Summary
Un nuovo approccio che combina il trapianto intraoculare e la microscopia confocale permette longitudinale, non invasivo imaging in tempo reale con singola cella di risoluzione all'interno di tessuti innestati
Abstract
Intravitale immagini è emerso come uno strumento indispensabile nella ricerca biologica. Nel processo, tecniche di imaging sono state sviluppate molte differenti per studiare processi biologici negli animali non invasivo. Tuttavia, un grande limite tecnico in vigore le modalità di imaging intravitale è l'incapacità di combinare non invasivo, l'imaging longitudinale con cella singola capacità di risoluzione. Mostriamo qui come il trapianto nella camera anteriore dell'occhio elude tale limitazione significativa che offre una piattaforma versatile sperimentale che permette di non invasivo, l'imaging longitudinale con risoluzione cellulare in vivo. Dimostriamo la procedura di trapianto nel topo e di fornire risultati rappresentativi utilizzando un modello con rilevanza clinica, in particolare trapianto di isole pancreatiche. Oltre a consentire la visualizzazione diretta in una varietà di tessuti trapiantati nella camera anteriore dell'occhio, questo approccio fornisce una piattaforma per ghialonefarmaci n eseguendo a lungo termine di follow-up e il monitoraggio nei tessuti bersaglio. Grazie alla sua versatilità, tessuto / trapianto di cellule nella camera anteriore dell'occhio non solo terapie di trapianto benefici, si estende ad altre applicazioni in vivo per studiare processi fisiologici e fisiopatologici quali trasduzione del segnale e nel cancro o sviluppo della malattia autoimmune.
Introduction
I progressi nella microscopia intravitale hanno rivelato fenomeni fisiologici non previsto da studi in vitro 1. Questo mette in evidenza la sfida di tradurre i risultati ottenuti con convenzionali metodi in vitro nell'animale vivente. Negli ultimi dieci anni, la visualizzazione dei tessuti negli animali vivi è stata notevolmente migliorata dai progressi tecnologici in modalità di imaging 2, 3, 4, 5, 6. Questo ha stimolato la necessità di approcci di imaging in vivo con applicazione realizzabile in modelli animali sperimentali per consentire la visualizzazione longitudinale dei tessuti bersaglio non invasivo.
Le tecniche di imaging come la risonanza magnetica e la tomografia ad emissione di positroni o bioluminescenza hanno permesso non invasiva per immagini di organi / tessuti in profondità all'interno del corpo 7-8, 9. Ma queste tecniche non possono realizzare singola cella di risoluzione a causa di segnali di fondo e alla bassa risoluzione spaziale, nonostante l'uso of materiali ad alto contrasto o di tessuto-specifica 4 luminescenza. Questo è stato affrontato con l'avvento di due fotoni microscopia a fluorescenza confocale 10. Due-fotone microscopia abilitato studi di imaging intravitale per visualizzare e quantificare gli eventi cellulari con dettagli senza precedenti 11, 12. Questo ha portato alla caratterizzazione dei principali processi biologici in salute e malattia 13, 14, 15, 16. Mentre pionieristici studi di imaging intravitale sono principalmente "imitato" in condizioni in vivo nel tessuto asportato (linfonodi ad esempio), altri studi hanno utilizzato poco invasive per tessuti bersaglio di immagini esposte in situ 17, 18, 19, 20, 21. Altri studi hanno utilizzato anche modelli a camera "finestra" per aggirare le limitazioni connesse con approcci invasivi e la risoluzione limitata di imaging in vivo 22, 23, 24, 25. Nel modello camera di finestra, una camera con una finestra trasparente viene impiantato chirurgicamente nella pelle con diffelocalità affitto (pelle dorsale o l'orecchio, mammaria cuscinetto adiposo, fegato, ecc) su l'animale (ad esempio topo, ratto, coniglio). Anche se questo approccio consente in modo chiaro ad alta risoluzione di immagini in vivo, che richiede un intervento chirurgico invasivo per impiantare la camera e non può essere in grado di ospitare studi di imaging longitudinale su diverse settimane o mesi 22.
È stato recentemente dimostrato che la combinazione di alta risoluzione microscopia confocale con una procedura minimamente invasiva, ossia trapianto nella camera anteriore dell'occhio (ACE) fornisce una "finestra naturale corpo" come un potente e versatile in vivo imaging piattaforma 26, 27. Trapianto nel ACE è stato usato negli ultimi decenni per studiare aspetti biologici di una varietà di tessuti 28, 29, 30, e la sua combinazione con la recente imaging ad alta risoluzione abilitato studiando la fisiologia delle isole pancreatiche con singola cella di risoluzione non- invasiva e longitudinalmente <sup> 26, 27. Questo approccio è stato utilizzato per studiare le risposte autoimmuni durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 in modelli animali (dati non pubblicati). E 'stato anche utilizzato per studiare lo sviluppo del pancreas, così come, negli studi di funzione renale da trapianto in gemme pancreatiche l'asso o singoli glomeruli renali, rispettivamente (dati non pubblicati). Un recente rapporto di questo approccio ulteriormente dimostrato la sua applicazione per studiare la risposta immunitaria dopo trapianto di isole pancreatiche 31. Importante, questo studio ha dimostrato che il trapianto nella camera anteriore dell'occhio fornisce una finestra naturale del corpo per eseguire: (1) longitudinale, non invasiva dei tessuti trapiantati in vivo; (2) in vivo per valutare cytolabeling fenotipo cellulare e la vitalità in situ, (3) monitoraggio in tempo reale di infiltrare cellule immunitarie nel tessuto bersaglio, e (4) intervento locale per l'applicazione topica o iniezione intraoculare.
Qui, Siamo demonstrate come eseguire il trapianto nella camera anteriore dell'occhio utilizzando isole pancreatiche.
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Protocol
La seguente procedura viene eseguita sotto la stereoscopio in due fasi, la prima fase consiste nel caricare le isolette nella cannula e la seconda fase è il trapianto effettivo nel ACE. Tutte le procedure eseguite su animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del comitato istituzionale uso (IACUC) dell'Università di Miami.
1. Isolotti Caricamento in Cannula per trapianto
- Centro gli isolotti in piastra di coltura, facendo girare il piatto nei circoli restringimento.
- Scollegare la cannula del "serbatoio" e posizionare la cannula e il tubo di collegamento su una superficie pulita. Il serbatoio può essere realizzata con una punta di 300 ml monouso pipetta di plastica senza filtro (Figura 1a).
- Lavare le bolle d'aria dal serbatoio per garantire flusso continuo di isolette aspirazione quando nel serbatoio. Lavaggio del serbatoio è fatto da portare avanti a mani libere motorizzato siringa-driver usando il pedale(Figura 1b, c). Questo renderà anche spazio nella siringa per consentire l'aspirazione degli isolotti nel serbatoio (pre-caricato con soluzione sterile come supporti salina, PBS o cultura).
- Aspirare delicatamente quantità desiderata di isolotti nel serbatoio. Isolotti tenderà a ricciolo che entrano nel serbatoio e rimarrà insieme verso il basso. L'aspirazione è fatto da guida in retromarcia il motore siringa driver usando il pedale.
- Ricollegare la cannula al serbatoio attraverso il tubo di collegamento.
- Posizionare la punta della cannula indietro nel piatto di coltura e lavare gli isolotti dal serbatoio nel tubo poi nella cannula. Assicurarsi che le isole restare insieme come back-riempire il tubo / cannula delicatamente "sfogliando" (tapping) il tubo (Figura 1d). Arrestare prima o dopo le bolle d'aria prima delle isolette sono lavata la cannula. Se non è sicuro, come smettere isolotti immettere retro della cannula come aria rimanentebolle davanti a isole può aiutare a prevenire il reflusso (riflusso) di isolotti fuori dalla ACE. Will dissipare durante la notte.
- A questo punto, si è pronti a iniettare le isole nel ACE (si prega di vedere i passi successivi).
2. Trapianto di Isole nella camera anteriore dell'occhio
- Posizionare il mouse anestetizzato su un tappetino caldo sotto stereoscopio.
- Posizionare il muso del mouse in anestesia "maschera" collegato all'ossigeno / macchina di anestesia isoflurano. La maschera è realizzata su una punta di 1 ml pipetta monouso in plastica (senza filtro) e collegata al tubo anestesia attraverso l'estremità stretta (Figura 2a, b).
- Estrarre con cautela le palpebre dell'occhio da trapiantare con il dito indice e il pollice della mano libera e "pop" l'occhio per una migliore esposizione e di facile accesso (Figura 2c). Ciò richiederà una certa pratica per perfezionare senza ostacolare la respirazione del mouse da una pressione eccessiva sulcollo o bloccare il flusso di sangue alla testa.
- Usando una siringa monouso di insulina (29 - 31G) come bisturi, cura solo la punta penetrare nella cornea e fare una singola incisione laterale. Effettuare l'incisione al punto intermedio tra l'apice della cornea e limbus minimizzare riflusso delle isolette durante l'iniezione dal ACE (figura 2d).
- Inserire delicatamente la cannula (precaricato con isolotti) attraverso l'incisione.
- Lentamente espellere isolotti fuori della cannula e depositarli sopra il diaframma. Per evitare il riflusso isolotto causa di un accumulo di pressione eccessiva nel ACE, espellere gli isolotti di spinte brevi come piccolo volume (s) possibile nel quadrante opposto della incisione. Questo può essere ulteriormente garantita da compattazione isolotti nel tubo durante il caricamento della cannula (si prega di vedere il punto 1.6).
- Lentamente ritirare la cannula dalla ACE. Questa è una fase critica, in particolare, se un grande volume di isolotti stato iniettato come riflusso isolotto causa presche accumula all'interno del ACE può essere inevitabile. Per eliminare / ridurre al minimo il reflusso isolotto, ruotare delicatamente la cannula mentre all'interno della ACE per scaricare la pressione in eccesso attraverso l'incisione intorno alla cannula. Verificare la presenza di segni di reflusso come si tenta di ritrarre la cannula e, se necessario, attendere fino alla scomparsa di pressione prima di ritrarre completamente la cannula dalla ACE.
- Sciacquare l'occhio trapiantato con PBS sterile o soluzione fisiologica.
- Iniettare buprenorfina per postoperatoria (0,05-0,1 mg / kg, per via sottocutanea) per le prime 48 ore.
- Applicare oftalmica unguento antibiotico eritromicina a occhio trapiantato immediatamente dopo il trapianto.
- Posizionare l'animale indietro in una gabbia riscaldata per permettere il recupero dall'anestesia.
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Representative Results
Ci sono alcuni parametri che definiscono un trapianto "buono". Un trapianto buona è quella che procede senza sanguinamento quando si effettua l'incisione come si può vedere nel video. Sanguinamento è impedito / minimizzato penetrare solo la punta del bisturi (aghi) nel ACE (Figura 3a). Questo aiuterà anche a prevenire il contatto e la puntura dell'iride. Essa garantirà inoltre una piccola incisione che guarirà molto bene senza causare opacità della cornea nel tempo (figura 3c, d). Un altro aspetto importante da un trapianto di successo è poter trapiantare la quantità totale desiderata di isolotti senza perdita dovuta alla fuori riflusso della ACE. Come menzionato nel passaggio protocollo 1,6, questo può essere minimizzato estraendo le isolette in volume meno possibile e, se del caso, utilizzando bolle d'aria per sigillare l'incisione sulla retrazione finale della cannula dal ACE (Figura 3b). Inoltre, fornendo l'i slets sopra del diaframma tra il bordo della pupilla e del limbus posiziona gli isolotti in una posizione molto riconducibile per imaging in vivo (Fig. 3d). Dal punto di vista pratico, avente le isolette in questa posizione intermedia del diaframma riduce lo spessore delle immagini z-stacks deve estendersi isolette intere (Figura 4). Questo è particolarmente importante durante fluorescenza confocale / two-photon imaging in vivo dove una piccola z-stack permette un migliore recupero di specifici segnali di fluorescenza in sezioni più profonde del tessuto ripreso con migliore xy e risoluzioni za causa disperdono meno luce dal tessuto. Inoltre, spesso z-stack richiedono un tempo di acquisizione più che aumenta il rischio di deriva strumentale o animale, in particolare durante l'imaging in vivo.
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Figura 1. Fotografie del nostro apparato trapianto comprese tutte le parti. (A) assemblato siringa di vetro con tubo, serbatoio, e la cannula. (B) motorizzato siringa-driver con la siringa montata. (C) doppio pedale per azionare il conducente siringa motorizzata. Premendo uno aziona il pedale all'indietro stantuffo della siringa (aspirazione) o in avanti (espulsione). (D) primo piano della cannula e il tubo di collegamento che mostra gli isolotti confezionati sul retro della cannula. Questa configurazione consente la consegna delle isolette nella camera anteriore dell'occhio in un volume minimo per ridurre il reflusso e la perdita di isolotti.
Figura 2. Rappresentazione del transplantatisulla procedura nella camera anteriore dell'occhio (ACE). (a), Fotografia della maschera anestesia mouse. (b) Close-up vista della maschera anestesia fatta di una punta di uno in plastica monouso pipetta ml senza filtro. Più fori sono stati realizzati nella punta per consentire miscelazione di ossigeno con isoflurano prima di raggiungere il mouse. (C) vista ravvicinata mostra l'occhio da trapiantare esposto per un migliore accesso. L'occhio è esposto da distendendo la pelle della testa con il pollice e l'indice. (D) Rappresentazione schematica della procedura di trapianto evidenziando la posizione dell'incisione al punto intermedio tra l'apice della cornea e del limbus. La cannula viene inserita attraverso l'incisione per fornire le isolette nella ACE. Isolotti sono depositati sopra dell'iride dove attecchire.
Figura 3. Immagini rappresentative di trapianto "buona" evidenziando fasi critiche garantire risultati positivi. (A) della serie di immagini che mostrano quanto la punta del bisturi (aghi) viene spinto nella cornea rendendo l'incisione. Una piccola incisione viene fatta senza sanguinamento. L'incisione è leggermente più grande della cannula. (B) serie di immagini che mostrano isolotti di essere espulso dalla cannula sopra il diaframma durante l'utilizzo di bolle d'aria per impedire il reflusso. Si noti come "piegato" la cannula sembra dovuto alla luce rifrazione una volta all'interno della ACE. (C) immagine rappresentativa di un occhio trapiantato evidenziando la chiarezza della ACE immediatamente dopo il trapianto. (D) Serie di immagini dell'occhio stesso acquisita sul specificata post-operatorie giorni (POD), evidenziando la posizione preferita di isolotti in vivo imaging e come ben guarito e l'incisione è localizzato e la chiarezza della cornea a 6 settimane dopo il trapianto.
Figura 4. Rappresentante immagine di fluorescenza confocale di un isolotto pancreatico trapiantato nella camera anteriore dell'occhio mouse (ACE) evidenziando i vantaggi della posizione isolotto l'iride e la capacità di risolvere singole celle durante l'imaging in vivo (a) massima di proiezione (2. - D vista) di Z-stack di un isolotto (indicato con linea tratteggiata) sopra l'iride di un topo C57BL / 6 transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) attivato in memoria e cellule T 32. L'immagine è stata acquisita 5 giorni dopo il trapianto, dove sono state rilevate alcune infiltranti cellule T (verde) nell'iride circonda l'isolotto. L'isolotto e iris sono state visualizzate mediante backscatter laser o reflection (grigio). (b) viste tridimensionali (3-D) dello stesso isolotto evidenziando i vantaggi di angolo di visione di immagini / ridurre il z-stack spessore di acquisire l'intero volume isolotto e la struttura circostante e cellule immunitarie. Notare assi XYZ per la rotazione dell'immagine.
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Discussion
Isole pancreatiche murine sono state isolate mediante digestione con collagenasi seguita da purificazione su gradienti di densità, come descritto in precedenza 33. Isole isolate sono state coltivate durante la notte prima del trapianto. Mentre questo può non essere necessario, si raccomanda di consentire gli isolotti di recuperare dalla procedura di isolamento. Questo è fondamentale quando il trapianto viene eseguito nei pazienti diabetici in quanto garantirà il trapianto di sopravvivere / isole robuste.
Il trapianto viene eseguito in anestesia generale con ossigeno / miscela di isoflurano (1,5-3%) inalazione ad effetto. Alternativi anestetici o iniezione ketamina (ad esempio) può essere utilizzato. Se l'anestesia iniezione viene utilizzato, saltare il punto 2.2 in protocollo. Fornire l'animale anestetizzato con una fonte di calore per evitare l'ipotermia durante la procedura. In alcuni topi, è possibile rompere vasi sanguigni quando si effettua l'incisione nel co tipicamente avascolarernea. Per esempio, la cornea di topi nudi tende ad essere vascolarizzato; evitare aree vascolarizzate quando possibile. Utilizzare una siringa nuova per incisione. Evitare la puntura del diaframma con l'ago quando si effettua l'incisione. Evitando il contatto con il diaframma può essere ulteriormente garantita dal fronte al lato smussato della punta dell'ago verso il diaframma. Non asciugare / aspirare umore acqueo dopo aver fatto l'incisione. È più facile penetrare la cannula attraverso l'incisione in una cornea "wet"; aggiungere qualche goccia di PBS sterile supporti o cultura alla cornea, se necessario.
Postoperatoria può essere ottenuta con iniezione sottocutanea buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) o analgesico preferito (s) per le prime 48 ore. Nel passo 2,9, amministriamo analgesia immediatamente dopo la procedura come l'animale è già profondamente in anestesia generale. Se lo si desidera, invece, passo 2,9 può essere eseguita dopo la fase 2.2 del protocollo, con o senza anestesia topica per l'occhio (consultare il proprio localeIACUC o veterinario). Antibiotici oftalmici alternativa può anche essere usato.
Qui, abbiamo utilizzato una fuoriserie apparato microiniezione azionabile tramite un pedale per guidare il 100 microlitri siringa di vetro di precisione per aspirare (carico) ed espellere gli isolotti fuori la cannula nel ACE (Figura 1). Questo può essere sostituito con qualsiasi gas 100 microlitri siringa a tenuta di vetro di precisione con una vite-driven stantuffo che può essere azionato manualmente per aspirare / espellere le isolette, questo però probabile che richiedono l'assistenza di un'altra persona per operare. In ogni caso, anche se non richiesto si consiglia di pre-caricamento della siringa assemblata, tubi, e serbatoio con una soluzione sterile (salina, PBS o cultura media) per garantire l'aspirazione regolare e espulsione degli isolotti. Ciò è particolarmente importante se / quando le isole confezionati intasare la cannula.
Noi di solito eseguire le nostre procedure di trapianto in condizioni di pulizia all'interno di una cabina di biosicurezzainet senza rischio di infezioni. Tutte le soluzioni utilizzate, siringhe, cannule, tubi, e garze vengono sterilizzati in autoclave o gas-sterilizzati. Mentre, non possiamo accertare la sterilità completo a causa di contatto delle mani con il mouse durante la procedura, non abbiamo avuto problemi con la contaminazione isolotto seguendo la procedura sopra consigliati.
Abbiamo dimostrato qui come trapiantare isole pancreatiche nel ACE per scopi di imaging in cui sono necessari meno isole da trapiantare. Nel caso in cui si desideri inversione diabete nell'animale ricevente, una maggiore quantità di isolotti deve essere trapiantato 26, 27. Mentre la procedura di trapianto è identico a quello che abbiamo mostrato qui, si dovrebbe prestare particolare attenzione alle misure 2.6 e 2.7 del protocollo per evitare la perdita di isole trapiantate a causa di riflusso.
Una volta appreso, questa procedura di trapianto può essere eseguita in ~ 5 min per topo. Questa tecnica può essere usata per trapiantare una varietà di tissues nella camera anteriore dell'occhio. Come menzionato sopra, abbiamo trapiantato glomeruli renali come pure il tessuto embrionale (gemme pancreatiche) per studiare lo sviluppo del pancreas nella camera anteriore dell'occhio in vivo.
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Disclosures
PO.B. è uno dei fondatori della Biocrine società biotech, che sta per utilizzare la camera anteriore dell'occhio come una piattaforma di servizio commerciale. AC è il brevetto che protegge questa tecnologia.
Acknowledgments
Riconosciamo Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier e Daniel Nyqvist per le discussioni fruttuose. Ringraziamo anche Eleut Hernandez e Diego Espinosa-Heidmann per l'assistenza tecnica, e Mike e Margaret Valdes Formoso aiuto con registrazione video. Byron Maldonado registrare, modificare e prodotto il video finale. Sostegno alla ricerca è stato fornito dal Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), il NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 di MHA, NIH RO3DK075487 ad AC; U01DK089538 a PO.B.). Sostegno alla ricerca addizionale PO.B stato fornito mediante fondi del Karolinska Institutet, il Consiglio svedese della ricerca, la Fondazione Diabete svedese, il Erling Persson-Family Foundation, la Famiglia Knut e Alice Wallenberg Foundation, la Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANT ( FP7-228933-2), programma di ricerca strategica nel diabete al Karolinska Institutet, la Novo Nordisk Foundation e Fondazione Berth von Kantzow di.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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