Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Forbedret forarbejdning og konservering af Hippocampale Mouse Skiver for en meget stabil og reproducerbar optagelse af langfristet Potensering

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Denne artikel præsenterer en komplet metode til at forberede og bevare

Abstract

Langsigtet (LTP) er en form for synaptisk plasticitet kendetegnet ved en stigning i synaptisk styrke og menes at være involveret i hukommelsen kodning. LTP fremkaldt i CA1-regionen af ​​akutte hippocampusskiver er blevet grundigt undersøgt. Men de molekylære mekanismer, der ligger vedligeholdelsesfasen af ​​dette fænomen er stadig dårligt forstået. Dette kan til dels skyldes de forskellige eksperimentelle betingelser, der anvendes af forskellige laboratorier. Faktisk vedligeholdelsesfasen af ​​LTP er stærkt afhængig af eksterne parametre som iltning, temperatur og fugtighed. Det er også afhængig af interne parametre som orientering af udskæring flyet og skive levedygtighed efter dissektion.

Optimeringen af ​​alle disse parametre muliggør induktion af en meget reproducerbar og meget stabil langsigtet potensering. Denne metode giver mulighed for yderligere at udforske de molekylære mekanismer, der er involveret i den stabile stigningi synaptisk styrke i hippocampusskiver. Det understreger også betydningen af eksperimentelle forhold i in vitro undersøgelser af neurofysiologiske fænomener.

Introduction

I dag er der begrænset forståelse af, hvordan komplekse erindringer lagres og hentes på den neuronale kredsløb niveau. Men en samlende hypotese hukommelse opbevaring er tilgængelig og bredt accepteret: erindringer lagres som ændringer i styrken af ​​synaptiske forbindelser mellem neuroner i centralnervesystemet. På eget, har forskning i synaptisk plasticitet i høj grad nydt godt af to banebrydende opdagelser. (1) I en skelsættende eksperiment, Bliss og Lomo 1, ved hjælp af intakte bedøvede kanin, fandt, at levering af et kort med høj frekvens (1 sek, 100 Hz) stimulation til perforante sti af hippocampus forårsagede en langvarig (flere timer) stigning i de relaterede synaptiske forbindelser. Denne fascinerende fænomen blev kaldt "langtidspotentiering" eller LTP af Douglas og Goddard i 1975 2.. (2) Senere blev det konstateret, at et lignende fænomen kan udløses i hjernen skiver (0,4 mm) kunstigt opretholdt i live in vitro observeret in vitro ved at levere en eller flere tetani til et bundt af axoner (de såkaldte Schaffer sikkerhedsstillelsen), mens der optages resulterende feltet excitatorisk synaptisk potentiale fremkaldt i de pyramidale neuroner i det såkaldte CA1-region. Mekanismerne i LTP induktion er i vid udstrækning blevet afsløret. Dybest set, en Ca2 +-indstrømning gennem NMDA-receptorerne aktiverer enzymer med to konsekvenser: en phosphorylering af AMPA-receptorer (hvilket øger deres effektivitet) og en inkorporering af ekstra AMPA-receptorer i den postsynaptiske membran 3.. Derimod er mekanismerne i vedligeholdelsesfasen af ​​LTP stort set ukendt, især fordi det er eksperimentelt meget mere vanskeligt at opretholde en skive sundt for mange timer end i 30 til 60 min.

En lang række undersøgelser har været dedikeret til forståelsen af LTP mekanismer og interessante teorier er blevet udarbejdet i løbet af årene 4-11. Men until nu, har de præcise molekylære mekanismer bag den stabile stigning i synaptisk styrke ikke er blevet belyst. Dette kunne til dels skyldes vanskeligheden ved at gengive tidligere resultater i forskellige laboratorier ved hjælp af forskellige teknikker til udarbejdelse og vedligeholdelse af hippocampusskiver. I deres metode papir understregede Sajikumar et al. 12. betydningen af eksperimentelle betingelser for udarbejdelse af rotte hippocampusskiver og registrering af stabile LTP. I denne video præsenterer vi alle optimering trin udviklet i vores laboratorium gennem årene for at kunne optage en meget stabil LTP i muse hippocampusskiver.

Denne optimering er fremstillet af protokoller udviklet og anvendt med succes af andre laboratorier, der studerer LTP mekanismer hos mus 13 og rotter 11.. Det giver erfarne forskere til at inducere og optage en meget langvarig LTP i voksne mus med en høj succesrate. Physiological grundlag af den inducerede LTP blev omhyggeligt kontrolleret og demonstreret 14.. I denne metode papir, viser vi, at eventuelle ændringer af eksperimentelle forhold, såsom temperatur eller iltning kan have en dybtgående indvirkning på LTP vedligeholdelse, mens dissektion procedure dybt kan ændre skiver ophidselse. Det skal også understreges, at den præcise styring af alle disse parametre kræver en uddannelse af flere måneder for nybegyndere studerende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle animalske procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health regler for pasning og anvendelse af dyr til forskning og efter aftale med den lokale etiske komité.

1.. Fremstilling af kunstig cerebrospinalvæske

De samme medier bruges til at dissekere, skære og perfundere skiver (1 ml / min) i hvileperioden og elektrofysiologiske optagelser. Dette medie er sammensat af 124 mM NaCl, 4,4 mM KCI, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4 og 10 mM D-glucose.

  1. Afveje de forskellige komponenter til 2 L af ACSF undtagen MgSO4 som allerede er i opløsning (1 M). Ved hjælp af en standardløsning gør det muligt at være sikker på den nøjagtige koncentration af Mg 2 +, fordi MgSO4 i pulverform er meget hygroskopisk. Ca 2 +: Mg2 + forholdet i høj grad påvirker LTP induktion og vedligeholdelse14 og dermed deres proportioner skal altid respekteres.
  2. Sæt alle komponenter undtagen CaCl2 i et glas måleglas og bringe til 2 L med destilleret H 2 O.
  3. Rør kraftigt. Når alt er opløst, tilsættes carbogen gennem et akvarium bobleflasken og rørene forbundet til tanken (95% O 2, 5% CO 2). Vent et par minutter og tilsæt calciumchlorid, når pH er fastsat til 7,4 ved virkningen af ​​bikarbonat buffer.
  4. Hold 600 ml i en nedkølet rektangulær glasskål og køle ned til 4 ° C med is omkring skålen. Dette medie vil blive anvendt til hippocampus dissektion.
  5. Filtrere de resterende 1.400 ml og holde en Erlenmeyerkolbe.

2.. Forberedelse af Elektrofysiologiske Rig og Hjernen Slice Recording Chamber

Perfusionskredsløbet er lavet af 2 peristaltiske pumper, hvoraf den ene pumpe frisk væske fra en reservetank, og den anden pumpe brugte væsker fra tHan optager kammer til en bin. Frisk væske tilsættes til en hjemmelavet perfusion system, hvor det er re-iltet og varmes før de når grænsefladen optagelse kammeret ved tyngdekraften (Figur 1A). Interfacet optagelse Kammeret blev designet af FST (Fin Science Tools Vancouver, Canada, figur 1B). Vævssnit anbringes på vævede net filter fastgjort til et aftageligt godt ringen og kontinuerligt kan holdes under grænseflader ved at justere højden af ​​sugebrønd nål. En hjemmelavet plastrør blokeret på sin ende og perforeret sideværts (0,5 mm) er fastgjort til suge nål til at øge niveauet stabilitet i kammeret. Skrivehovedet er monteret over et vandbad indeholdende en gas dispersion sten, som bidrager til at opretholde et fugtigt miljø ved at lede fugtig luft gennem nedbøjning havne i skrivehovedet (for at reducere vand dråbedannelse). Bad og mellemstore temperatur styres ved kontinuerligt at variere niveauet af DC-strøm thru en siliconegummi-indlejret varmeelement i vandbadet. Termistorer i vandbadet og optagelse brønde tillader temperaturen i kammeret kan indstilles og kontrolleres nøje på disse steder.

Varmesystemet af kammeret er afsluttet med en samlet varmesystem styre temperaturen i hele riggen. Den software udviklet af forskere på University of Edinburgh ( www.etcsystem.com ) overvåger og udligner temperaturen på den iltet luft, hjernen skive, elektroderne og de ​​resterende riggen giver et stabilt miljø for langsigtede optagelser (figur 1C) . Den temperatur, der anvendes til muse hippocampale snit er 28 ° C.

  1. Skyl alle perfusionskredsløbet med destilleret H 2 O i mindst 20 min og start varmeanlæg.
  2. Start carbogen boblende i kredsløbet. Carbogen ankommer i den hjemmelavede perfusion rør gennem filter stearinlys og i vandbadet under optagelsen kammeret. Strømningshastigheden i vandbadet styres af en flowmåler. Hvis strømningshastigheden er for langsom, kan væv bliver hypoxisk. Omvendt, hvis strømningshastigheden er for høj, kan gassen ikke være tilstrækkeligt opvarmet og fugtes fører til udtørring af vævet. Høj gasstrømningshastighed kunne også øge chancen for sprinkling over væv fra vandbadet nedenfor fører til osmotisk chok. Dette kan forhindres ved tilsætning af bits nylonnet (100 um) ved udløbet af den deformation havne.
  3. Hæld vandet fra kredsløbet og fylde op med filtreret ACSF.
  4. Sæt ring, der vil støtte den skive i holding kammer. En vævet net filter med maskestørrelse spænder fra 500 til 750 um er strakt og fastgjort til ringen med todelte harpiks epoxy lim. Den vævede net filter er lavet af 87% polyamid og 13% elastan (trusse 15 den). Lim skal anvendes omhyggeligt for at undgå dannelse af relieffer på overfladen af ​​ring..
  5. Fjern omhyggeligt alle luftbobler fra kredsløbet.
  6. Justere niveauet for ACSF i optagelsen kammer med skruen af ​​suge nål. Hastigheden af ​​de peristaltiske pumper er indstillet til 1 ml / min indløbet pumpen og til 5 ml / min for udløbspumpen.

Perfusionssystemet placeres på en stiv vibrationsfast bord og omgivet af et Faradays bur.

3.. Forberedelse af Dissection Area

Kirurgiske instrumenter: en skalpel med en # 11 klinge, små standard dissekere saks, forår saks, buede pincet, to Heidemann spatulae og en ske.

Supplerende materiale: en guillotine, en underpad, en McIlwain vævshakker med et barberblad, filtrerpapir, en glas Pasteur-pipette med en gummi sut, 2 plast Pasteurpipetter hvoraf med en bred munding, en petriskål, en metallisk cylinder 7 mm i diameter (figur 2A).

    (figur 2A).
  1. Udlæg instrumenter med henblik på brug. Tilsæt tre lag filtrerpapir på vævshakker plade og en ny barberblad rengøres med destilleret vand og ether (figur 2B). Barberblad skal være vandret, når den berører papiret. Klinge kraft indstilles til halvdelen af ​​maksimal værdi og hastighed til cirka en tredjedel af maksimal værdi.
  2. Opmærksomt kontrollere, om alt er klar (instrumenter, temperatur ...), fordi du ikke vil have tid bagefter.
  3. Spørg nogen til at sprøjte dissektion med en Pasteur pipette fyldt med kold ACSF.
  4. Anesthetize mus med Nembutal IP (100 mg / kg) før halshugning. Halothanbedøvelse kan også anvendes. Vi har sammenlignet begge metoder og SKAFFESined samme resultater. Decapitation skal udføres under bedøvelse men cervikal dislokation kan også anvendes. Men halsdislokation har brug for en meget god ide at undgå dyrs lidelser.
  5. Dissekere den inkontinensunderlaget så hurtigt som muligt under koldt ACSF kontinuerlig brusebad.

4.. Brain Fjernelse

  1. Mens du holder stadig hovedet med pegefingeren og tommelfingeren på den ene hånd på næsepartiet, lave et snit med dissekere saks langs midten af ​​toppen af ​​hovedet starter ved kanten af ​​guillotinen cut og kører rostrally til frontal knoglen .
  2. Skære gennem den kutane muskel på hver side af hovedet til fuldt eksponere kraniet pladerne og fjerne musklerne på den kaudale side af hovedet.
  3. Med dissekere saks, klippe temporalis muskel på hver side, langs temporalis plade, skåret så de frontale plader i midten, tværs. Så gør en lille snit på nakkeknude, mellem de to plates.
  4. For hver side, skåret i den kaudale bunden af ​​occipitalplader.
  5. Skær langs sagittale sutur med fjeder saks.
  6. Med pincet, fjern kraniet halvdele ved at sprede dem væk fra hinanden.
  7. Med skalpel skæres tværs lige efter lugtekolben og lige før lillehjernen derefter kaste den udpakkede hjernen i dissekere fad med koldt ACSF.

5.. Hippocampus Dissection

  1. Når hjernen er immerged i dissekere fad, skille de to halvkugler fra hinanden med en skalpel indsat i midten.
  2. Dissektion af hippocampus udføres med spatler under visuel kontrol gennem en kikkert kirurgisk mikroskop (X25, figur 2A). På den ene halvkugle, fordelt omhyggeligt de strukturer for at se den laterale ventrikel. Fjern hjernestammen og diencephalon. Dette gøres ved at anvende spatler på den frontale cortex på den ene side og på diencephalon omanden side. Pas på ikke at røre hippocampus med spatulae og ikke strække det under vævssektionering.
  3. Sever den fornix skub derefter forsigtigt hippocampus ud af cortex (rulle væk), ved at indsætte en spatel i ventrikel.
  4. Når hippocampus ekstraheres, fjerne overskydende cortex væv og de resterende blodkar.

6.. Skæring af udsnitssættet

  1. Med en bred mund plastik Pasteur pipette overføres hippocampus i en ske med sine Alvear overflade opad (konvekse side).
  2. Fjern overskydende væske med en standard plast Pasteur-pipette.
  3. Vip op skeen lodret næsten rører filterpapir for chopper (figur 2B) og slippe væk fra hippocampus fra skeen, ved hurtigt at trykke på filtrerpapiret derefter flytte tilbage skeen.
  4. Orientere hippocampus og skær den tværgående til 400 um med chopper (se figur 2C til orientering af hippocampalepus forhold til barberblad). Handle så hurtigt som muligt.
  5. Fjern filteret papir med skiver hippocampus og pak det omkring metalcylinder at sprede skiver lidt. Derefter fri skiver med sprays af ACSF ved hjælp af en standard plast Pasteur pipette og samle dem i en petriskål fyldt med kold ACSF.

7.. Inkubation af udsnit i interface

  1. Vælg skiver med en standard plastik Pasteur pipette og hurtigt placere dem i optagelsen kammer. Skiver gendanne fra dissektion traumer direkte i optagelsen kammer i grænsefladen ved 28 ° C.
  2. Den skive vil sandsynligvis synke. Sænk væskestanden for at nå den skive niveau og derefter hæve det til at gøre det flyde.
  3. Drej skive i den korrekte position og samtidig sænke niveauet. Udsnit er altid orienteret på samme måde for at lette positioneringen af ​​elektroderne (2 stimulerende og en optagelse elektroder) i CA1-regionen.
  4. Stop, nårvæsken er i grænsefladen. A "menisk" af medier rundt om skive er tegn på en tilstrækkelig grad af medierne. Netto Filteret skal være mættet med medier, men ikke fuldstændigt neddykket.
  5. Hold kammeret dækket med filtrerpapir placeret over den perforerede låg.
  6. Lad skive hvile i mindst 1,5 time ved 28 ° C.

8.. Optagelse af synaptiske reaktioner

  1. Optagelse elektrode: glaskapillarer trækkes til opnåelse af en spids modstand på 2-5 MOhm når den er fyldt med ACSF. Et lille stykke filtrerpapir anbringes omkring spidsen af ​​elektroden og knogle voks påføres i Enden til reducering af kondensvand. Stimulerende elektroder: platin-iridium bipolare klynge elektroder med en 12,5 um diameter er købt fra FHC (USA). Med den rette pleje, kan hver elektrode bruges mindst 30 gange (figur 1B).
  2. Elektroderne anbringes i stratum radiatum af CA1-regionen, alle elektroderne foretop (figur 3A). Elektroder er sænket 75 og 150 um under overfladen af ​​den skive med Narishige mikromanipulatorer. De to stimulerende elektroder placeres for at stimulere to forskellige bundter af Schaffer sikkerhedsstillelser. Når elektroderne er sænket ned på skive, der papirfiltre omhyggeligt placeret rundt for at lukke kammeret.
  3. Bifasisk stimulation (0,08 msek impulsvarighed pr halvbølge) udføres ved en konstant spænding med en Grass stimulator tilsluttet SIU-V isolation enheder. Maksimale respons kontrolleres ved at øge stimulus intensitet fra 2 V til højst 12 V. Field EPSP forstærkes 1.000 gange med en WPI ISO-80 forstærker og filtreret ved 10 Hz og 10 kHz. Signalet sendes derefter til en pc via et nationalt instrument A / D konverter. Stimulation, dataopsamling og-analyse udføres ved hjælp af WinLTP programmet ( www.winltp.com ). Felt EPSP registreres på 40% af den maksimale opnåede amplitude i en input-outsætte kurve. For hver skive er de fEPSP skråninger normaliseret forhold til den gennemsnitlige hældning over 30 min før LTP induktion.
  4. LTP udløses ved at anvende et enkelt tog af stimulering (100 Hz) ved test styrke på en vej, mens den anden vej fungerer som kontrol.

9.. Rengøring af Setup

  1. Skyl alle kredsløb med en 3% opløsning af hydrogenperoxid (H 2 O 2) i mindst 10 minutter, derefter dræne. Kredsløbet vil blive nøje skylles med destilleret vand, før du starter nogen eksperiment. Anvendelsen af H 2 O 2 er ikke absolut påkrævet, da andre laboratorier anvender kun destilleret vand til rengøring, men vi har bemærket aflejring af mørke rester i rørsystemet ved hjælp af kun vand.
  2. Udskift vandet i vandbadet under optagelsen kammeret.
  3. Bath de stimulerende elektroder tips i alkohol for 5 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode er blevet anvendt til at analysere egenskaberne af langvarig langsigtet potensering induceret i akutte hippocampale skiver fra voksne C57BL/6J-mus (janvier SAS, Frankrig) 14. Overraskende har forbedring af de eksperimentelle betingelser ført til en ny måde at se på LTP. Vi viste, at langvarig stigning i synaptisk styrke ikke kræver syntesen af ​​nye proteiner.

Her viser vi, at LTP induktion afhænger skiver levedygtighed og ophidselse. Når dissektion af hippocampus var for langsom eller for skadelige, skiver ophidselse steg og polysynaptiske responser kunne observeres efter LTP-induktion (figur 3B). I dette tilfælde var LTP induktion langt mindre effektiv og potensering ikke blev opretholdt.

Vi vil gerne understrege, at selv i skiver tilsyneladende raske, tekniske forhold har en stor indflydelse på varigheden af ​​LTP induceret af en enkelttog for stimulation. I tidligere publikationer, viste vores gruppe, at en kort-varig LTP kan blive omdannet til en langvarig én ved at ændre inddrivelse betingelser for skive 15.. Over års daglig praksis observerede vi, at successive forbedringer i vores teknik har ført til en gradvis stigning i varigheden af ​​LTP induceret af en enkelt tog i standardbetingelser. Faktisk optagelser foretaget i 2005 viste en kort-varig LTP gå tilbage til baseline inden 3 timer (figur 3C, udfyldte cirkler). Ændringer i dissektion procedure reducerer væv strække har gjort det muligt at opnå en LTP opretholdt i 6 timer 16 (figur 3C, udfyldte firkanter). Og endelig har forbedringer i grænsefladen iltning og temperaturkontrol, kombineret med elektrode standardisering førte til en LTP stabil i mere end 8 timer (figur 3C, åbne cirkler). Forskellen mellem de tre grupper er signifikant (en-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, p <0,001).

Endvidere må enhver ændring af temperatur eller iltning inducerede en stigning eller et fald i den synaptiske respons (Figur 4). Styringen af ​​disse parametre blev kontrolleret ved altid at benytte to stimulerende elektroder. LTP blev induceret på et bundt af Schaffer sikkerheder mens en anden bundt blev anvendt som en intern kontrol af synaptisk styrke stabilitet.

Figur 1
Figur 1. Elektrofysiologiske rig og hjerne skive optagelse kammer. (A) perfusionskredsløbet med hjemmebagt tyngdekraft perfusionssystem alimented af en peristaltisk pumpe, isolerede stimulation enheder (to pr elektrode), kirurgisk mikroskop og optagelse kammer. (B) Interface-optagelse kammer med at stimulere ogoptagelse elektroder. Filter papirer er blevet fjernet fra låget for at se ringen støtter skive. (C) Styreenhed med 2 stimulatorer, oscilloskop, A / D-konverter, temperatur kontrol software og WinLTP software.

Figur 2
Figur 2. Værktøj og materialer, der anvendes til hippocampus udskæring. (A) Dissektion skål indeholdende nedkølet ACSF og kirurgisk mikroskop. Skalpel monteres med en # 11 klinge, små standard dissekere saks, forår saks, buede pincet, to Heidemann spatulae, ske, 2 plastic Pasteurpipetter hvoraf den ene med en bred mund, petriskål, metallisk cylinder på 7 mm diameter og ring, der understøtter skive i optagelsen kammeret. (B) McIlwain vævshakker. (C) Tegning og fotografi of venstre hippocampus i stilling til skæring. Orienteringen af ​​barberblad er angivet ved den røde stiplede linie. Omfanget af trådkorset:. 1 mm Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Induktion af LTP i hippocampusskiver. (A) skitse, der viser de to uafhængige synaptiske indgange S1 og S2 til den samme neuronale population. I hver skive blev to stimulerende elektroder (S1 og S2) sættes på plads. S1 vej blev anvendt til at inducere LTP, mens S2 pathway fungerede som en kontrol. (B) Sample fEPSP spor fra individuelle eksperimenter i en perfekt sund skive (til venstre) og i en skive præsentere et højt niveau af ophidselse (højre). De blev optaget, lige bef malm LTP induktion (røde spor), og en time efter LTP induktion (blå spor). Når skiverne ikke helt raske (til højre), der polysynaptiske observeret respons og fEPSP hældning potensering reduceres. (C) Sammenligning af tidsforløb i fEPSP hældningen efter LTP induceret af en enkelt tog af højfrekvente stimulation (100 Hz, 1 sek) blev registreret i 2005, 2010 og 2011 i vores laboratorium. Første forsøg blev registreret i 2005 (udfyldte cirkler, n = 11). Efterfølgende optagelser (Villers, et al. 2010) nydt godt af en forbedret dissektion procedure (fyldte firkanter, n = 6). Aktuelle resultater skyldes optimering af grænsefladen iltning og temperaturstyring sammen med elektrode standardisering (åbne cirkler, n = 6). Klik her for at se større figur .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Figur 4.. Variation af fEPSP hældning som en funktion af temperatur og ilt flow. (A) Stigende ilt flow i vandbad under optagelsen kammeret 0,15-0,25 l / min (blå kurve) inducerer et fald i fEPSP hældning på 20% (lyserød kurve). (B) En forøgelse af temperaturen fra 28 til 29 ° C (grøn kurve) inducerer en mere end 50% stigning i fEPSP hældning (pink kurve). Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har udviklet i vores laboratorium en protokol som følge af kombinationen af metoder udviklet og brugt af andre laboratorier, der har en stor ekspertise i LTP optagelser 11,17. Denne protokol er tilpasset voksen mus hippocampus og kan anvendes i dyr af enhver alder og enhver baggrund genotype. Det giver også analyse af LTP i transgene mus udvikler neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom 18,19.

Udnyttelsen af ​​denne protokol for rotte hippocampusskiver kan nødvendiggøre visse tilpasninger. For eksempel bruger de fleste af de undersøgelser udført på rotter en temperatur på 32 ° C i stedet for 28 ° C. Mathis et al. 20. foreslået en anden metode til fremstilling af hippocampusskiver fra aldrende mus eller rotter.

Materiale og metoder

C57BL/6J-mus kommer fra janvier SAS (Frankrig), men samme resultater opnås med C57BL/6J-mus fra Charl es River Frankrig.

Hippocampus er hurtigt isoleret, mens vævet er nedsænket i koldt ACSF at reducere celleskader. Dette giver en reduktion i excitotoksicitet men vides at inducere synapse proliferation 21,22, som kan maskere yderligere strukturel synaptisk plasticitet.

Så bruger vi en vævshakker til udskæring i stedet for vibratome. En vævshakker er særlig velegnet til sektionering af små stykker væv som mus hippocampus. På vævshakker, er hippocampus altid orienteret på samme måde i overensstemmelse med fremgangsmåden i Alger et al. 23.. De anbragte riller Alvear overflade, synlig med skrå belysning, parallelt med barberblad. Denne metode giver hippocampus skiver af den dorsale del skæres med en vinkel på 15 ° fra den tværgående akse (se figur 2C). Efterfølgende skiver manipuleres med et minimum af direkte kontakt.

ove_content "> Skiver holdes i grænsefladen ved 28 ° C umiddelbart efter dissektion. Denne metode har vist sig at reducere polysynaptiske aktivitet og epileptogenicity i mus og rotter skiver 24.

Eksterne parametre kontrolleres omhyggeligt for at opnå reproducerbare resultater. Bipolar klynge stimulerende elektroder (FTC) anvendes i stedet for hjemmelavede elektroder for at øge reproducerbarhed i induktion, se, at amplituden af ​​LTP induktion virkelig afhænger af elektroderne kvalitet.

ETC-system fra University of Edinburgh 11 holder en konstant og ensartet temperatur i hele eksperimenterende rig og carbogen forbrug er stabiliseret med en flowmåler. Interfaceniveau styres visuelt ved hjælp af en kikkert kirurgisk mikroskop og vedligeholdes meget stabil med en peristaltisk pumpe udsugningssystem.

Resultater

Denne protokol alleOWS induktion af en meget stabil LTP som fortsat afhængig af eksterne forhold som temperatur og iltning. Vi har tidligere påvist, at LTP induceret i disse betingelser var afhængig af NMDA-receptorer, α-CaMKII autophosphorylering og PI3-kinase aktivering, som er de klassiske molekylære veje involveret i LTP 14.. Derimod kunne vi ikke reproducere afhængighed vedligeholdelsesfasen af ​​LTP på nyt proteinsyntese. Evnen af protein-syntese inhibitorer og af anisomycin navnlig at forhindre udviklingen af den sene fase af L-LTP, når de blev anvendt omkring induktionen er gentagne gange blevet rapporteret 4,25. Dette har ført til den gængse hypotese, at stabilisering synaptisk plasticitet i længere tid end ca 2-3 timer kræves udløsningen af LTP-induktive stimulus af en forbigående syntese af nye proteiner 26. Imidlertid har de seneste eksperimenter foreslået, at tingene var mere komplicerede 27 -32.. LTP induceret i vores eksperimentelle betingelser blev opretholdt, selv i tilstedeværelse af proteinsynteseinhibitorer tyder på, at andre mekanismer end nye proteiner syntese kan inddrages i den varige fase LTP.

Alligevel in vitro eksperimenter altid rejser spørgsmålet om den fysiologiske relevans af den observerede fænomen. Udskæring inducerer ændringer i phosphoryleringstilstanden af proteiner involveret i aktiviteten-afhængige former for synaptisk plasticitet 33 og ændring i den metaboliske tilstand af vævet 34.. Satsen for proteinsyntese er reduceret til 10 til 15% af den observerede in vivo 35 og balance mellem mRNA og proteiner forstyrres 36.. Af alle disse grunde, skal vi være forsigtige i tolkningen af ​​resultaterne.

Pr. definition LTP er en hastigt induceret langvarig (dage, uger) udbygning af en ekscitatorisk synapse, hvilket formentligspiller en vigtig rolle i langtidshukommelsen. LTP in vivo vare kan i flere uger og lignende ændringer i synaptisk styrke kan forekomme under indlæring 37,38. Desuden, det meste af tiden, er, når langsigtet LTP forhindret af mutationer, er langtidshukommelse forringet 39..

Mere problematisk er parallellen mellem korttidshukommelsen og kortvarige langsigtede potensering. Det første problem er, at varigheden af ​​hvert fænomen er ukendt. Korttidshukommelsen er blevet undersøgt 1 time til 1 dag efter at lære procedure hvorimod kortsigtet LTP formodes at vare mindre end 5 timer. Det andet spørgsmål er, om korttidshukommelsen (eller kortvarige LTP), er blot et skridt fremad langtidshukommelse (eller langvarig LTP), eller en separat enhed med særskilte molekylære mekanismer 40. For det tredje, ved vi ikke, om kortsigtet LTP er fremkaldt af en svag stimulus, der falder kort for at forårsage langvarig LTP eller hvis det er foranlediget af den samme stimulus, men enppears kun, når mekanismerne bag langvarig LTP mislykkes.

Den langvarige stabilitet LTP under vore eksperimentelle betingelser kan betragtes som en kortsigtet LTP svarende til korttidshukommelse varig mellem 10 timer og 24 timer. I denne form for synaptisk plasticitet, er proteinsyntese, som er stærkt reduceret i skiver, ikke nødvendigt og LTP kan være fremkaldt af en enkelt tog af stimulation. Denne langvarige stigning i synaptisk styrke kan skyldes en stabil stigning i antallet af AMPA-receptorer i den postsynaptiske membran uden rygsøjlen remodeling.

Ifølge denne hypotese kunne proteinsyntese være behov for rygsøjlen udvidelsen og strukturelle ændringer af synapser, der fører til langtidshukommelsen over flere uger. I dette tilfælde kunne det decremental fase af LTP kun observeret 24 timer efter induktion. Desværre indtil nu, kan akutte skiver kun opretholdes i live i løbet af cirka 16 timer.

et al. 41. har vist, at i disse mus er kortsigtet LTP in vivo og korttidshukommelsen forringes mens langsigtet synaptisk plasticitet og hukommelse bevares.

Uoverensstemmelser mellem de forskellige undersøgelser udført i forskellige laboratorier kan skyldes varigheden af kortvarige LTP grundet variation i den enzymatiske aktivitet i den metaboliske tilstand skiver eller i antallet af protein nedbrydning 42.. Proteinsyntese kunne betragtes som en eftergivende genopfyldning proces, der involverer repositionere af enzymer, der er blevet brugt af læringsprocessen, eller andre konstitutive celleelementer 43..

Disse resultater understreger vigtigheden af ​​eksperimentelle betingelser på LTP stabilitet. En stabil LTP uafhængig af proteinsyntese kunne bidrage til at undersøge den rolle, langvarig post-traducnelle modifikationer af synaptiske proteiner og mekanismerne bag stabil stigning i antallet af AMPA-receptorer i den postsynaptiske membran trods receptorer omsætning.

Denne video viser en detaljeret protokol, som bør forhåbentlig hjælpe til at opnå reproducerbare resultater i forskellige laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Bernard Foucart til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af den belgiske fond for videnskabelig forskning (FRS-FNRS) og af Dronning Elisabeth fond for Medical Research. Agnès Villers er Research Fellow på den belgiske fond for videnskabelig forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Neuroscience neurobiologi anatomi fysiologi Biomedical Engineering Surgery Memory Disorders indlæring hukommelse Neurosciences neurofysiologi hippocampus langsigtet potensering mus akutte skiver synaptisk plasticitet, Elektrofysiologi dyremodel
Forbedret forarbejdning og konservering af Hippocampale Mouse Skiver for en meget stabil og reproducerbar optagelse af langfristet Potensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter