Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

Intercellulært Ca

Abstract

Intercellulær kommunikasjon er viktig for samordning av fysiologiske prosesser mellom celler i en rekke organer og vev, inkludert hjernen, leveren, retina, sneglehuset og blodkar. I eksperimentelle innstillinger, intercellulære Ca 2 +-bølger kan bli fremkalt ved å anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse av de intracellulære signalmolekyler IP 3 og Ca 2 + som initierer formering av Ca 2 +-bølge konsentrisk fra det mekanisk stimulert celle til nabocellene. De viktigste molekylære mekanismer som styrer intercellulært Ca 2 +-bølgeutbredelse leveres av gap junction kanaler gjennom direkte overføring av IP 3 og ved hemichannels gjennom utgivelsen av ATP. Identifisering og karakterisering av egenskapene og regulering av ulike connexin og pannexin isoformer som gap junction kanaler og hemichannels er tillatt av quantification for spredning av den intercellulære Ca 2 +-bølge, siRNA, og anvendelse av inhibitorer av gap junction kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle intracellulære Ca2 +-bølge i monolag av primære corneale endotelial-celler lastet med Fluo4-AM som reaksjon på en kontrollert og lokalisert mekanisk stimulus provosert av en akutt, kortvarig deformasjon av cellen som et resultat for å trykke på cellemembranen med en mikromanipulator-styrt glass mikropipette med en spiss diameter på mindre enn 1 pm. Vi beskriver også isolasjon av primære bovine corneale endotelial-celler og dens bruk som modellsystem for å vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som det drevne kraft for intercellulær Ca 2 +-bølger gjennom frigjøring av ATP. Avslutningsvis diskuterer vi bruk, fordeler, begrensninger og alternativer av denne metoden i sammenheng med gap veikryss kanal og hemichannel forskning.

Introduction

Intercellulær kommunikasjon og signal er vesentlig for koordinering av fysiologiske prosesser som respons på ekstracellulære agonister ved vev-og hel-organ nivå 1,2. Den mest direkte måten å intercellular kommunikasjon er skapt av forekomsten av gap veikryss. Gap veikryss er plaketter av gap junction kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet av head-to-head dokking av to connexin (Cx) hemichannels av tilstøtende celler 3,4 (figur 1). Gap veikryss tillate passasje av små signalmolekyler med en molekylvekt på mindre enn 1,5 kDa, blant Ca 2 + eller IP 3 5, forårsaker og modulere Ca2 +-frigjøring fra de intracellulære lagre av nabocellene 6 (figur 2). Gap junction kanaler er strengt regulert av intra-og intermolekylær protein interaksjoner og av cellulære signalering prosesser, som redoks modifikasjon ogfosforylering 7. Gjs rette for koordinert respons av tilkoblede celler, og dermed fungerer som en kjemisk og elektrisk syncytium. For eksempel, er spredning av kardial aksjonspotensiale tvers av de atriale og ventrikulære myocytter mediert av Cx-baserte GJ kanaler 85. CXS ikke bare har en rolle som gap junction kanaler, men også danne uparede hemichannels, og derved fungerer som kanaler i membraner på samme måte som vanlige ionekanaler 8-10 (figur 1). Hemichannels delta i parakrine signalering mellom nabocellene ved å kontrollere utveksling av ioner og signalmolekyler mellom intra-og ekstracellulære miljøet.

I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytes, endotelceller, osv.) og organer (som hjerne, lever, netthinne, sneglehuset og blodkar), intracellulære Ca 2 +-bølger er grunnleggende for koordinering av flercellede svar 2 +-nivåer i en viss celle er ikke begrenset til denne celle, men forplanter seg til de omkringliggende nabocellene, for derved å etablere et intercellulært Ca 2 +-bølge 12,13. Disse intercellulært Ca 2 +-bølger er viktig for normal fysiologisk regulering av celle lag som syncytium og deres dysregulation har vært forbundet med patofysiologiske prosesser 11. I hornhinnen endotelet og epitel, studerte ulike grupper 14-24, inkludert vår egen 25-33, mekanismer og roller intercellular kommunikasjon. I ikke-eksiterbare celler, som corneale endotelial-celler, to forskjellige moduser av intercellulær kommunikasjon forekomme 28,29, nemlig gap junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon. Gap junctional intercellular kommunikasjon innebærer en direkte utveksling av signalmolekyler via gap veikryss 7. Gap juncnale intercellular kommunikasjon er avgjørende for å opprettholde vev homeostase, kontrollere cellevekst, og etablere en synkronisert svar på ekstracellulær stresset 10,34,35. I et antall patologiske tilstander, er gap junction kopling redusert på grunn av defekte CXS og herved påvirker gapet junctional intercellulær kommunikasjon 36. Dette understreker viktigheten og innflytelse gap junctional intercellular kommunikasjon i flercellede organismer. I motsetning til gapet junctional intercellulær kommunikasjon, er parakrin intercellulær kommunikasjon ikke avhengig av celle-celle-apposisjon, siden det innebærer frigjøring av diffunderbart ekstracellulære budbringere (figur 2). Ulike typer signalmolekyler blir utgitt i ekstracellulære rommet ved å signalisere celler. Molekylet blir deretter transportert til målcellen hvor det detekteres av et spesifikt reseptorprotein. Deretter reseptor-signal kompleks induserer en cellulær respons, somble avsluttet ved fjerning av signalet, inaktivering eller desensitivisering. Utgitt lipofile ekstracellulære signalmolekyler budbringere trenge gjennom membranen og handle på intracellulære reseptorer. I motsetning, gjør hydrofile budbringere ikke krysse plasmamembranen hos det reagerer celle, men opptrer som en ligand som binder seg til overflaten-uttrykte reseptor proteiner, som deretter videresender signalet til det intracellulære miljøet. Tre store familier av celleoverflaten reseptor proteiner delta i denne prosessen: ion-channel-forbundet, enzyme-linked, og G protein-koblet. Den frigjorte messenger molekyl kan opptre på reseptorene av den samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhet (parakrine), eller på fjerne målceller som krever sirkulasjonssystemet (endokrine).

I mange celletyper, inkludert corneal endothelium 28,29, ATP er en av de store hydrofile, parakrine faktorene som driver forplantningen av intercellulære Ca 2 +-bølger 37-40. During mekanisk deformasjon, hypoksi, betennelse eller stimulering av ulike agenter, kan ATP bli løst fra friske celler 41-44 i respons til skjærspenning, strekke, eller osmotisk hevelse 44,45. Forskjellige ATP-frigjøringsmekanismer er blitt postulert, inkludert vesikulært exocytose 44 og en mengde av transport-mekanismer, slik som ATP-bindende kassett (ABC) transportører, plasmalemmal spenningsavhengige anion kanaler 46, P2X7 receptor kanaler 47,48, samt connexin hemichannels 49-52 og pannexin hemichannels 43,49,53. Extracellular ATP kan være hurtig hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin 54,55 ved ectonucleotidases som er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært utgitt ATP og dets metabolitt ADP 56 vil spre seg gjennom diffusjon. Den etterfølgende interaksjon av disse nukleotidene med purinergiske reseptorer i de nærliggende celler har vært implisert i propagation av intercellular Ca 2 +-bølger 28,37,51. To forskjellige klasser av purinergiske reseptorer finnes: adenosin er den viktigste naturlige ligand for P1-purinoceptors, mens både purine (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinoceptors 57.

Intercellulær kommunikasjon kan bli undersøkt av ulike metoder som skrape lasting, fargestoff overføring, lokale uncaging av agonister som IP 3 og Ca 2 +, mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet av Ca 2 +-bølgeutbredelse fremkalt ved mekanisk stimulering av en enkelt celle. Fordelen med å studere Ca 2 +-bølgeutbredelse av mekanisk stimulering er at det gir et enkelt verktøy for å kvantifisere spredningen av Ca 2 +-bølge over tid, og det gir kvantitativt sammenligne ulike forbehandling av cellene. I hornhinnen endotelet, disse intercellulært Ca 2 +-bølger tillate en cokoordinert respons fra monolaget, herved opptrer som en mulig forsvarsmekanisme av den ikke-regenerative corneal endothelium hjelpe endotelet til å motstå påkjenninger under ekstracellulære intraokulær kirurgi, eller ved eksponering for inflammatoriske mediatorer under immun avvisning eller uveitt 58,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Isolering av Hornhinnen endotelceller

Før du begynner: Isoler celler fra friske øyne, hentet fra et lokalt slakteri, så snart som mulig etter enucleating øyet. Sørg for at øyet ble enucleated fra en ku av maksimale 18 måneder gammel, fem minutter etter avliving og bevart i Earles Balanced Salt Solution - 1% jod-løsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet.

  1. Ta øyet ut av Earles Balanced Salt Solution - 1% jod løsning og plassere den i en petriskål (100 x 20 mm).
  2. Steriliser øyet med en oppløsning inneholdende 70% etanol og skyll med Earles balanserte saltoppløsning inneholdende 1% jod.
  3. Fra dette trinnet på, arbeide i et sterilt hette. Nøye dissekere hornhinnen fra øyet og legg den i en petriskål (35 x 10 mm) som inneholder Earles Balanced Salt Solution, med epitelcellelaget vendt oppover. Forsiktig fjerne eventuelle gjenværende iris vev still festet til hornhinnen hvis nødvendig.
  4. Overfør hornhinnen til en annen Earles balanserte saltoppløsning inneholdende petriskål med den endoteliske cellelaget oppover og skylles to ganger med Earles balanserte saltoppløsning.
  5. Overfør hornhinnen med endotelial lag vendt oppover til et timeglass, som er en cup-formet parabol, og dekke den med vekst medium. Vekstmediet består av Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 25 mM glukose, 10% føtalt bovint serum, 6,6% L-glutamin, 2,5 ug / ml amfotericin-B og 1% antibiotisk-antimykotisk blanding inneholdende 10.000 enheter / ml penicillin, 10 000 pg / ml streptomycin, og 25 ug / ml amfotericin B.
  6. Fjern medium med en suge-pipette.
  7. Påfør 300 pl av en trypsin-oppløsning (0,5 g / l) til det endoteliale lag av hornhinnen (alle trinnene som inkluderer trypsin utføres ved bruk av den samme konsentrasjon).
  8. Plasser timeglasset inneholder hornhinnen i en tildekket petriskål og legg den i økningenubator i 30 min ved 37 ° C og 5% CO 2.
  9. Forsiktig skrape endotelceller bort fra hornhinnen med en brann-polert krok-formet glass Pasteur pipette i et sterilt hette.
  10. Avsuges løsningen inneholdende endotelceller og legge det til kultur kolber (25 cm 2) inneholdende 4 ml kulturmedium.
  11. Påfør 300 ul vekstmedium til hornhinnen og gjenta skraping og tilsette oppløsningen inneholdende endotelceller til kulturen kolbe.
  12. Gjenta dette siste trinnet (1.11) en gang til.
  13. Plasser kultur-kolber inneholdende de corneale endotelial-celler i vekstmedium i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  14. Etter to dager, tilsett 6 ml kulturmedium.
  15. Forfrisk vekstmediet annenhver dag.

2. Cell Culture

  1. Fjern kulturmediet og vaske cellene to ganger med Earles balanserte saltoppløsning, når konfluens blir nådd (innen About 10 dager etter isolasjon).
  2. Tilsett 1,5 ml trypsin-løsning til cellene for å løsne dem og plassere kolben i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 3 til 4 min.
  3. Tilsett 12 ml vekstmedium. Pipetter middels tre ganger inn og ut for å spre cellene og telle cellene.
  4. Seed cellene med en variabel brøkdel avhengig celle tetthet og sette dem i kuvøse. Forbered to godt kamret lysbilder (med et areal på 4,2 cm 2) med et celletall på 165.000 celler (celle tetthet 39 286 per cm 2). Forbered 80 cm 2 kultur kolber for en ny passasje ved en densitet på 6250 pr cm 2, og tilsett friskt dyrkningsmedium inntil et totalt volum på 25 ml.
  5. Oppdatere medium annenhver dag.
  6. Confluency av celleskiktet nås etter 3 til 4 dager. Bruk celler for eksperimenter.
  7. Når konfluens av cellelaget i kolbene er nådd, gjentas trinn 2.1 til 2.6. Cellekulturer opptil passasje 2 kan brukes feller eksperimenter.

3. Mekanisk stimulering for Induksjon Kalsium Wave

  1. Last inn cellene i kamret lysbilde med 10 uM Fluo-4 AM i fosfat-bufret saltvann i 30 minutter ved 37 ° C mens forsiktig risting.
  2. Fjern Fluo-4 AM løsning, vaske cellene fem ganger med fosfat-bufret saltvann, inkuberes cellene med fosfat-bufret saltvann og la cellene i minst 5 minutter ved romtemperatur før måling.
  3. Excite ved 488 nm med Argon laser og bruk strålesplitter HFT 488, samle fluorescensemisjonen på 530 nm ved hjelp av en longpass utslipp filter LP 505, sett pinhole på minimum. Bruk en olje nedsenking 40X objektiv (Air, 1.2 NA). I forsøk med ARL-67156, bruk en 10X objektiv (Air, 0.3 NA).
  4. Søke etter et felt der cellene er konfluent på konfokalmikroskop.
  5. Posisjon pipetten slik at den er på 45 ° i forhold til kammer lysbilde og rørende cellemembranen.Provosere en kort (≈ 1 sek) mekanisk stimulering til en enkelt celle. Den mekaniske stimulering består av en akutt, kortvarig deformasjon av cellen ved å berøre mindre enn 1% av cellemembranen med en glass mikropipette (spiss diameter på <1 mikrometer) som er koplet til et piezoelektrisk krystall nanopositioner, drives gjennom en forsterker som ligger montert på en mikro-manipulator. Glasset mikropipettene er laget med en microelectrode avtrekker. Kontroller at nanopositioner drives av en spenning mellom 0,2 og 1,5 V i løpet av mekanisk stimulering. En spenning høyere enn 1,5 V kan resultere i celleskade. For hver celle type og tilstand, må den optimale spenning for mekanisk stimulering uten celleskade være nøye bestemt ved å anvende en rekke spenninger som starter fra lav (0,2 V) til høy (1,5 V) spenning. Spenningen er et mål for styrken av den stimulering siden denne spenningen bestemmer den mekaniske stress og belastning som er festet til cellemembranen. Denstyrken av den mekaniske stimulering kan beregnes ved å multiplisere den mekaniske belastningen med området. Siden både området (<3.14 mikrometer 2) og den mekaniske påkjenninger er meget lav, er kraften av den mekaniske stimulering lav. (Merk at når en celle er skadet, blir fluorescens lekker ut av cellen og cellen mørkt.)
  6. Mål romlige endringer i [Ca 2 +] i følge mekanisk stimulering med konfokalmikroskop.
  7. Samle inn og lagre bilder.
  8. Tegn et polygonalt område av interesse for å definere det totale areal av responsive celler (aktive område, AA) ved hjelp av programvaren i konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle eksperimentene er utført i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og kontrollorganer og protokollen blir demonstrert utføres under veiledning og godkjenning av dyr omsorg og bruk komité av KU Leuven.

I bovine corneale endotelial-celler (BCEC), er funksjonelle gap veikryss og uttrykt både gapet junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon bidra vesentlig til intercellulær kommunikasjon på en interaktiv måte, men den viktigste sti har vist seg å være den parakrine intercellulære kommunikasjonen formidlet av pathway ATP utgivelsen gjennom Cx43-baserte hemichannels 28,29. ATP og ADP hydrolyseres til adenosinmonofosfat (AMP) ved ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfat en diphosphohydrolase, CD39 ATP diphosphohydrolase), og deretter til adenosin ved den 5'-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP og ADP bidrar tilCa 2 +-bølgeutbredelse ved binding til P2Y1 og P2Y2 reseptorer 28,29. Begge reseptorer par til PLS via Gq og dermed fremkalle IP 3-indusert Ca 2 +-release (figur 2). I BCEC, stimulering av purinergiske P2Y reseptorer fører til en rask økning i [Ca 2 +] i, som er ufølsom for fjerning av [Ca 2 +] o 60 år. [Ca 2 +] Jeg topper fremkalt av agonist stimulering blir etterfulgt av en [Ca 2 +] i nedgang som kan føre til en stabil, agonist-avhengige høyde, [Ca 2 +] o-avhengige oscillasjon svingninger, eller en avkastning til baseline 60-62. I BCEC har det vært bevis for at Ca 2 +-release skjer via en vei som involverer PLC og IP 3 29. Tømming av IP 3-sensitive butikker fører til en første topp i [Ca 2 +] i, senere etterfulgt av en capacitative Ca 2 +-tilstrømningen fører til utbruddet av platåfasen 63 år.

Mekanisk stimulering fører til en rask innledende økning i Ca 2 + som stammer fra det punktet av stimulering og deretter sprer seg i hele mekanisk stimulert celle. Til slutt, den intracellulære Ca 2 +-nivåer gradvis svekket tilbake til baseline nivå. Ved å nå cellegrensene, det intercellulære Ca 2 +-forplantningsretningen til de omkringliggende nabocellene (NB) i en bølge-liknende måte som en Ca 2 +-transient, som desintegrerer til basale nivået (figur 3). I kontroll forhold, Ca 2 +-transienter ble observert opp til ca 4-8 cellelagene unna mekanisk stimulert celle (figur 3). Linjen grafen (på høyre side av panelene i Figur 3) viser tiden løpet av Ca 2 +-transienter (representert som normaliserte fluorescens (NF) verdier)det mekanisk stimulert celle og i nabolandet cellelagene 04:59 (NB1, NB2, NB3, NB4 og NB5). Fra figur 3, er det klart at den normaliserte fluorescens minker, mens den tidsforsinkelse for angrep av [Ca2 +] i-rise øker med økende avstand fra det mekanisk stimulert celle. Den maksimale normaliserte fluorescens i det mekanisk stimulert celle ble nådd i 0,95 ± 0,04 sek. Etter å ha nådd en maksimal fluorescens normalisert verdi, viste det normaliserte fluorescens en meget gradvis og langsom tilbakegang, kommer tilbake til den basale verdien 152 ± 6 sek etter at anvendelsen av stimulus 25..

Inhibering av den parakrine intercellulære kommunikasjonen veien ved hjelp av en kombinasjon av eksogent apyrase VI (5 U / ml i 30 minutter) og apyrase VII (5 U / ml i 30 min) en 7,5-ganger reduksjon i området som dekkes av Ca 2 +-bølge, den såkalte aktive område (AA, P <0,001, N = 7, N = 35) (figur 4A). Apyrase er kjent for å hydrolysere ATP og ADP. Apyrase VI har en høy ATPase / ADPase ratio og apyrase VII fortrinnsvis hydrolyzes ADP 56.

Siden paracrine intercellular kommunikasjon i hornhinnen endotelet i stor grad skjer gjennom ATP utgivelsen, 28,29 og ATP er hydrolysert i ekstracellulære rommet ved ectonucleotidases, kjent for å være uttrykt i hornhinnen endotelet, 29,64,65 vi undersøkt effekten på AA i forhold hvor ATP hydrolyse hemmes ved hjelp ectonucleotidase hemmere. Hemming av ectonucleotidases med ARL-67156 (ARL, 100 mm for 30 min) førte til sterk forbedring av Ca 2 +-bølgeutbredelse, som har blitt vist tidligere i BCEC 25,26,28,29. Eksponeringen av BCEC til arl forårsaket en 3,5-ganger økning av AA i forhold til kontroll forhold (p <0,001, n = 12, n = 60) (figur 4B).

I pregere studier i vårt laboratorium, connexin mimetiske peptider (Gap26 og Gap27, Tabell 2) ble brukt til å skille de relative bidrag gap junctional intercellulær kommunikasjon og paracrine intercellular kommunikasjon til intracellulære Ca 2 +-bølgeutbredelse etter mekanisk stimulering, med en inaktiv peptid ( Tabell 2) som en kontroll 28,29.

Hemming av gap junction kanaler med Gap27 betydelig redusert utbredelse av Ca 2 +-bølge i BCEC 30. Den AA var signifikant redusert ved forbehandling med Gap27 (300 uM i 30 min) (P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabell 1). Hemming av connexin hemichannels med connexin-mimetiske peptid Gap26 28,30 betydelig redusert utbredelse av Ca 2 +-bølge i BCEC 28. AA ble betydelig redusert ved forbehandling med Gap26 (300 mikrometer i 30 min)(P <0,001, N = 8, n = 40) 25 (tabell 1).

Vi viste også at 43-kDa Cx isoform var en hovedkomponent underliggende hemichannel-mediert ATP utgivelse som provoserer intercellulært Ca 2 +-bølger. Ved hjelp av to uavhengig designet siRNA-molekyler rettet Cx43, fant vi at AA ble redusert med om lag 65% 33 (tabell 1). Dette ble ytterligere underbygget av eksperimenter ved hjelp av TAT-L2 (100 mikrometer, 30 min), en celle-gjennomtrengelig peptid som tilsvarer den andre halvdelen av den intracellulære løkken Cx43 (tabell 2), noe som provoserte en stor reduksjon i AA (P <0.001 , N = 3, n = 30) (tabell 1). Viktigere var denne reduksjonen i AA av TAT-L2 inkubasjon ikke observert i fravær av parakrine signalering, støtter konseptet at TAT-L2 selektivt hemmer Cx43-baserte hemichannels men ikke gap junction kanaler 33. Videre en inaktiv TAT-L2 mutant (TAT-L2 H126K/I130N) kan bli anvendt som en kontroll (tabell 2).

Figur 1
Figur 1. Dannelse av gap junction kanaler og hemichannels: Skjematisk fremstilling. A. En connexin eller pannexin hemichannel dannes når seks connexins eller pannexins, som er fire-transmembran-domene som inneholder proteiner, er radielt rundt en sentral pore. Hemichannels er lokalisert i plasmamembranen. De kan bestå av identiske protein undertyper (homomeric hemichannels) eller de kan bestå av forskjellige protein undertyper, når to eller flere isoformer er uttrykt i samme celle (heteromeric hemichannels). En homotypic gap veikryss kanal resultat av dokking av to identiske homomeric eller heteromeric hemichannels. En heterotypic gap koblingsbokser kanal resultater fra dlik låser av to ulike homomeric eller heteromeric kanaler. B. Skjematisk struktur connexin og pannexin gap junction kanaler som forbinder to tilstøtende celler og hemichannels.

(Delvis endret fra 66)

Dette tallet ble opprinnelig publisert i BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, og Bernard Himpens. Pannexins, fjerne slektninger av connexin familie med spesifikke cellulære funksjoner. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. I ikke-eksiterbare celler, itercellular Ca 2 +-bølgeutbredelse innebærer både gapet junctional intercellulær kommunikasjon og parakrine intercellulær kommunikasjon. etter mekanisk stimulering av en enkelt celle, en Ca2 +-økning oppstår i mekanisk stimulert celle (MS) via Ca2 +-strøm og / eller Ca 2 +-release. Deretter, Ca 2 +-rise forplanter seg fra mekanisk stimuleres til nabocellene (NB) som et intercellulært Ca 2 +-bølgen. Den intercellulært forplantning innebærer to mekanismer, nemlig gapet junctional intercellular kommunikasjon og paracrine intercellulært kommunikasjon. I gap junctional intercellular kommunikasjon, oppstår en direkte utveksling av en megler (IP 3 og / eller Ca 2 +) mellom cytoplasms på tilstøtende celler via gap veikryss (Gjs). I paracrine intercellular kommunikasjon, er en budbringer (f.eks ATP) slippes ut i ekstracellulære rommet, og dermed opptrer på reseptorer lokalisert på the overflaten av nabocellene. Hemichannels (HCS) eller andre mekanismer mekle denne ATP utgivelsen (se tekst). Ectonucleotidases hydrolyze ATP til ADP og AMP. ATP og ADP handle på P2Y og / eller P2X reseptorer på nabocellene. (Tatt fra 66.)

Dette tallet ble opprinnelig publisert i BioEssays. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, og Bernard Himpens. Pannexins, fjerne slektninger av connexin familie med spesifikke cellulære funksjoner. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays.

Figur 3
Figur 3. Kalsium bølgeutbredelse i kontroll forhold i BCEC. Mekanisk stimulering indusert kalsium transienter vises på forskjellige tidspunkter i kontroll forhold i BCEC av representative pseudo-farget fluorescens bilder. Den fluorescerende Whiteningscence intensiteter før stimulering er vist i det første bildet. Den hvite pilen i det andre bildet identifiserer mekanisk stimulert celle. Den kalsium bølgen forplanter til seks naboland cellelagene med et samlet areal på celler truffet av bølgen (aktivt område: AA) av 62 870 mikrometer to.

Den høyre panel med linjen grafer viser tidsforløpet av normaliserte verdi fluorescens (NF) i det mekanisk stimulert celle (MS) og den gjennomsnittlige verdien av NF i nabocellene (NB) sjikt 1-5 (NB1 til NB5). (Delvis endret fra 25.)

Dette tallet ble opprinnelig publisert i Investigative Ophthalmology and Visual Science. Catheleyne D'hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan VEREECKE, og Bernard Himpens. Trombin hemmer intracellulære kalsium bølgeutbredelse i hornhinnen endotelceller ved modulering av hemichannels og gap veikryss. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. Investigative Ophthalmology and Visual Science.

Figur 4
Figur 4. Vesentlige endringer i spredningen av intercellular Ca 2 +-bølger etter behandling med eksogene nucleotidases (til venstre) og med ectonucleotidase hemmere (til høyre) i BCEC. A. betydelig reduksjon i AA etter behandling av BCEC med eksogene apyrases (apyrase VI (5 U / ml) og apyrase VII (5 U / ml) i 30 min), som hydrolyserer ATP og ADP, herved hemme parakrin intercellulære kommunikasjonen reaksjonsveien (N = 7, n = 35). * Betyr P <0.001 i nærvær kontra fravær av apyrase B. Betydelig økning i AA etter behandling av BCEC med en selektiv ectonucleotidase inhibitor ARL-67156 (ARL, 100 mikrometer for 30 min)., Herved enhancing den parakrine intercellulære kommunikasjonsbane (N = 12, n = 60). * Betegner P <0,001 i nærvær g. fravær av ARL.

Normalisert AA St. error N n Statistikk
kontrollere 100 8.31 3 30
siScramble 87.97 9.3 3 30
siCx43-en 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7.06 3 30 *
Kontroll peptid 91.68 6.5 8 40
Gap 26 46.67 4.24 8 40 *
Gap 27 53 4.76 8 40 *
TAT-L2 6.99 0,71 3 30 *

Tabell 1. Effekten av siRNA-molekyler rettet Cx43, connexin mimetiske peptider og celle-gjennomtrengelig peptid TAT-L2 på normalisert aktivt område (AA) i BCEC.
N representerer antall dager med eksperimenter, representerer n antall mekaniske stimuleringer. * Betyr p <0,001 sammenlignet med kontroll forhold.

<tr>
AA sekvens
Kontroll peptid SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
TAT-L2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

Tabell 2. Aminosyresekvensene de brukte peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet, beskriver vi en enkel metode for å måle intracellulære Ca2 +-bølgeforplantning i monolag av primære bovine corneale endotelial-celler ved å tilveiebringe en lokal og kontrollert mekanisk stimulering ved hjelp av en mikropipette. Mekanisk stimulerte celler reagere med en lokal økning i intracellulært IP 3 og Ca 2 +, som begge er essensielle intracellulære signalmolekyler som driver intercellulære Ca 2 +-bølgeutbredelse 11,67. IP 3 er direkte overført til nabocellene via gap veikryss kanaler fem, mens Ca 2 + provoserer åpningen av hemichannels og utgivelsen av 68,69 ATP, som utløser Ca 2 +-signaler i nabocellene gjennom aktivering av G-protein koblede P2 reseptorer 37-40. Det relative bidraget av gap junction kanaler og hemichannels i denne prosessen kan være preget av bruk av Cx-mimetiskepeptider, ATP-enzymer (ectonucleotidases) og hemmere av ectonucleotisdases. Egenskapene til mekanisk-indusert stimulering intercellulære Ca 2 +-bølgeforplantning i bovine corneale endotelial-celler er blitt grundig karakterisert ved vårt laboratorium 25-33. Våre resultater tyder på at intercellular Ca 2 +-bølgeutbredelse er hovedsakelig drevet av en CX-hemichannel-mediert utgivelsen av ATP, med Cx43 spiller en fremtredende rolle. Som sådan, er denne metoden brukes til primære storfe hornhinnen endotelceller spesielt egnet til å identifisere eller karakterisere reguleringen av Cx43 hemichannels på endogene nivåer i innfødte celler. Ved hjelp av denne metoden, har vi funnet at aktiviteten av Cx43 hemichannels er kritisk kontrollert av actomyosin cytoskjelettet, som kan tjene som en endogen brems hindre overdreven, og dermed skadelig, Cx43 hemichannel åpning 25,31,32. Vi ytterligere belyse de molekylære mekanismene bak denne forskriften og finneen viktig rolle intramolekylære sløyfe / hale interaksjoner som er avgjørende for åpningen av Cx43 hemichannels 33.

Åpenbart er dette systemet meget velegnet for å studere funksjonen av Cx og Panx-basert gap junction kanaler og hemichannels og er definitivt ikke begrenset til bovine corneale endotelial-celler, men er anvendelig for praktisk talt en hvilken som helst celletype og også mer komplekse vev, som det er vist i hjernen hvor mekanisk stimulering utløste stor intercellulært Ca 2 +-bølger som omfatter hele halvkule 70 år. Ulike verktøy er til stede for å vurdere bidraget av gap junction kanaler og hemichannels, inkludert Cx-mimetiske peptider, ATP-nedbrytende enzymer, hemmere av ectonucleotidases og farmakologiske stoffer som karbenoksolon og 10 Panx1 (tabell 2) 49,50. Å bestemme bidraget av en viss Cx eller Panx isoform i denne prosessen, nøye utformet siRNA sonder targeting to uavhengige regioner av mRNA, og et kodet kontroll bør brukes. Omfanget av knockdown bør bestemmes på det totale protein nivå ved hjelp av Western-blotting analyser og enkelt celle nivå ved hjelp av fluoriserende mikroskopi. Transfeksjon effektiviteten av siRNA sonder i de eksperimentelle cellemonolagene bør vurderes av fluoriserende mikroskopi. For dette kan man utvikle en dupleks siRNA som et fluorescerende skilt er inkorporert ved 3'-enden av den forstand tråden. Det er viktig å merke seg at for riktig analyse, en fremtredende reduksjon av Cx eller Panx isoform (> 90% reduksjon), så vel som en homogen transfeksjon av de siRNA duplexer i cellemonoskiktet (> 90% av cellene transfektert med siRNA sonde) skal bli oppnådd. Selektivitet av de konstruerte siRNA sonder mot målet bør vurderes 71. Kort sagt, bør disse verktøyene være validert slik at de ikke påvirker uttrykket av andre Cx eller Panx isoformer eller andre viktige comkomponenter kjøring intercellulært Ca 2 +-bølger, som P2X eller P2Y reseptorer. For å vurdere bidraget av Cx43 hemichannels, har vi samarbeidet med laboratoriet til Dr. Leybaert i å utvikle en celle-gjennomtrengelig peptid som tilsvarer den andre halvdelen av den intracellulære løkken Cx43 (TAT-L2) som fungerer som en selektiv, potent hemmer av Cx43 hemichannels samtidig opprettholde Cx43-gap veikryss kanal aktivitet 33. I våre undersøkelser bruker vi 100 uM TAT-L2 for å få en fullstendig hemming av Cx43 hemichannels, men lavere konsentrasjoner kan være tilstrekkelig 72. TAT-L2H126K/I130N anbefales som en negativ kontroll 73. For å vurdere bidraget av Panx1 kanaler, kan 10Panx1 peptid brukes. Disse verktøyene er viktig ikke bare for å utelukke plasmamembranen avbrudd (se nedenfor), men også til å demonstrere at parakrine ATP signalering medierer mekanismene for intercellulær Ca 2 +-bølgeforplantning ved hemichannels og ikke ved andre mekanismer (for eksempel maxi-anion kanaler eller utslipp av ATP-holdige vesikler). Til slutt, som for alle studier ved hjelp av galvaniske elementer, må de cellekultur betingelser og antall passasjer være standardiserte, som de biologiske egenskapene til cellene og dermed ekspresjonsprofilen av forskjellig Cx og Panx isoformer kan endre seg over tid 26.

Likevel finnes det en rekke ulemper med denne metoden. En stor ulempe med metoden er at mekanisk stimulering kan utløse plasma membran avbrudd, som fører til oppføring av ekstracellulært Ca 2 + og utgivelsen av signalmolekyler som ATP, som begge ligger til grunn for bona fide intercellulært Ca 2 +-bølgeutbredelse 11. Dette kompliserer definitivt (kvantitativ) analyse av intracellulære Ca 2 +-bølgen. Derfor er det sterkt anbefalt at man bør i) bruke riktig kontroller, dvs. cellelinjer som mangler uttrykk for Cx eller Panx isoformer, og verktøy som interfere med funksjonen til Cx og Panx som gap junction kanaler og / eller hemichannels og ii) standardisere mekanisk stimulering prosedyren (sørg for at under den mekaniske stimulansen den nanopositioner drives av en spenning mellom 0,5 og 2 V).

Videre er det viktig å merke seg at denne metoden ikke stå av seg selv, men bør understøttes av flere eksperimentelle tilnærminger for å studere Cx og Panx kanaler. Dette kan oppnås ved å bruke en lokal økning av intracellulære signalisering molekyler som deltar i mekanisk-stimulering-mediert intercellulære Ca 2 +-bølgeforplantning, som uncaging av intracellulær IP 3 eller Ca 2 + 11,74. Å initiere intercellulært Ca 2 +-bølge uavhengig av mekanisk stimulering, kan man bruke mikro-injeksjon, slik som rekombinant pro-apoptose Bax 11,75 og foto-activatable Ca 2 +-buffere som diazo-2 som forårsaker en lokal nedgang i ekstracellulær [Ca 2 + 76, en kjent trigger for hemichannel åpning. Alternativt kan man bruke in situ electroporation av celle-ugjennomtrengelig signalmolekyler som utløser intracellulær Ca 2 +-release og intracellulære Ca 2 +-bølger, slik som IP 3 67,68. Den sistnevnte teknikk er også benyttet for å undersøke spredning av celledød 5,77. Disse ikke-mekaniske stimuli gi en bedre vurdering av stimulusintensiteten-respons. I tillegg til disse Ca 2 +-bølgeutbredelse metoder, er det viktig å bestemme aktiviteten til Cx Panx eller kanaler ved hjelp av andre metoder, herunder bestemmelse av hydrofile fargestoff opptak (som Lucifer gult) 78 og frigivelse av ATP ikke bare i respons på mekanisk stimulering, men også som svar på ekstracellulært Ca 2 +-buffere (som EGTA) og intracellulære Ca 2 +-release molekyler (som Ca 2 +-ionophore A23187) 11,74. I tillegg than beste beviset for regulering på kanalen nivå er levert av elektrofysiologiske eksperimenter, enten Dual Voltage klemme systemer eller hel-celle banen klemme av Xenopus oocytter injisert med Cx eller Panx mRNA eller av Jakten celler ectopically uttrykke Cx isoforms sammen med en markør som GFP 79-84.

For å konkludere, bruk av mekanisk stimulering for å indusere intercellulært Ca 2 +-bølger gir en enkel og pålitelig metode for å undersøke intracellulær kommunikasjon og undersøke bidraget og egenskaper Cx og Panx kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forskningsarbeid utført i laboratoriet ble støttet med tilskudd fra Research Foundation - Flandern (FWO; tilskuddsordninger tall G.0545.08 og G.0298.11), den Interuniversity attraksjonen polakker Program (belgisk Science Policy, prosjekt nummer P6/28 og P7/13) og er innebygd i en FWO-støttet forskningsmiljø. CDH er en postdoktor for Research Foundation - Flandern (FWO). Forfatterne er svært takknemlig for alle nåværende og tidligere medlemmer av Laboratory of Molecular and Cellular signalering (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), laboratoriet av Dr. Leybaert (Ghent University) og av Dr. Vinken (VUB) som ga nyttige diskusjoner, optimalisert prosedyrer eller var involvert i utviklingen av verktøy for studier av connexin hemichannels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074 (2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6 (2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451 (2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Tags

Cellular Biology molekylærbiologi medisin Biomedical Engineering biofysikk immunologi Ophthalmology Gap Junctions Connexins Connexin 43 kalsium signalisering Ca Cell Communication paracrine Communication Intercellulær kommunikasjon kalsium bølgeutbredelse gap veikryss hemichannels endotelceller celle signalisering celle isolasjon cellekultur
Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck,… More

D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter