagning (som Lucifer gul) 78 och frisläppandet av ATP inte bara i respons på mekanisk stimulering men också som svar på extracellulär Ca två +-buffertar (som EGTA) och intracellulära Ca två +-frisättning molekyler (som den Ca 2 +-jonofor A23187) 11,74. Dessutom, tHan bästa beviset för reglering på kanalens nivå ges av elektrofysiologiska experiment, antingen dubbel spänning system klämma eller hel-Kyvettlängden klämma av Xenopus oocyter injicerade med Cx eller Panx mRNA eller HeLa-celler ectopically uttrycker Cx isoformer tillsammans med en markör som GFP 79-84.

Avslutningsvis, användning av mekanisk stimulering för att framkalla intercellular Ca2 +-vågorna ger en enkel och tillförlitlig metod för att undersöka intracellulär kommunikation och undersöka bidrag och egenskaper Cx och Panx kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Authors har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Forskningen utförs i laboratoriet har finansierats med bidrag från Research Foundation - Flandern (FWO, bidrag nummer G.0545.08 och G.0298.11), den Interuniversity sevärdhet polackerna Program (belgisk Science Policy, licensnummer P6/28 och P7/13) och är inbäddad i en FWO-stödd forskning community. CDH är en forskarassistent i Research Foundation - Flandern (FWO). Författarna är mycket tacksamma för alla nuvarande och tidigare medlemmar av Laboratoriet för molekylär och cellulär signalering (KU Leuven), dr SP Srinivas (Indiana University School of Optometri, USA), laboratoriet av Dr Leybaert (Ghent University) och Dr Vinken (VUB) som gav nyttiga diskussioner, optimerade rutiner eller var inblandade i utvecklingen av verktyg för studier av connexin hemichannels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Tags

Cellular Biology molekylärbiologi medicin medicinsk teknik biofysik immunologi oftalmologi kanalförbindelser connexiner Connexin 43 Kalcium signalering Ca Cell Kommunikation parakrina Kommunikation Intercellulär kommunikation kalcium vågutbredning kanalförbindelser hemichannels endotelceller cellsignalering cell isolering cellodling
Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter