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Biology

सेल monolayers में यांत्रिक उत्तेजना प्रेरित कैल्शियम वेव प्रचार: गोजातीय कॉर्नियल endothelial कोशिकाओं का उदाहरण

Published: July 16, 2013 doi: 10.3791/50443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Summary

कहनेवाला सीए

Abstract

कहनेवाला संचार मस्तिष्क, जिगर, रेटिना, कोक्लीअ और vasculature सहित अंगों और ऊतकों की एक किस्म में कोशिकाओं के बीच शारीरिक प्रक्रियाओं के समन्वय के लिए आवश्यक है. प्रयोगात्मक सेटिंग्स में, कहनेवाला सीए 2 + लहरों किसी एकल कक्ष के लिए एक यांत्रिक उत्तेजना को लागू करने से हासिल किया जा सकता है. इस intracellular संकेत आईपी अणुओं 3 और सीए 2 की रिहाई के लिए सुराग + पड़ोसी कोशिकाओं को यंत्रवत् प्रेरित सेल से + लहर समकेंद्रिकतापूर्वक 2 सीए का प्रचार आरंभ कर. कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार को नियंत्रित कि मुख्य आणविक रास्ते आई पी 3 का सीधा हस्तांतरण के माध्यम से और एटीपी की विज्ञप्ति के माध्यम से hemichannels द्वारा अंतराल जंक्शन चैनलों द्वारा प्रदान की जाती हैं. गुण और विभिन्न connexin और अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels रूप pannexin isoforms की नियमन की पहचान और लक्षण वर्णन quantificatio द्वारा अनुमति दी जाती हैएन कहनेवाला सीए 2 + लहर, siRNA, और अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels की inhibitors का उपयोग के प्रसार की. यहाँ, हम एक परिणाम के रूप में कहनेवाला 2 सीए सेल के एक तीव्र, कम से स्थायी विरूपण द्वारा उकसाया एक नियंत्रित और स्थानीय यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में Fluo4-AM के साथ भरी हुई प्राथमिक कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के monolayers में + लहर को मापने के लिए एक विधि का वर्णन कम से कम 1 माइक्रोन का एक टिप व्यास के साथ एक micromanipulator नियंत्रित कांच micropipette के साथ कोशिका झिल्ली को छूने की. हम भी प्राथमिक गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं और + लहरों एटीपी की विज्ञप्ति के माध्यम से कहनेवाला 2 सीए के लिए प्रेरित बल के रूप में Cx43-hemichannel गतिविधि का आकलन करने के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में इसके उपयोग के अलगाव का वर्णन है. अंत में, हम उपयोग करते हैं, लाभ, सीमाओं और अंतर जंक्शन चैनल और hemichannel अनुसंधान के संदर्भ में इस विधि के विकल्प पर चर्चा की.

Introduction

कहनेवाला संचार और संकेत ऊतक और पूरे अंग स्तर 1,2 पर कोशिकी एगोनिस्ट के जवाब में शारीरिक प्रक्रियाओं के समन्वय के लिए आवश्यक हैं. कहनेवाला संचार का सबसे सीधा रास्ता अंतराल जंक्शनों की घटना के द्वारा बनाई गई है. गैप जंक्शनों 3,4 सन्निकट कक्षों के दो connexin (CX) hemichannels (चित्रा 1) के सिर से सिर डॉकिंग द्वारा गठित प्रोटीन चैनल हैं जो अंतराल जंक्शन चैनलों के सजीले टुकड़े हैं, कर रहे हैं. गैप जंक्शनों के कारण और नियमन 2 सीए पड़ोसी कोशिकाओं 6 (चित्रा 2) के intracellular दुकानों से + रिहाई., सीए 2 + या आईपी 3 5 सहित कम से कम 1.5 केडीए के एक आणविक वजन के साथ छोटे संकेतन अणुओं के पारित होने की अनुमति गैप जंक्शन चैनलों कसकर रेडोक्स संशोधन और जैसे, अंतर और आणविक प्रोटीन बातचीत से और सेलुलर संकेत प्रक्रियाओं के द्वारा नियंत्रित किया जाता हैफास्फोरिलीकरण 7. GJS जिससे एक रासायनिक और बिजली के संकोश के रूप में अभिनय, जुड़े कोशिकाओं के समन्वित प्रतिक्रिया की सुविधा. उदाहरण के लिए, आलिंद और निलय myocytes भर में हृदय की संभावित कार्रवाई का प्रसार CX-आधारित जीजे चैनल 85 द्वारा मध्यस्थता है. CXS केवल अंतर जंक्शन चैनल के रूप में एक भूमिका है, लेकिन यह भी unpaired hemichannels फार्म, जिससे नियमित आयन चैनल 8-10 (चित्रा 1) के लिए इसी तरह की झिल्ली में चैनल के रूप में कार्य नहीं कर रहा. Hemichannels अंतर और बाह्य वातावरण के बीच आयनों और संकेतन अणुओं के आदान प्रदान को नियंत्रित करने से पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच पैराक्राइन संकेतन में भाग लेते हैं.

कई प्रकार की कोशिकाओं (उपकला कोशिकाओं, osteoblastic कोशिकाओं, astrocytes, endothelial कोशिकाओं, आदि की तरह) और अंगों (मस्तिष्क, जिगर, रेटिना, कोक्लीअ और vasculature की तरह) में, कहनेवाला सीए 2 + लहरों बहुकोशिकीय प्रतिक्रियाओं के समन्वय के लिए मौलिक हैं 2 + स्तर में वृद्धि इस सेल तक सीमित है, लेकिन इस तरह एक कहनेवाला सीए 2 + लहर 12,13 स्थापित करने, आसपास के पड़ोसी की कोशिकाओं के लिए प्रचार नहीं कर रहे हैं. ये कहनेवाला सीए 2 + लहरों एक संकोश और उनके अनियंत्रण pathophysiological प्रक्रियाओं 11 के साथ संबद्ध किया गया है के रूप में सेल परतों के सामान्य शारीरिक विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कॉर्निया अन्तःचूचुक और उपकला में, हमारे अपने 25-33 सहित विभिन्न समूहों को 14-24, कहनेवाला संचार के तंत्र और भूमिकाओं का अध्ययन किया. गैर उत्तेजनीय कोशिकाओं में, कॉर्निया endothelial कोशिकाओं की तरह, कहनेवाला संचार के दो अलग मोड 28,29, अर्थात् अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार होते हैं. गैप junctional कहनेवाला संचार अंतराल जंक्शनों 7 के माध्यम से संकेतन अणुओं का एक सीधा आदान प्रदान शामिल है. गैप Juncराष्ट्रीय कहनेवाला संचार, ऊतक homeostasis को बनाए रखने सेल प्रसार को नियंत्रित करने, और बाह्य तनाव 10,34,35 को एक सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रिया की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. विकृतियों के एक नंबर में अंतर जंक्शन युग्मन के कारण दोषपूर्ण CXS करने के लिए कम, और इसके द्वारा अंतराल junctional कहनेवाला संचार 36 प्रभावित हो रहा है. इस बहुकोशिकीय जीव में अंतर junctional कहनेवाला संचार के महत्व और प्रभाव पर जोर दिया. यह प्रसारण कोशिकी दूत (चित्रा 2) की रिहाई शामिल है के बाद से अंतराल junctional कहनेवाला संचार के विपरीत, पैराक्राइन कहनेवाला संचार, सेल सेल समानाधिकरण पर निर्भर नहीं है. संकेतन अणुओं की विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को संकेत द्वारा बाह्य अंतरिक्ष में जारी किया जाता है. अणु तो यह एक विशिष्ट रिसेप्टर प्रोटीन से पता चला है जहां लक्ष्य कक्ष में पहुंचा दिया है. इसके बाद रिसेप्टर संकेत जटिल जो एक सेलुलर प्रतिक्रिया, लातीसंकेत, निष्क्रियता या desensitization के हटाने से समाप्त होता है. विमोचन lipophilic कोशिकी संकेत दूतों झिल्ली घुसना और intracellular रिसेप्टर्स पर काम करते हैं. इसके विपरीत, हाइड्रोफिलिक दूतों जवाब देने सेल के प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं करते, लेकिन फिर इंट्रासेल्युलर पर्यावरण के लिए संकेत रिले जो सतह व्यक्त रिसेप्टर प्रोटीन को बांधता है कि एक ligand के रूप में काम करते हैं. आयन चैनल से जुड़े, एंजाइम से जुड़ी, और जी प्रोटीन से जुड़े: कोशिका की सतह रिसेप्टर प्रोटीन की तीन प्रमुख परिवार इस प्रक्रिया में भाग लेते हैं. जारी दूत अणु करीब निकटता (पैराक्राइन) में लक्ष्य कोशिकाओं पर, एक ही सेल (autocrine) के रिसेप्टर्स पर कार्य कर सकते हैं, या संचार प्रणाली (एंडोक्राइन) की आवश्यकता होती है कि दूर के लक्ष्य कोशिकाओं पर.

कॉर्निया अन्तःचूचुक 28,29 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में एटीपी कहनेवाला सीए 2 + लहरों 37-40 के प्रसार ड्राइव कि प्रमुख हाइड्रोफिलिक, पैराक्राइन कारकों में से एक है. Durविभिन्न एजेंटों द्वारा आईएनजी यांत्रिक विरूपण, हाइपोक्सिया, सूजन या उत्तेजना, एटीपी कतरनी तनाव, खिंचाव, या आसमाटिक 44,45 सूजन के जवाब में 41-44 स्वस्थ कोशिकाओं से जारी किया जा सकता है. अलग एटीपी रिलीज तंत्र कोष्ठकी एक्सोसाइटोसिस 44 और ऐसे एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों, plasmalemmal वोल्टेज पर निर्भर आयनों चैनल 46, P2X7 रिसेप्टर चैनलों 47,48, साथ ही के रूप में परिवहन तंत्र, के एक बहुतायत सहित माने किया गया है connexin hemichannels 49-52 और pannexin hemichannels 43,49,53. कोशिकी एटीपी ADP, एएमपी के लिए तेजी से hydrolyzed हो और बाह्य वातावरण में मौजूद हैं कि ectonucleotidases द्वारा 54,55 adenosine कर सकते हैं. extracellularly जारी एटीपी और उसके metabolite ADP 56 प्रसार के माध्यम से फैल जाएगा. पड़ोसी की कोशिकाओं में purinergic रिसेप्टर्स के साथ इन nucleotides के बाद बातचीत पी में फंसा दिया गया हैकहनेवाला सीए 2 + लहरों 28,37,51 के ropagation. Purinergic रिसेप्टर्स की दो अलग अलग वर्गों मौजूद हैं: दोनों प्यूरीन (एटीपी, ADP) और pyrimidine (UTP, यूडीपी) न्यूक्लियोटाइड सबसे p2-purinoceptors 57 पर कार्रवाई करते हुए एडेनोसाइन, P1-purinoceptors लिए प्रमुख प्राकृतिक ligand है.

कहनेवाला संचार ऐसी परिमार्जन लोडिंग, डाई हस्तांतरण, आईपी 3 और सीए 2 +, यांत्रिक उत्तेजना, आदि जैसे agonists के स्थानीय uncaging के रूप में विभिन्न तरीकों से जांच की जा सकती है. यहाँ हम + लहर प्रसार किसी एकल कक्ष के यांत्रिक उत्तेजना से हासिल 2 सीए के अध्ययन का वर्णन. यांत्रिक उत्तेजना से सीए 2 + लहर प्रसार का अध्ययन करने का लाभ यह है + लहर समय के साथ 2 सीए के प्रसार यों के लिए एक आसान उपकरण प्रदान करता है और यह मात्रात्मक कोशिकाओं के विभिन्न pretreatments की तुलना करने की अनुमति देता है. कॉर्निया अन्तःचूचुक में, इन कहनेवाला सीए 2 + लहरों एक सह की अनुमतिmonolayer से समन्वित प्रतिक्रिया है, इसके द्वारा अंतःचाक्षुष सर्जरी के दौरान बाह्य तनाव झेलने में अन्तःचूचुक की मदद गैर पुनर्योजी कॉर्निया endothelium के एक संभव सुरक्षा तंत्र के रूप में काम कर रहा है, या प्रतिरक्षा अस्वीकृति या यूवाइटिस 58,59 दौरान भड़काऊ मध्यस्थों के लिए जोखिम पर.

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Protocol

1. कॉर्नियल endothelial कोशिकाओं के अलगाव

आरंभ करने से पहले: आंख enucleating के बाद एक स्थानीय कसाईखाना, जितनी जल्दी हो सके से प्राप्त ताजा आँखों से कोशिकाओं को अलग. आँख अधिक से अधिक 18 महीने पुरानी है, पांच मिनट के पोस्टमार्टम और अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान में संरक्षित की एक गाय से enucleated था कि सुनिश्चित करें - 4 में 1% आयोडीन समाधान प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए डिग्री सेल्सियस.

  1. अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के बाहर आंख लो - 1% आयोडीन समाधान और एक पेट्री डिश (100 x 20 मिमी) में जगह है.
  2. 70% इथेनॉल युक्त समाधान के साथ नजर जीवाणुरहित और 1% आयोडीन युक्त अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के साथ कुल्ला.
  3. पर इस कदम से, एक बाँझ हुड में काम करते हैं. ध्यान आंख से कॉर्निया काटना और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ उपकला कोशिका परत के साथ अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान युक्त एक पेट्री डिश (35 x 10 मिमी), में जगह है. ध्यान से किसी भी शेष आईरिस ऊतक एसटीआई हटानेअगर जरूरत कॉर्निया से जुड़ी होगी.
  4. ऊपर की ओर endothelial सेल परत के साथ पेट्री डिश युक्त एक और अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के लिए कॉर्निया स्थानांतरण और अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के साथ दो बार कुल्ला.
  5. एक कप के आकार का पकवान है जो एक hourglass, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ endothelial परत के साथ कॉर्निया स्थानांतरण, और मध्यम विकास के साथ कवर. मध्यम विकास 25 मिमी ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 6.6% एल glutamine, 2.5 ग्राम / एमएल amphotericin बी और 1% एंटीबायोटिक कवकनाशी मिश्रण 10,000 इकाइयों युक्त / पेनिसिलिन की मिलीलीटर, 10,000 ग्राम युक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के होते हैं स्ट्रेप्टोमाइसिन की / एमएल, और 25 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी
  6. एक चूषण विंदुक के साथ मध्यम निकालें.
  7. कॉर्निया के endothelial परत (trypsin शामिल है कि सभी कदम ही एकाग्रता का उपयोग किया जाता है) के लिए एक trypsin समाधान (0.5 ग्राम / एल) के 300 μl लागू करें.
  8. एक कवर पेट्री डिश में कॉर्निया युक्त hourglass प्लेस और कांग्रेस में डाल दिया37 पर 30 मिनट के लिए ubator डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  9. धीरे एक बाँझ हुड में एक आग पॉलिश हुक के आकार का कांच पाश्चर पिपेट साथ कॉर्निया से दूर endothelial कोशिकाओं परिमार्जन.
  10. Endothelial कोशिकाओं से युक्त समाधान बंद चूसना और संस्कृति के माध्यम से 4 मिलीग्राम से युक्त संस्कृति बोतल (25 सेमी 2) में जोड़ें.
  11. कॉर्निया के लिए मध्यम विकास के 300 μl लागू करें और scraping दोहराने और संस्कृति फ्लास्क endothelial कोशिकाओं से युक्त समाधान जोड़ने.
  12. एक बार फिर यह अंतिम कदम (1.11) दोहराएँ.
  13. संस्कृति प्लेस 37 में इनक्यूबेटर में वृद्धि मध्यम डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कॉर्निया endothelial कोशिकाओं से युक्त बोतल.
  14. दो दिनों के बाद, संस्कृति के माध्यम से 6 मिलीलीटर जोड़ें.
  15. हर दूसरे दिन मध्यम विकास ताज़ा करें.

2. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति के माध्यम से निकालें और पहुँच जाता है जब confluency अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान, (abou के भीतर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोनाअलगाव के बाद टी 10 दिन).
  2. उन्हें अलग और इनक्यूबेटर में कुप्पी जगह करने के लिए कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर trypsin समाधान जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 3 से 4 मिनट के लिए.
  3. मध्यम विकास के 12 मिलीलीटर जोड़ें. कोशिकाओं को फैलाने और कोशिकाओं की गिनती करने में और बाहर मध्यम तीन बार पिपेट.
  4. सेल घनत्व पर और इनक्यूबेटर में डाल निर्भर करता है एक चर अंश के साथ बीज कोशिकाओं. 165,000 कोशिकाओं की कोशिका गिनती (2 सेमी प्रति सेल घनत्व 39,286) के साथ दो अच्छी तरह से संभाग स्लाइड्स (4.2 सेमी 2 के एक क्षेत्र के साथ) तैयार करें. 2 सेमी प्रति 6250 की एक घनत्व में एक नया मार्ग के लिए 80 सेमी 2 संस्कृति बोतल तैयार है, और 25 मिलीलीटर की कुल मात्रा को ताजा संस्कृति के माध्यम से जोड़ें.
  5. हर दो दिन मध्यम ताज़ा करें.
  6. सेल परत की confluency 3 से 4 दिन बाद तक पहुँच जाता है. प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें.
  7. बोतल में सेल परत की confluency तक पहुँच जाता है, 2.6 के लिए कदम 2.1 दोहराएँ. मार्ग 2 से ऊपर सेल संस्कृतियों च इस्तेमाल किया जा सकता हैया प्रयोगों.

3. उत्प्रेरण कैल्शियम वेव के लिए यांत्रिक उत्तेजना

  1. 10 माइक्रोन Fluo 4 के साथ संभाग स्लाइड में कोशिकाओं लोड में पूर्वाह्न 37 बजे 30 मिनट के लिए खारा फॉस्फेट बफर डिग्री सेल्सियस धीरे मिलाते हुए.
  2. Fluo 4 समाधान AM निकालें, खारा फॉस्फेट बफर के साथ कोशिकाओं पांच बार धोने, खारा फॉस्फेट बफर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और माप से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें.
  3. आर्गन लेजर और उपयोग बीम फाड़नेवाला HFT 488 से 488 एनएम पर उत्तेजित, एक longpass उत्सर्जन फिल्टर एल.पी. 505 का उपयोग करते हुए 530 एनएम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन इकट्ठा कम से कम पिनहोल सेट. एक तेल विसर्जन 40x उद्देश्य (वायु, 1.2 एनए) का प्रयोग करें. ARL-67156 के साथ प्रयोगों में, एक 10X उद्देश्य उपयोग (वायु, 0.3 एनए).
  4. कोशिकाओं confocal खुर्दबीन पर मिला हुआ हैं जिसमें एक क्षेत्र के लिए खोजें.
  5. स्थिति यह 45 संभाग स्लाइड के संबंध में डिग्री और कोशिका झिल्ली को छूने में है कि इतना पिपेट.किसी एकल कक्ष के लिए एक छोटी (≈ 1 सेकंड) यांत्रिक उत्तेजना भड़काने. यांत्रिक उत्तेजना संक्षेप में है जो एक एम्पलीफायर के माध्यम से संचालित एक piezoelectric क्रिस्टल nanopositioner करने के लिए मिलकर एक गिलास micropipette (टिप व्यास <1 माइक्रोन) के साथ कोशिका झिल्ली की 1% से कम छूकर सेल का एक तीव्र, कम से स्थायी विरूपण के होते हैं एक सूक्ष्म जोड़तोड़ पर मुहिम शुरू की. कांच micropipettes एक microelectrode खींचने के साथ बना रहे हैं. Nanopositioner यांत्रिक उत्तेजना के दौरान 0.2 और 1.5 वी के बीच एक वोल्टेज द्वारा संचालित है कि सुनिश्चित करें. 1.5 वी से एक वोल्टेज उच्च सेल क्षति हो सकती है. प्रत्येक कोशिका प्रकार और हालत के लिए, सेल क्षति के बिना यांत्रिक उत्तेजना के लिए इष्टतम वोल्टेज ध्यान से उच्च (1.5 वी) वोल्टेज के लिए (0.2 वी) कम से शुरू voltages की एक श्रृंखला लगाने से निर्धारित किया जाना चाहिए. इस वोल्टेज कोशिका झिल्ली को लागू कर रहे हैं कि यांत्रिक तनाव और तनाव को निर्धारित करता है के बाद से वोल्टेज उत्तेजना की शक्ति के लिए एक उपाय है.यांत्रिक उत्तेजना के बल क्षेत्र के साथ यांत्रिक तनाव गुणा करके गणना की जा सकती. क्षेत्र (<3.14 माइक्रोन 2) और यांत्रिक तनाव दोनों बहुत कम हैं, यांत्रिक उत्तेजना के बल कम है. (एक सेल क्षतिग्रस्त है, सेल और सेल के बाहर प्रतिदीप्ति लीक अंधेरा चला है कि ध्यान दें.)
  6. में स्थानिक परिवर्तन को मापने [सीए 2 +] confocal खुर्दबीन के साथ यांत्रिक उत्तेजना के बाद मैं.
  7. छवियों लीजिए और दुकान.
  8. Confocal खुर्दबीन के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संवेदनशील कोशिकाओं (सक्रिय क्षेत्र, एए) की कुल सतह क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए ब्याज की एक polygonal क्षेत्र ड्रा.

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Representative Results

सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में क्रियान्वित कर रहे हैं और प्रदर्शन किया जा रहा प्रोटोकॉल यू लोवेन के जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत किया जाता है.

गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं (BCEC) में, कार्यात्मक अंतर जंक्शनों व्यक्त की और अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार दोनों एक इंटरैक्टिव रास्ते में कहनेवाला संचार में महत्वपूर्ण योगदान है, लेकिन मुख्य मार्ग द्वारा मध्यस्थता पैराक्राइन कहनेवाला संचार मार्ग होने के लिए दिखाया गया है रहे हैं Cx43 आधारित hemichannels 28,29 के माध्यम से एटीपी रिहाई. एटीपी और ADP ectonucleotidase ई NTPD1 (ectonucleoside ट्रायफ़ोस्फेट diphosphohydrolase 1, CD39 एटीपी diphosphohydrolase) द्वारा मोनोफास्फेट (एएमपी) एडेनोसाइन के हाइड्रोलाइज्ड हैं, और बाद में 5'-ectonucleotidase CD73 28,29 द्वारा एडेनोसाइन के. एटीपी और ADP में योगदानP2Y1 और P2Y2 रिसेप्टर्स 28,29 के बंधन से सीए 2 + लहर प्रसार. रिसेप्टर्स GQ के माध्यम से पीएलसी को जोड़े और इस तरह आईपी आह्वान दोनों 3 प्रेरित सीए 2 + रिहाई (चित्रा 2). BCEC में, में एक तेजी से वृद्धि में purinergic P2Y रिसेप्टर्स परिणाम की उत्तेजना [सीए 2 +] [2 Ca +] ओ 60 को हटाने के लिए असंवेदनशील है जो मैं. [2 Ca +] एगोनिस्ट उत्तेजना के द्वारा पैदा मैं चोटियों एक स्थिर, एगोनिस्ट पर निर्भर ऊंचाई तक ले सकते हैं, जो एक [सीए 2 +] मैं कमी के द्वारा पीछा कर रहे हैं, [2 Ca +] ओ पर निर्भर oscillatory उतार चढ़ाव, या आधारभूत की वापसी 60-62. BCEC में, सीए 2 + रिहाई पीएलसी और आईपी 3 29 से जुड़े एक मार्ग के माध्यम से होता है कि सबूत नहीं दिया गया है. आईपी ​​3 संवेदनशील दुकानों के खाली करने में एक प्रारंभिक शिखर की ओर जाता है एक सीए द्वारा [सीए 2 +] मैं, बाद में पीछा कियाpacitative सीए 2 + बाढ़ पठार चरण 63 की शुरुआत करने के लिए अग्रणी.

यांत्रिक उत्तेजना सीए 2 में एक तेजी से प्रारंभिक वृद्धि की ओर जाता है + उत्तेजना के बिंदु से निकलती है और फिर यंत्रवत् प्रेरित सेल भर में फैलता है. अंत में, intracellular सीए 2 + स्तर धीरे आधारभूत स्तर को वापस कम हो जाना. सेल सीमाओं पर पहुंचने पर, बेसल स्तर (चित्रा 3) के लिए decays जो एक सीए 2 + क्षणिक रूप में एक लहर की तरह ढंग से आसपास के पड़ोसी कोशिकाओं (नो बॉल), को कहनेवाला सीए 2 + लहर propagates. नियंत्रण की स्थिति में, सीए 2 + यात्रियों दूर यंत्रवत् प्रेरित सेल (चित्रा 3) से लगभग 4 से 8 सेल परतों को मनाया गया. लाइन ग्राफ (चित्रा 3 में पैनल के दाईं ओर) 2 सीए के समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है + यात्रियों (सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति (एनएफ) मान के रूप में प्रतिनिधित्व) मेंयंत्रवत् प्रेरित सेल और पड़ोसी सेल परतों में एक से पांच (NB1, NB2, NB3, NB4 और NB5). चित्रा 3 से, यह स्पष्ट है कि सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति कम हो जाती है, जबकि की शुरुआत के लिए समय की देरी [2 Ca +] यंत्रवत् प्रेरित सेल से बढ़ती दूरी के साथ मैं वृद्धि बढ़ जाती है. यंत्रवत् प्रेरित सेल में अधिक से अधिक सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति 0.95 में पहुँच गया था ± 0.04 सेकंड. एक अधिक से अधिक सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्य तक पहुँचने के बाद, सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति बेसल मूल्य 152 करने के लिए लौटने ± 6 सेकंड प्रोत्साहन 25 के आवेदन के बाद, एक बहुत क्रमिक और धीमी गति से गिरावट दर्ज की गई.

एक्सोजेनस apyrase छठी (30 मिनट के लिए 5 यू / एमएल) और apyrase सातवीं (30 मिनट के लिए 5 यू / एमएल) का एक संयोजन का उपयोग करके पैराक्राइन कहनेवाला संचार मार्ग का निषेध 2 सीए द्वारा कवर क्षेत्र में एक 7.5 गुना कमी के कारण होता है + लहर, तथाकथित सक्रिय क्षेत्र (ए.ए., पी 0.001 <; एन = 7N = 35) (चित्रा -4 ए). Apyrase एटीपी और ADP hydrolyze के लिए जाना जाता है. Apyrase छठी एक उच्च ATPase / ADPase अनुपात और apyrase सातवीं अधिमान्यतया hydrolyzes ADP 56 है.

कॉर्निया endothelium में पैराक्राइन कहनेवाला संचार काफी हद तक एटीपी रिहाई, 28,29 के माध्यम से होता है और एटीपी कॉर्निया endothelium में व्यक्त करने के लिए जाना जाता ectonucleotidases, 29,64,65 द्वारा बाह्य अंतरिक्ष में hydrolyzed है के बाद से हम स्थितियों में ए.ए. पर प्रभाव की जांच की जहां एटीपी हाइड्रोलिसिस ectonucleotidase inhibitors का उपयोग हिचकते हैं. ARL-67156 (ARL, 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन) के साथ ectonucleotidases का निषेध BCEC 25,26,28,29 में पहले से प्रदर्शित किया गया है, के रूप में + लहर प्रसार सीए 2 की मजबूत वृद्धि के परिणामस्वरूप. (चित्रा 4 बी); ARL को BCEC के जोखिम की स्थिति (एन = 12 = एन 60 पी <0.001) पर नियंत्रण की तुलना ए.ए. के एक 3.5 गुना वृद्धि का कारण बना.

पूर्व मेंहमारी प्रयोगशाला, connexin अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड्स (Gap26 और Gap27, 2 तालिका) में vious पढ़ाई एक निष्क्रिय पेप्टाइड (साथ यांत्रिक उत्तेजना के बाद कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार, के लिए अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार के रिश्तेदार योगदान भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया एक नियंत्रण 28,29 के रूप में 2 तालिका).

Gap27 साथ अंतराल जंक्शन चैनलों का निषेध काफी + लहर BCEC 30 में 2 सीए के प्रसार की कमी हुई. ए.ए. काफी Gap27 (30 मिनट के लिए 300 माइक्रोन) साथ pretreatment पर कम हो गया था (पी 0.001 <; एन = 8, एन = 40) 25 (1 टेबल). Connexin अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड Gap26 28,30 साथ connexin hemichannels का निषेध काफी + लहर BCEC 28 में 2 सीए के प्रसार को कम किया. ए.ए. काफी Gap26 (30 मिनट के लिए 300 माइक्रोन) साथ pretreatment पर कम हो गया था(पी 0.001 <; एन = 8, एन = 40) 25 (1 टेबल).

हम भी 43 केडीए Cx isoform कहनेवाला सीए 2 + लहरों भड़काती hemichannel की मध्यस्थता एटीपी रिलीज अंतर्निहित एक मुख्य घटक था कि पता चला है. Cx43 लक्षित कर दो स्वतंत्र रूप से डिजाइन किए siRNA अणुओं का उपयोग करना, हम ए.ए. 65% के बारे में 33 (1 टेबल) से कम हो गया था पाया. यह आगे बुनना-एल 2 (100 माइक्रोन, 30 मिनट), ए.ए. में एक प्रमुख कमी (पी <0.001 उकसाया जो Cx43 के intracellular पाश की दूसरी छमाही (तालिका 2) को इसी एक सेल पारगम्य पेप्टाइड का उपयोग कर प्रयोगों पर टिकी था , एन = 3, = एन 30) (1 टेबल). महत्वपूर्ण बात है, बुनना-एल 2 ऊष्मायन द्वारा ए.ए. में इस कमी बुनना-L2 के चुनिंदा Cx43 आधारित hemichannels नहीं बल्कि अंतर जंक्शन चैनल 33 को रोकता है अवधारणा का समर्थन, पैराक्राइन संकेत के अभाव में नहीं मनाया गया. इसके अलावा, एक निष्क्रिय बुनना-एल 2 उत्परिवर्ती (बुनना-एल 2 एच 126K/I130N) एक नियंत्रण (तालिका 2) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels का गठन. चार transmembrane डोमेन युक्त प्रोटीन होते हैं जो छह connexins या pannexins, त्रिज्यात एक केंद्रीय ताकना आसपास की व्यवस्था कर रहे हैं जब ए एक connexin या pannexin hemichannel बनाई है. Hemichannels प्लाज्मा झिल्ली में स्थित हैं. वे समान प्रोटीन उपप्रकार (homomeric hemichannels) तक हो सकते हैं या वे दो या अधिक isoforms के एक ही सेल (heteromeric hemichannels) में व्यक्त कर रहे हैं जब विभिन्न प्रोटीन उपप्रकार, हो सकते हैं. एक homotypic अंतर जंक्शन चैनल दो समान homomeric या heteromeric hemichannels की डॉकिंग का परिणाम है. घ से एक heterotypic अंतर जंक्शन चैनल परिणामदो अलग homomeric या heteromeric चैनलों की ocking. connexin और दो ​​सन्निकट कक्षों और hemichannels जोड़ने pannexin अंतराल जंक्शन चैनलों के बी योजनाबद्ध संरचना.

(आंशिक रूप से 66 से संशोधित)

यह आंकड़ा मूल BioEssays में प्रकाशित किया गया था. Catheleyne डी 'HONDT, आरएएफ Ponsaerts, Smedt, गीर्ट Bultynck, और बर्नार्ड Himpens डी Humbert. Pannexins, विशिष्ट सेलुलर कार्यों के साथ connexin परिवार के दूर के रिश्तेदार. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. गैर उत्तेजनीय कोशिकाओं में, मेंtercellular सीए 2 + लहर प्रचार अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार दोनों शामिल है. एक एकल कक्ष, + वृद्धि 2 सीए के माध्यम से यंत्रवत् प्रेरित सेल (एमएस) में होता है एक 2 सीए के यांत्रिक उत्तेजना होने पर + बाढ़ और / या सीए 2 + रिहाई. इसके बाद से सीए 2 + वृद्धि propagates यंत्रवत् एक कहनेवाला सीए 2 + लहर के रूप में पड़ोसी कोशिकाओं (नो बॉल) करने के लिए प्रेरित किया. कहनेवाला प्रचार दो तंत्र, अर्थात् अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार शामिल है. अंतराल junctional कहनेवाला संचार में, एक मध्यस्थ का प्रत्यक्ष एक्सचेंज (आईपी 3 और / या सीए 2 +) अंतराल जंक्शनों (GJS) के माध्यम सन्निकट कक्षों के cytoplasms के बीच होता है. पैराक्राइन कहनेवाला संचार में, एक दूत (जैसे एटीपी) जिससे वें पर स्थित रिसेप्टर्स पर अभिनय, बाह्य अंतरिक्ष में जारी हैपड़ोसी कोशिकाओं की ई सतह. Hemichannels (HCS) या अन्य तंत्र (पाठ देखें) इस एटीपी रिहाई मध्यस्थता. ADP और एएमपी को Ectonucleotidases Hydrolyze एटीपी. एटीपी और P2Y और / या पड़ोसी कोशिकाओं पर P2X रिसेप्टर्स पर ADP के काम करते हैं. (66 से लिया.)

यह आंकड़ा मूल BioEssays में प्रकाशित किया गया था. Catheleyne डी 'HONDT, आरएएफ Ponsaerts, Smedt, गीर्ट Bultynck, और बर्नार्ड Himpens डी Humbert. विशिष्ट सेलुलर कार्यों के साथ connexin परिवार के Pannexins, दूर के रिश्तेदार. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays.

चित्रा 3
चित्रा 3. BCEC में नियंत्रण की स्थिति में कैल्शियम लहर प्रसार. यांत्रिक उत्तेजना प्रेरित कैल्शियम यात्रियों प्रतिनिधि छद्म रंग प्रतिदीप्ति छवियों से BCEC में नियंत्रण की स्थिति में समय अंक अलग से दिखाए जाते हैं. fluoreउत्तेजना से पहले scence तीव्रता पहली छवि में दिखाया गया है. दूसरी छवि में सफेद तीर यंत्रवत् प्रेरित सेल को पहचानती है. 62,870 माइक्रोन 2 की: कैल्शियम लहर लहर (ए.ए. सक्रिय क्षेत्र) से पर पहुंच कोशिकाओं के कुल क्षेत्रफल के साथ छह पड़ोसी सेल परतों को प्रसारित.

लाइन रेखांकन के साथ सही पैनल यंत्रवत् प्रेरित सेल में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति मूल्य (एनएफ) (एमएस) और पड़ोसी कोशिकाओं में एनएफ का औसत मूल्य (नो बॉल) परतों 1 से 5 (NB1 को NB5) के समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है. (आंशिक रूप से 25 से संशोधित.)

यह आंकड़ा मूल खोजी नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान में प्रकाशित किया गया था. Catheleyne डी 'HONDT, आरएएफ Ponsaerts, Sangly पी श्रीनिवास, जोहान Vereecke, और बर्नार्ड Himpens. थ्रोम्बिन hemichannels और अंतराल जंक्शनों के मॉडुलन द्वारा कार्निया endothelial कोशिकाओं में कहनेवाला कैल्शियम लहर प्रसार को रोकता है. निवेश करते हैं. ओफ्थाल्मोल. विस. विज्ञान. 2007. खोजी नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान.

चित्रा 4
4 चित्रा. + लहरों एक्सोजेनस nucleotidases (बाएं) के साथ इलाज के बाद और BCEC में ectonucleotidase अवरोधक (दाएं) के साथ कहनेवाला 2 सीए के प्रसार में महत्वपूर्ण परिवर्तन. एटीपी और ADP hydrolyze जो एक्सोजेनस apyrases (apyrase छठी (5 यू / एमएल) और apyrase सातवीं (5 यू / एमएल) 30 मिनट के लिए), इसके द्वारा बाधा पैराक्राइन कहनेवाला संचार मार्ग (साथ BCEC के इलाज के बाद ए.ए. में ए उल्लेखनीय कमी एन = 7, एन = 35). * पी apyrase की उपस्थिति बनाम अभाव में 0.001 <प्रतीक एक चयनात्मक ectonucleotidase अवरोध ARL-67156 (ARL, 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन) के साथ BCEC के इलाज के बाद ए.ए. में बी उल्लेखनीय वृद्धि हुई है., शाक प्रभूत enhancinजी पैराक्राइन कहनेवाला संचार मार्ग (एन = 12 = एन 60). * ARL की उपस्थिति बनाम अभाव में पी <0.001 प्रतीक है.

सामान्यीकृत ए.ए. सेंट त्रुटि एन पता आंकड़े
नियंत्रित 100 8.31 3 30
siScramble 87.97 9.3 3 30
siCx43 -1 32.45 8.23 3 30 *
siCx43-2 35.49 7.06 3 30 *
नियंत्रण पेप्टाइड 91.68 6.5 8 40
गैप 26 46.67 4.24 8 40 *
गैप 27 53 4.76 8 40 *
बुनना-एल 2 6.99 0.71 3 30 *

तालिका 1. (एए) BCEC में सामान्यीकृत सक्रिय क्षेत्र पर Cx43, connexin अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड्स और सेल पारगम्य पेप्टाइड बुनना-एल 2 को निशाना बनाने siRNA अणुओं का प्रभाव.
एन प्रयोगों के दिनों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, एन यांत्रिक stimulations की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. * प्रतीक पी नियंत्रण की स्थिति की तुलना में 0.001 <.

<टीआर>
ए.ए. अनुक्रम
नियंत्रण पेप्टाइड SRGGEKNVFIV
Gap26 VCYDKSFPISHVR
Gap27 SRPTEKTIFII
बुनना-एल 2 YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK
TAT-L2H126K/I130N YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK
10Panx1 WRQAAFVDSY

तालिका 2. इस्तेमाल किया पेप्टाइड्स के एमिनो एसिड दृश्यों.

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम एक micropipette का उपयोग एक स्थानीय और नियंत्रित यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करके प्राथमिक गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के monolayers में कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार को मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है. यंत्रवत् उत्तेजित कोशिकाओं +, जो दोनों के कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रचार 11,67 ड्राइव जरूरी है कि intracellular संकेतन अणुओं हैं इंट्रासेल्युलर आईपी 3 और सीए 2 में एक स्थानीय वृद्धि के साथ जवाब. सीए 2 + hemichannels के उद्घाटन और जी प्रोटीन युग्मित P2 के सक्रियण के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं में सीए 2 + संकेतों से चलाता है जो एटीपी 68,69, की रिहाई भड़काती जबकि आईपी 3 सीधे, अंतराल जंक्शन चैनलों 5 के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं को सौंप दिया है रिसेप्टर्स 37-40. अंतराल जंक्शन चैनलों और इस प्रक्रिया में hemichannels के सापेक्ष योगदान CX-अनुकरण करनेवाला के उपयोग द्वारा विशेषता जा सकता हैपेप्टाइड्स, एटीपी अपमानजनक एंजाइमों (ectonucleotidases) और ectonucleotisdases के अवरोधकों. गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं में यांत्रिक उत्तेजना प्रेरित कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार के गुणों को अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला 25-33 में लक्षण वर्णन किया गया है. हमारे परिणाम कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रचार मुख्य रूप से एक प्रमुख भूमिका निभा रहा है Cx43 के साथ एटीपी के एक CX-hemichannel की मध्यस्थता रिहाई, के द्वारा संचालित है कि संकेत मिलता है. जैसे, प्राथमिक गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के लिए लागू इस पद्धति देशी कोशिकाओं में अंतर्जात स्तरों पर Cx43 hemichannels के नियमन की पहचान या चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. इस पद्धति का उपयोग करके, हम Cx43 hemichannels की गतिविधि समीक्षकों actomyosin एक अंतर्जात ब्रेक अत्यधिक रोकने के रूप में सेवा कर सकता है जो cytoskeleton है, और इस तरह हानिकारक, Cx43 hemichannel उद्घाटन 25,31,32 द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि मिल गया है. हम आगे इस विनियमन अंतर्निहित आणविक तंत्र स्पष्ट और पाते हैंCx43 hemichannels 33 के उद्घाटन के लिए आवश्यक हैं कि intramolecular पाश / पूंछ बातचीत की एक महत्वपूर्ण भूमिका है.

जाहिर है, इस प्रणाली Cx और Panx आधारित अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels के समारोह के अध्ययन के लिए बहुत उपयुक्त है और निश्चित रूप से गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं तक सीमित नहीं है, लेकिन वास्तव में किसी भी कोशिका प्रकार और भी अधिक जटिल ऊतकों के लिए अनुकूल है, के रूप में दिखाया गया है यांत्रिक उत्तेजना बड़े कहनेवाला सीए 2 + लहरों पूरे गोलार्द्ध को शामिल 70 ट्रिगर जहां मस्तिष्क में. विभिन्न उपकरणों CX-अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड्स, एटीपी अपमानजनक एंजाइमों, ectonucleotidases के अवरोधकों और carbenoxolone और 10 Panx1 (तालिका 2) 49,50 जैसे औषधीय यौगिकों सहित अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels, के योगदान का आकलन करने के लिए मौजूद हैं. इस प्रक्रिया में एक निश्चित Cx या Panx isoform के योगदान का निर्धारण सावधानी से तैयार siRNA को जांच करने के लिए टीmRNA और एक तले नियंत्रण के दो स्वतंत्र क्षेत्रों argeting इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पछाड़ना की हद तक पश्चिमी सोख्ता assays और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकल कोशिका के स्तर का उपयोग करते हुए कुल प्रोटीन के स्तर पर निर्धारित किया जाना चाहिए. प्रयोगात्मक सेल monolayers में siRNA जांच के अभिकर्मक दक्षता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इस के लिए, एक एक फ्लोरोसेंट लेबल भावना कतरा के 3 'अंत में शामिल किया गया है जिसमें एक डुप्लेक्स siRNA को विकसित कर सकते हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि उचित विश्लेषण के लिए, Cx या Panx isoform (> 90% की कमी) की एक प्रमुख कमी है, साथ ही सेल monolayer में siRNA duplexes (> कोशिकाओं के 90% siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट का एक समरूप अभिकर्मक जांच) प्राप्त किया जाना चाहिए. लक्ष्य की ओर बनाया गया है siRNA जांच के चयनात्मकता 71 मूल्यांकन किया जाना चाहिए. संक्षेप में, इन उपकरणों वे अन्य Cx या Panx isoforms या अन्य प्रमुख कॉम की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करते कि इतना मान्य किया जाना चाहिएकहनेवाला 2 सीए ड्राइविंग ponents + लहरों, P2X या P2Y रिसेप्टर्स की तरह. Cx43 hemichannels के योगदान का आकलन करने के लिए, हम में से एक चयनात्मक, शक्तिशाली अवरोध के रूप में कार्य करता है कि Cx43 (बुनना-एल 2) के intracellular पाश की दूसरी छमाही के लिए इसी एक सेल पारगम्य पेप्टाइड के विकास में डा. Leybaert की प्रयोगशाला के साथ सहयोग किया है Cx43 hemichannels Cx43-अंतर जंक्शन चैनल गतिविधि 33 को बनाए रखने. हमारे अध्ययन में, हम Cx43 hemichannels की एक पूर्ण निषेध प्राप्त करने के लिए 100 माइक्रोन बुनना-एल 2 का उपयोग करें, लेकिन कम सांद्रता पर्याप्त 72 हो सकती है. TAT-L2H126K/I130N एक नकारात्मक नियंत्रण 73 के रूप में सिफारिश की है. Panx1 चैनलों के योगदान का आकलन करने के लिए, 10Panx1 पेप्टाइड लागू किया जा सकता है. ये उपकरण (एम जैसे प्लाज्मा झिल्ली विघटन (नीचे देखें) को छोड़कर के लिए, लेकिन यह भी hemichannels द्वारा और नहीं अन्य तंत्र द्वारा कि पैराक्राइन एटीपी संकेत मध्यस्थता कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार के तंत्र का प्रदर्शन के लिए न केवल महत्वपूर्ण हैंAXI-आयनों चैनलों या एटीपी युक्त vesicles की रिहाई). अंत में, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग सभी के अध्ययन के लिए, के रूप में सेल संस्कृति शर्तों और मार्ग की संख्या कोशिकाओं के जैविक गुणों के रूप में, मानकीकृत किया जाना चाहिए और इस प्रकार विभिन्न Cx और Panx isoforms की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के समय 26 से अधिक बदल सकते हैं.

फिर भी, इस विधि के लिए कमियों के एक नंबर रहे हैं. विधि करने के लिए एक बड़ा नुकसान है कि यांत्रिक उत्तेजना बाह्य 2 सीए के प्रवेश के लिए अग्रणी प्लाज्मा झिल्ली विघटन ट्रिगर हो सकता है + और ​​सदाशयी कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रसार 11 आबाद जो दोनों एटीपी तरह संकेतन अणुओं की रिहाई. यह निश्चित रूप से कहनेवाला सीए 2 + लहर का (मात्रात्मक) विश्लेषण पेचीदा हो. इसलिए, यह अत्यधिक एक) उचित नियंत्रण, Cx या Panx isoforms की अभिव्यक्ति जो कमी यानी सेल लाइनों और उपकरणों मैं इस्तेमाल करना चाहिए की सिफारिश की है कि क ¥अंतराल जंक्शन चैनलों और / या hemichannels और द्वितीय के रूप में Cx और Panx के समारोह के साथ rfere) (यांत्रिक उत्तेजना के दौरान nanopositioner 0.5 और 2 वी के बीच एक वोल्टेज से चलाया जा रहा है कि यह सुनिश्चित कर लें) यांत्रिक उत्तेजना प्रक्रिया मानकीकृत.

इसके अलावा, यह इस विधि से ही खड़े नहीं करता है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है, लेकिन Cx और Panx चैनलों का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर टिकी किया जाना चाहिए. इस इंट्रासेल्युलर आईपी 3 या सीए 2 + 11,74 के uncaging तरह, यांत्रिक, उत्तेजना की मध्यस्थता कहनेवाला सीए 2 + लहर प्रचार में भाग लेने कि intracellular संकेतन अणुओं की एक स्थानीय वृद्धि का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. कहनेवाला 2 सीए यांत्रिक उत्तेजना की स्वतंत्र + लहर, एक + बफ़र्स कोशिकी में एक स्थानीय गिरावट का कारण बनता है कि diazo-2 की तरह इस तरह के पुनः संयोजक समर्थक apoptotic Bax को 11,75 और फोटो सक्रिय 2 सीए के रूप में माइक्रो इंजेक्शन, उपयोग कर सकते हैं आरंभ करने के लिए [सीए 2 + 76], hemichannel खोलने के लिए एक ज्ञात ट्रिगर. वैकल्पिक रूप से, एक intracellular सीए 2 ट्रिगर कि सेल अभेद्य संकेतन अणुओं की सीटू electroporation में उपयोग कर सकते हैं + रिहाई और कहनेवाला 2 सीए ऐसे आईपी 3 67,68 रूप + तरंगों. उत्तरार्द्ध तकनीक भी कोशिका मृत्यु 5,77 के प्रसार की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन गैर यांत्रिक उत्तेजनाओं उत्तेजना तीव्रता से प्रतिक्रिया का एक बेहतर मूल्यांकन प्रदान करते हैं. इन सीए 2 + लहर प्रचार के तरीकों के अलावा, यह हाइड्रोफिलिक डाई तेज के निर्धारण (लूसिफ़ेर पीला) की तरह 78 और एटीपी की रिहाई न केवल में सहित अन्य तरीकों का उपयोग कर Cx या Panx चैनलों की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है लेकिन यह भी बाह्य सीए 2 + बफ़र्स (EGTA की तरह) और intracellular सीए 2 + रिहाई अणु (सीए 2 + ionophore A23187 तरह) 11,74 के जवाब में यांत्रिक उत्तेजना के जवाब. इसके अलावा, टीवह चैनल के स्तर पर नियमन के लिए सबसे अच्छा सबूत electrophysiological प्रयोगों, दोहरी वोल्टेज दबाना सिस्टम या तो या ectopically GFP की तरह एक मार्कर के साथ एक साथ Cx isoforms व्यक्त Cx या Panx mRNA के साथ या HELA कोशिकाओं के इंजेक्शन Xenopus oocytes के पूरे सेल पथ दबाना द्वारा प्रदान की गई है 79-84.

निष्कर्ष निकालना, कहनेवाला 2 सीए उत्प्रेरण के लिए यांत्रिक उत्तेजना का उपयोग + लहरों इंट्रासेल्युलर संचार की जांच और Cx और Panx चैनलों का योगदान और गुणों की जांच करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

प्रयोगशाला में प्रदर्शन अनुसंधान कार्य रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था - फ़्लैंडर्स (FWO; अनुदान संख्या G.0545.08 और G.0298.11), Interuniversity आकर्षण डंडों कार्यक्रम (बेल्जियम विज्ञान नीति; अनुदान संख्या P6/28 और P7/13) और एक FWO समर्थित अनुसंधान समुदाय में अंतर्निहित है. फ़्लैंडर्स (FWO) - CDH रिसर्च फाउंडेशन की एक के बाद डॉक्टरेट साथी है. लेखकों बहुत आण्विक और सेलुलर संकेतन (यू लोवेन), डा. एसपी श्रीनिवास (ऑप्टोमेट्री के इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल, यूएसए), डॉ. Leybaert की प्रयोगशाला (गेन्ट विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्यों के लिए आभारी हैं और कर रहे हैं उपयोगी विचार विमर्श प्रदान की जो डॉ. Vinken (VUB), प्रक्रियाओं अनुकूलित या connexin hemichannels के अध्ययन के लिए उपकरणों के विकास में शामिल किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14155-048
Iodine Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) 38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 11960-044
L-glutamine (Glutamax) Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 35050-038
Amphotericin-B Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A2942
Antibiotic-antimycotic mixture Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 15240-096
Trypsin Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 25300-054
Dulbecco's PBS Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) 14190-091
Fluo-4 AM Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany) F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A265
Apyrase VI Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6410
Apyrase VII Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany) A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR) Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII) Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV) Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark) 155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany) LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner) PI Polytech (Karlsruhe, Germany) P-280
HVPZT-amplifier PI Polytech (Karlsruhe, Germany) E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter) World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA 4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany) WZ DMZ-Universal Puller

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References

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D'hondt, C., Himpens, B., Bultynck, G. Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (77), e50443, doi:10.3791/50443 (2013).

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